Kloneerimisvektor

Molekulaarbioloogias mõistetakse kloneerimisvektori all ümberkorraldatud DNA molekuli, mille abil saab biotehnoloogilistel eesmärkidel transportida võõraid DNA lõike rakku. Kloneerimisvektorite abil saab uurida geenide funktsioone ja toota valke tööstuslikel eesmärkidel. Vektorit, mis sisaldab võõrast uuritavat DNA-d, nimetatakse rekombinantseks DNA-ks.

Joonis plasmiidsest vektorist pBluescript II KS

Viis tähtsaimat vektorit on plasmiidid, bakteriofaagid, kosmiidid, süstikvektorid ja kunstlikud kromosoomid, millest on enim kasutatud plasmiidid. Igal vektoril on kloneerimiseks vajalikud regioonid: multikloneerimisjärjestus, selektiivsusmarker, reportergeenid ja replikatsiooni alguspunktid.

Terminoloogia

Selektiivsusmarker

Selektiivsusmarker on kloneerimisvektoris olev geen (tavaliselt antibiootikumiresistentsust määrav geen), mis tagab peremeesraku kasvu kindlal söötmel. Kui näiteks vektoril on mõne penitsilliini resistentsusgeen, siis saab selle vektoriga rakk kasvada söötmel, millele on lisatud penitsilliini. Sellega tehakse kindlaks, et rakku on sisenenud õige vektor.

Reportergeenid

Tihti võib leida vektoritel reportergeene. Nende kaudu saab vektori olemasolu testida. Nende geenide katkestamine toob esile fenotüübilise muudatuse ja paljudel juhtudel sisestatakse uuritav DNA just reportergeeni sisse. Reportergeenis asub ka multikloneerimisjärjestus, mis lubab teha sinna lõikeid võõra DNA sisestamiseks.

Üheks reportergeeniks plasmiidses vektoris pBluescript II KS on lacZ geen, mille katkestamisel ei sünteesita enam β-galaktosidaasi. Kui söötmes on ühendit X-gal, siis katkestamata geeniga bakterikolooniad muutuvad siniseks ja katkestatud geeniga kolooniad valgeks. Selline värvil põhinev testsüsteem on sisenenud vektori kindlakstegemiseke tõhus viis.

Multikloneerimisjärjestus

Multikloneerimise asukoht on regioon vektoril, kuhu saab teha lõikeid uuritava geeni sisestamiseks. Tavaliselt on selleks regiooniks reportergeen, mille lõikamisel katkestatakse geeni funktsioon, mille järel on näha fenotüüpilisi muudatusi kolooniates. Lõigete tegemiseks kasutatakse restriktsiooniensüüme ja pärast vektori lahtilõikamist saab sisestada sinna uuritava geeni DNA ligeerimisega.

Replikatsiooni alguspunkt

Replikatsioon alguspunkt on selline piirkond vektoris, kust replikatsioon saab alata. Kloneerimisvektoris ei ole tavaliselt geene, mis tagaksid replikatsiooni. Selle eest vastutab bakteriraku kromosomaalne DNA, mis sünteesib vajalikke valke plasmiidi replikatsiooniks. See tagab uuritava geeni ekspressiooni vektoris.

Vektorid

Plasmiidid

Plasmiidid on kromosoomivälised, isereplitseeruvad DNA rõngasmolekulid bakteriraku sees, mis sisaldavad kasulikke geene peremeesrakule ja geene, mis lubavad sel säilida raku sees. Kui plasmiid aga bakterirakule kasulik ei ole, püüab bakter sellest loobuda ja selle tõttu on laborites kasvavad bakterid tavaliselt vähem elujõulised kui looduses elavad bakterid. Bakteriraku plasmiid ei ole automaatselt vektor. Selleks, et plasmiidist saaks vektor, tuleb seda laboritingimustes muuta. Plasmiidsete vektorite suurus võib varieeruda alates 1000 aluspaarist kuni 200 000 aluspaarini. Paljud plasmiidid sisaldavad antibiootikumiresistentsuse geene, mis on ideaalsed selektiivsusmarkerid.

Bakteriofaagid

Enamik viiruse vektoreid on sünteesitud lambda-nimelise bakteriofaagi kromosoomist. Viiruse genoomi saab lõigata lahti restriktsiooni ensüümidega ja seejärel in vitro sisestada sinna uuritav geen. Viirus siseneb seejärel rakku ja eraldab sinna oma vektori (viiruse genoomi, kuhu on sisse viidud uuritav geen), kust saab alata kloneerimine. Kloneerimise saaduse alusel saab teha edasisi uuringuid.

Kosmiidid

Kosmiidid on kunstlikult sünteesitud vektorid, millel on nii bakteriofaagi kui ka plasmiidi omadusi. Kosmiidid arendati välja suurte geenide (rohkem kui 150 000 aluspaari) kloneerimiseks, kuna plasmiidides ega viiruse vektorites nii suuri geene kloneerida ei saa. Kosmiididel on nii plasmiidide isereplitseerumise mehhanismid kui ka viiruse vektorite in vitro geeni sisestamise võimalusi.

Süstikvektorid

Kui plasmiidid, bakteriofaagid ja kosmiidid suudavad replitseeruda ainult bakterites, siis süstikvektorid on kunstlikult sünteesitud kloneermisvektorid, mis töötavad nii eükarüootsetes kui ka prokarüootsetes organismides. Süstikvekorid on väga kasulikud bakterite ja loomariigi vahelisteks geneetilisteks uuringuteks.

Kunstlikud kromosoomid

Uurtava DNA fragmendi sisestamine BAC vektorisse

Kunstlikud kromosoomid on välja töötatud samuti väga suurte DNA regioonide uurimiseks. YAC (yeast artificial chromosomes) vektorid suudavad kanda endas kuni poole miljoni aluspaari suuruseid DNA segmente. YAC-e on kasutatud ka Inimese Genoomi Projektis, kus oli vaja kaardistada suuri genoomisegmente.

BAC-id (Bacterial artificial chromosomes) on sarnaselt YAC-idele suure DNA hoidmise mahuga. Erinevus on selles, et eükarüootsete organismide asemel kasutatakse neid bakterites.

Vektori kloneerimine

Selleks, et kasutada kloneerimisvektoreid, tuleb eelnevalt läbida mitu protsessi. Iga protsess viiakse läbi in vitro tingimustes ning kasutatakse mitut lahust. Esmalt tuleb uuritav DNA fragment restriktsiooniensüümidega lahti lõigata ja seda fragmenti polümeraasi ahelreaktsiooni meetodil paljundada. Seejärel tuleb lahti lõigata ka vektor ja uuritav geen ning vektor omavahel kokku ligeerida. Valminud rekombinantne DNA viiakse sisse peremeesrakku, kus rakk saab paljuneda koos vektoriga. Viimase etapina eraldatakse vektor ja seda kasutatakse vastavalt vajadusele. Lihtsuse mõttes kirjeldatakse järgnevates alapunktides plasmiidse DNA kloneerimist.

DNA fragmendi lõikamine

Uuritava DNA fragmendi lahtilõikamine algsest genoomist toimub restriktaaside kaudu. Restriktaasid on valgud, mis looduslikult kaitsevad rakke võõra DNA eest, tehes spetsiifilisi katkeid võõrasse sissetungivasse DNA-sse. Sellised restriktaasid tagavad rakule kaitse. Tänapäeval kasutavad restriktsiooniensüüme geneetikud DNA fragmentide kloneerimiseks. Restriktaase on palju ja igaüks neist lõikab ainult ühte kindlat järjestust DNA lõigul. Kui uuritava DNA järjestus on teada, saab ka kindlaks teha kohad, kust DNA-d lõigata, et uuritav lõik eraldada algsest genoomist.

Polümeraasi ahelreaktsioon

Kui uuritav DNA lõik on eraldatud, siis tuleb seda paljundada, et sooritada katseid, mis vajavad rohkem kui ühte DNA fragmenti. Paljundamiseks kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni. See on laialdaselt kasutatav meetod DNA fragmentide paljundamiseks.

DNA ligeerimine

Selleks, et kloneerimisvektorisse uuritav DNA fragment sisestada, peab kõigepealt vektori restriktaasidega multikloneerimisjärjestuse alast lahti lõikama. Kui lahtilõigatud vektor ja uuritav DNA fragment kokku panna, peab need ligeerimisega kokku "kleepima". Selliseks kleepimiseks kasutatakse DNA ligaasi, mis liidab kokku fragmendi ja vektori.

Transformatsioon ja kompetentsed rakud

Protsess, mille käigus rakud võtavad endasse võõra geneetilise materjali, nimetatakse transformatsiooniks. Võõras DNA aga ei saa siseneda rakku ilma rakumembraanis toimuvate muutusteta. Selliseid meetodeid, kus rakumembraan muudetakse võõrale DNA-le vastuvõtlikuks, nimetatakse rakkude kompetentseteks muutmiseks. Laborites kasutatakse selleks tavaliselt rakkude töötlemist kahevalentsete katioonidega, näiteks Ca²⁺ (kaltsiumkloriid CaCl₂). Kaltsiumkloriid laeb rakumembraani pinna positiivselt, mis lubab negatiivselt laetud DNA-l seonduda membraanile. Temperatuuri tõstmisega muudetakse membraan elastseks ja seejärel saab vektor rakku siseneda.

DNA replikatsioon

Selleks, et saada suurel hulgal sünteesitud kloneerimisvektoreid, tuleb rekombinantse DNA-ga rakke paljundada. Kui vektor on sisenenud rakku, hakkab vektor replitseeruma koos rakuga. Kuna kloneerimisvektor on olemuse poolest DNA, siis saab see paljuneda tavalise replikatsioonimehhanismi alusel. Selleks kasutab vektor peremeesraku enda nukleotiide ja polümeraase. Replikatsiooni tulemusena saadakse suur kogus kloneerimisvektoreid, mis on järgneva uurimistöö toormaterjaliks.

Plasmiidse DNA eraldamine bakterirakkudest

Plasmiidse DNA eraldamiseks on vaja algselt suurt kogust rakke. Selleks kasvatatakse plasmiidse DNA-ga rakke söötmes, kus on sees vektori selektiivsusmarkerile vastav antibiootikum. Vedelsöötmel kasvanud rakkudest saab eraldada plasmiidse DNA mitmel meetodil, kuid peamine on aluselise lüüsi meetod. Selle käigus lüüsitakse (purustatakse) rakud ning DNA denatureerub (sulab lahti). Aluselise lüüsi metoodikas kasutatakse pH muutuste mõju DNA-le. Kromosomaalne DNA ei jõua piisavalt kiiresti renatureeruda (tagasi ühineda) ja alles jääb ainult plasmiidne DNA. Seejärel tsentrifuugitakse valgud ja kromosomaalne DNA põhja ning lahusesse jääb ainult plasmiidne DNA. Edasi saab neid vektoreid sisestada teistesse organismidesse ja jälgida, kuidas sünteesitud vektor neid mõjutab.

Plasmiidid

Plasmiidid on kromosoomivälised DNA molekulid, mis avastati Enterobacteriaceae sugukonda kuuluvatest bakteritest. Praeguseks on leitud neid peaaegu kõikidest uuritud bakteritaksonitest. Plasmiidid on enamasti kaksikahelalised DNA 

rõngasmolekulid, mis replitseeruvad bakteri genoomist 

sõltumatult. Nende suurus võib varieeruda mõnesajast kuni mõnesaja tuhande aluspaarini. Plasmiidid sisaldavad geene, mis on vajalikud nende talitlemiseks ja säilimiseks peremeesrakus. Mõnedel plasmiididel on geenid, mis tagavad plasmiidi stabiilse püsimise bakterirakus, näiteks toksiini-antitoksiini süsteemi kodeerivad geenid. Kuigi plasmiidid pole bakterite populatsiooni kasvuks ja bakteritele elutähtsateks funktsioonideks vajalikud, siis teatud juhtudel, näiteks ebasoodsate keskkonnatingimuste korral, võib plasmiidi olemasolu oluliselt soodustada bakteriraku ellujäämist. Soodsates keskkonnatingimustes võib bakterirakk plasmiidist vabaneda, ilma et sellele järgneks peremeesraku jaoks eluohtlikke tagajärgi. Plasmiidid kanduvad ühest bakterirakust teise peremeesraku pooldumise ajal ja horisontaalselt, peamiselt konjugatsiooni teel.

Bakter: 1. Kromosomaalne DNA, 2. Plasmiidid

Geneetiline struktuur

Klassikalise lähenemise kohaselt on plasmiidid modulaarse struktuuriga, mis tähendab seda, et üksteisega seotud funktsioonid on kodeeritud ja rühmitatud kindlatesse DNA lõikudesse. Iga moodul (DNA fragment) on plasmiidi genoomis sageli erineva fülogeneetilise päritoluga. Arvestatava osa plasmiidide struktuurist hõlmavad plasmiidi ellujäämise, levimise ja replikatsiooni jaoks vajalikud geenid. Neid nimetatakse plasmiidi selgrooks. Selgroo-geenid on plasmiidide süstematiseerimise aluseks. Plasmiidide klassifitseerimine põhineb geneetilistel tunnustel, mis on kõigis plasmiidides püsivalt esindatud. Need tagavad plasmiidide võime säilitada end peremeesrakus ja kontrollida replikatsiooniprotsessi.

Plasmiidide klassifitseerimise ajalugu

Plasmiidide klassifitseerimise vajadus tekkis 1950. aastate lõpus, kui avastati R-plasmiidid ehk resistentsust põhjustavad plasmiidid. Varasemate uuringute tähelepanu oli valdavalt suunatud F-plasmiididele ehk fertiilsust põhjustavatele plasmiididele ja nende osalusele geeniülekandes, ning samuti kolitsiine kodeerivatele (Col) plasmiididele. Multiresistentsust tagavad R-plasmiidid avastati tänu nende võimele kanda konjugatsiooni teel ühest bakterirakust teise mitme ravimi suhtes resistentsust kodeerivaid geene.

Esmane kriteerium, mida plasmiidide klassifitseerimisel kasutati, oli seotud konjugatiivse ülekandevõimega. Selgus, et R-plasmiidid kanduvad üle madala sagedusega, F-plasmiidid aga kõrge sagedusega. Samuti täheldati, et teatud juhtudel pärssis samas peremeesrakus olev R-plasmiid F-plasmiidi ülekannet. Selle tunnuse põhjal jaotas Watanabe plasmiide fi+ (fertiilsuse pärssimine) ja fi– plasmiidideks. Hiljem selgus, peamiselt tänu Meynelli ja Datta uurimistööle, et on olemas seos plasmiidi fi-oleku ja sugukiu (sex pili) tüübi vahel. Fi+ tüvedel olid sugukiud immunoloogiliselt ja struktuuri poolest sarnased F-plasmiide sisaldavate tüvede kiududega, samas kui fi-tüvede kiud sarnanesid ColI-plasmiide omavate bakteritüvede sugukiududega.

1960. aastatel, mil plasmiidide uurimine pälvis suuremat tähelepanu, avastati plasmiidid, mis olid mittekonjugatiivsed ega pärssinud konjugatiivset ülekannet. Seetõttu ei saanud neid fi-süsteemi järgi määrata. Lisaks avastati veel uusi sugukiudude tüüpe. Need avastused muutsid plasmiidide senise klassifitseerimise ebapiisavaks.

Plasmiidide mittesobivusgrupid ja määramine replikonide järgi

Mittesobivus (incompatibility) on eripära, mis on omane plasmiididele ning sobib nende klassifitseerimiseks. Plasmiidide mittesobivust kirjeldati esmakordselt F-plasmiidide näitel 1960. aastate alguses. Klassifitseerimise ametliku skeemi, mis põhineb plasmiidide mittesobivusel, töötasid 1970. aastate alguses välja Datta ja Hedges. Mittesobivus on kahe plasmiidi suutmatus samas rakuliinis stabiilselt säilida. Plasmiidid, mis on üksteise suhtes mittesobivad, paigutatakse samasse mittesobivusgruppi. Praeguseks on teada umbes 30 mittesobivusgruppi enterobakterite plasmiidide seas ja 7 stafülokokkide plasmiidide seas.

Mittesobivust testitakse plasmiidi sisestamisega tüvesse, mis kannab teist plasmiidi. Mõlemal plasmiidil peavad olema erinevad geneetilised markerid, et peremeesrakk saaks plasmiide eristada. Valik langetatakse siseneva plasmiidi järgi. Seejärel kontrollitakse, kas järgmises põlvkonnas on plasmiide, mida bakteris esialgselt leidus. Kui antud plasmiidi järglaskonnas ei ole, loetakse need kaks plasmiidi mittesobivaks (incompatible) ja määratakse samasse mittesobivusgruppi.

Eristatakse mitmeid erinevaid mittesobivusgruppe: IncP, IncW, IncN, IncT, IncY, IncF, IncB/O jne.

Kirjeldatud meetodika rakendamine on töö- ja ajamahukas ning sellega kaasnevad mitmed raskused, mis on tingitud näiteks arvukatest replikatsiooni kontrollmehhanismidest ning sobivate geenide puudumisest. Seetõttu töötati välja uus meetod plasmiidide identifitseerimiseks – määramine replikonide järgi (plasmid replicon typing). Selle meetodi aluseks on erinevate replikonide genotüübi äratundmine. Plasmiididele, mis kannavad enam kui ühte replikoni või sarnast, aga siiski kokkusobivat replikoni, annab plasmiidide määramine replikonide järgi kõige täpsemaid tulemusi. Replikoni järgi liigitamine on lihtsam kui mittesobivusgruppide testimine ja nõuab ühtlasi ka vähem aega. See on rakendatav paljude eri bakteriliikide puhul.

Konjugatsioon

Bakteritevaheline plasmiidide ülekanne toimub horisontaalselt konjugatsiooni teel. Konjugatsioon on protsess, kus rakkudevahelise kontakti teel doonorraku (rakk, mis loovutab plasmiidi) DNA kantakse üle retsipientrakku (rakk, mis võtab DNA vastu). Sõltuvalt konjugatiivsusest saab plasmiidid jagada kahte klassi. Plasmiide, mis kannavad tervet konjugatsiooniks vajalike geenide komplekti, nimetatakse konjugatiivseteks plasmiidideks, näiteks enterobakterist pärit IncW rühma kuuluv R-plasmiid R388. Teised plasmiidid sisaldavad vaid minimaalset geenide hulka, mis võimaldavad neil konjugatsiooni teel liikuda vaid konjugatiivsete plasmiidide abiga. Neid nimetatakse mittekonjugatiivseteks või mobiliseeritavateks plasmiidideks, näiteks IncQ1 rühma plasmiid RSF1010. Konjugatiivsed plasmiidid on tavaliselt väikese koopiaarvuga, samas kui mittekonjugatiivsed plasmiidid on kõrge koopiaarvuga. Konjugatiivsed plasmiidid kannavad konjugatsiooniprotsessi tagavaid geene, sealhulgas sugukiude kodeerivaid geene, mis on vajalikud rakkudevaheliste kontaktide loomiseks. Plasmiidid, mis kuuluvad samasse mittesobivusgruppi, omavad tavaliselt DNA homoloogiat ja nad kodeerivad sarnaseid sugukiude ja konjugatsioonisüsteeme. Konjugatsiooniprotsessis toimuvad sündmused:

1. DNA ülekande algus ülekande lähtekohast (oriT), kuhu ensüüm relaksaas teeb üheahelalise katke;
2. plasmiidi DNA ahelate lahtiharutamine;
3. ühe ahela ülekanne retsipientrakku;
4. üksikahelalisele DNA-le komplementaarse ahela süntees nii doonor- kui ka retsipientrakus;
5. plasmiidse DNA rõngasmolekuli moodustumine.

Plasmiidide funktsioonid

Plasmiidide olemasolu on rakkudele kasulik: paljud plasmiidide omadused aitavad rakul kindlates tingimustes ellu jääda. Need tunnused jagatakse nelja peamisse rühma:

1. resistentsus – kannavad resistentsust raskmetallide, antibiootikumide suhtes;
2. energeetiline metabolism – võimaldavad peremeesrakul lagundada saasteaineid;
3. patogeensus, sümbioos ja virulentsus – plasmiidid sisaldavad virulentsusgeene, mis tõstavad bakterite patogeensust ja põhjustavad haigusi, näiteks katku ja teetanust;
4. levik ja säilimine – viivad läbi sugukiudude sünteesi ja võimaldavad kemotaksise toimumist

Plasmiidide tüübid

Funktsioonide alusel jagatakse plasmiidid viide gruppi:

1. resistentsusplasmiidid – kannavad tavaliselt geene, mis kodeerivad antibiootikumide või mürkide suhtes resistentsust. R-plasmiidid on sageli konjugatiivsed ning võimelised levima bakterikoosluses horisontaalselt;
2. degradatiivsed plasmiidid – suured kataboolsed plasmiidid, mis kodeerivad erinevate orgaaniliste ainete, näiteks tolueen, naftaleen, fenool jt, lagundamiseks vajalikke ensüüme;
3. fertiilsusplasmiidid (F-plasmiidid) – sisaldavad tra-geene, mille kodeeritud produkte kasutatakse konjugatsiooniprotsessis ning geneetilise materjali ülekandmisel bakterite vahel;
4. col-plasmiidid – sisaldavad antibiootikume kodeerivaid geene. Neid antibiootikume nimetatakse kolitsiinideks. Kolitsiinid toimivad teistele bakteritele surmavalt;
5. virulentsusplasmiidid – nendel plasmiididel on võime muuta bakterid patogeenideks. Virulentsusplasmiidid osalevad haigusi põhjustavate geenide kandmises.

Antibiootikumiresistentsuse levik

Plasmiididel on antibiootikumiresistentsuse saavutamises keskne roll. Plasmiidid võivad resistentsusgeene koguda ja levitada. Antibiootikumide resistentsusmehhanismid bakterites on erinevad. Nendeks on sihtmärgi kaitsmine, märklaua asendamine, antibiootikumi mürgitustamine ja antibiootikumi rakusisese kuhjumise blokeerimine. Resistentsusmehhanismide läbiviimiseks vajalike geenide omandamine võib toimuda erineval viisil, näiteks transpositsiooni abil. Transpositsioon on protsess, kus kindel järjestus, mis pärineb kindlast replikonist, on sisestatud teise replikoni (plasmiid või kromosoom). Vastupidi klassikalisele rekombinatsioonile ei nõua transpositsioon geneetilist homoloogsust doonori ja retsipiendi vahel.

Transposoonid on geneetilised elemendid, mis on võimelised teistesse geneetilistesse struktuuridesse sisenema, kuid võivad transpositsiooni käigus nendest ka lahkuda. Sageli esinevad nad plasmiididel. Transposoonid võivad sisaldada resistentsusgeene pea kõigi antibiootikumide vastu: ampitsilliini (ja teiste penitsilliinide), tetratsükliini, klooramfenikooli, trimetoprimi, streptomütsiini, kanamütsiini, neomütsiini, gentamütsiini ja tobramütsiini vastu. Need "hüppavad geenid" suudavad ennast ümber paigutada ühest plasmiidist teise või plasmiidist kromosoomi. Transposoonid võivad olla kiire resistentsuse leviku põhjustajateks bakteriperekondade seas.

Kui gramnegatiivsed enterobakterid sisaldavad tavaliselt ühte tüüpi suurt plasmiidi mitme ravimi suhtes resistentsuse saavutamiseks, siis osa grampositiivseid baktereid, nagu stafülokokid, omandavad multiresistentsuse tänu mitmele eri tüüpi väiksemale plasmiidile. Resistentsusplasmiidid võivad sageli kanduda üle konjugatsiooni teel nii sama liigi eri tüvede kui ka erinevatesse taksonitesse kuuluvate bakterite vahel.

Transposoonmutagenees

Transposoonmutagenees on protsess, mille kaudu transponeeruv DNA element ehk transposoon siseneb juhuslikku kohta genoomis rikkudes geeni 

lugemisraami või häirides selle funktsiooni. Rikutud geenide pärandumisel järgmisele 

põlvkonnale tekivad mutatsioonid.

Transposoonide määratlemisel ei ole teadlaste seas täielikku üksmeelt ning esineb laiem definitsioon, mis hõlmab transponeeruvaid elemente kõikides organismides ja kitsam definitsioon, mis tõstab transposooni nimetuse kaudu esile ainult bakterites paiknevad Tn transposoonid.

Transponeeruvate elementide põhjustatud mutagenees esineb looduses kõikides organismides. Transposoonmutageneesist rääkides mõeldakse eelkõige bakterites toimuvat mutageneesi, mida põhjustavad Tn transposoonid.

Transposoonmutageneesi kasutatakse bakterigeneetikas laboratoorse meetodina. Transposoonmutageneesi abil on võimalik uurida mitmesuguseid rakulisi protsesse.

Transposoonmutageneesil on ka oma osa multiresistentsete bakteritüvede tekkimisel, mis on tänapäeval suureks probleemiks haiglates, kus levivad bakterid, mida ühegi antibiootikumiga ei ole võimalik hävitada.

Avastamine

Esimene, kes transposoonmutageneesi uuris, oli ameeriklane Barbara McClintock, kes 1940. aastate lõpus avastas transponeeruvad elemendid maisist maisiterade värvuse ja mustri geneetilisel analüüsil. Barbara McClintock lükkas transponeeruvate elementide ("hüppavate geenide") avastusega ümber tolleaegse uskumuse, et geenid on kromosoomis kindlalt paigas ega liigu sealt kuskile. Alles uute meetodite kasutuselevõtmisel 1960. ja 1970. aastatel saadi kinnitavaid tõendeid liikuvate DNA elementide esinemise kohta ka teistes organismides, kui avastati transposoonid viirustes ja bakterites. 1983. aastal pälvis Barbara McClintock Nobeli auhinna transponeeruvate elementide avastamise eest maisis.

Transposoonid

Liittransposoon

Transposoonid on liikuvad DNA elemendid, mis on võimelised ühe raku piires ümber paigutuma. Need võivad "hüpata" erinevate kromosoomi osade vahel, või ühest DNA molekulist teise. Transposoonidest rääkides mõeldakse eelkõige transponeeruvaid elemente bakterites (Tn transposoonid), eukarüootsetes organismides nimetatakse neid teisiti. Näiteks äädikakärbsel (Drosophila melanogaster) on transponeeruvad P elemendid, maisis Ac ja Ds elemendid. Mariner-tüüpi elemendid esinevad nematoodidel, seentel ja inimestel.

Transposoon Tn3. tnpA tähistab transposaasi geeni, bla on ampitsilliini resistentsuse geen. Nooled tähistavad pöördkordusjärjestusi (IR) transposooni otstes. Tn3 perekonda kuuluvad transposoonid ei sisalda IS elemente

Transposoon koosneb kahest põhiosast: transposooni otstest ning transponeerumiseks vajalike valke kodeerivatest geenidest. Transposooni otsad kujutavad endast pöördkordusjärjestusi (IR-inverted repeat). Tavaliselt sisaldavad transposoonid ka muid geene, näiteks antibiootikumide või raskmetallide resistentsusgeene ning kataboolseid geene. Komplekssetel transposoonidel on lisaks mõlemas otsas IS elemendid, mis muudavad nad liittransposoonideks, sest IS elemendid on samuti transponeeruvad. IS elemendid on väikseimad (700–2500 aluspaari) mobiilsed DNA elemendid ning nad kodeerivad ainult transpositsiooniks vajalikke valke. IS elemendid võivad olla transposoonis orienteeritud samasuunaliselt (näiteks IS1 Tn9-s) või vastassuunaliselt (näiteks IS50 Tn5-s).

Transponeerumise mehhanismid

Transpositsioon võib toimuda kahel viisil. Replikatiivsel transpositsioonil toimub transpositsiooni käigus transponeeruva elemendi replikatsioon, nii et lõpptulemusena jääb koopia transposoonist nii doonori kui ka retsipiendi molekuli, näiteks Tn3 tüüpi elementidel. Teiseks võimaluseks on "lõika ja kleebi" (cut and paste) printsiip, kus transposoon lõigatakse doonormolekulist välja.

Transposooni liikumist katalüüsib ensüüm nimega transposaas, mis lõikab transposooni välja, aitab sellel seostuda sihtmärk-DNA molekuliga ja teeb sihtmärkjärjestusse "kleepuvate otstega" katked, mis on vajalikud transposooni sisenemiseks. Kleepuvateks otsteks nimetatakse DNA ahela otstes olevaid lühikesi üksikahelalisi lõike. Kleepuvatest otstest allesjäävatele üksikahelalistele sihtmärk-DNA lõikudele sünteesib komplementaarsed ahelad DNA polümeraas ja DNA ahelate otsad ühendab ligaas. Selle tulemusena tekivad sihtmärkjärjestusse 2–14 aluspaari pikkused duplikatsioonid kummalegi poole inserteerunud transposooni.

Transposoonide "hüppamiseks" on vaja transposaasi, mis katalüüsib transposooni liikumist ühest molekulist teise, ja transposooni otsmisi järjestusi, millele seondub transposaas, et "hüppamist" läbi viia. Transposaasi geen ei pea olema transposooni enda koosseisus, vaid võib eraldi esineda plasmiidis või kromosoomis ja ikkagi transposooni liikuma panna.

Transposoonide sisenemine on enamasti juhuslik, sest transposoonid ei vaja "hüppamiseks" homoloogiat transposooni ja sihtmärkjärjestuse vahel erinevalt homoloogilisest rekombinatsioonist. Transposoonide sisenemisega sihtmärk-DNA-sse võib kaasneda geenide lugemisraamide või regulatoorsete piirkondade juhuslik "ära rikkumine". Transposoonide transponeerumine võib põhjustada ka suuremaid geneetilisi ümberkorraldusi, mille tulemuseks on transposoonile külgnevate DNA lõikude ümberpöördumine (inverteerumine) või väljalangemine (deleteerumine). Kui kaks rekombineeruvat transposooni on kromosoomis vastupidises orientatsioonis, siis toimub nende vahele jääva segmendi inversioon, kui samasuunaliselt, segment deleteerub. Transposoonid võivad põhjustada ka kromosoomidevahelisi ümberkorraldusi (nii homoloogiliste kui ka mittehomoloogiliste kromosoomide puhul). Sel juhul tekib tütarkromatiidide vahelise ristsiirde tulemusena kaks produkti: kromosoom, milles transposoonidevaheline ala on kahekordistunud ja kromosoom, millest see on kaotsi läinud. Mõnede transposoonide otstes on otsast väljapoole suunatud promootorjärjestused, mis võivad aktiveerida transposooniga külgnevate geenide transkriptsiooni.

Mobiilsete elementide (transposoonide ja IS elementide) transponeerumine toimub bakterirakus tavaliselt väga madala sagedusega. Vastasel korral suureneks rakkudes transpositsiooniga kaasnevate geneetiliste ümberkorralduste sagedus, mille tulemusena võivad välja lülituda rakule eluliselt tähtsad geenid. Näiteks, kodeerib Tn5 repressorvalku, mis pärsib Tn5 transpositsiooni toimumist. Repressori translatsioon algab transposaasi geeni seest ja seetõttu puudub tal täispika transposaasi N-terminaalne järjestus, mis ilmselt on transpositsiooni toimumiseks vajalik järjestus.

Kasulik või kahjulik?

Transposoonid on mutageenid, mis tagavad organismide geneetilise mitmekesisuse. Tekkinud mutatsioonid võivad olla bakterile kasulikud, andes neile eelise muteerumata bakterite ees ja sellega soodustades muteerunud bakterite levikut. See tähendab, et osadel ümberkorraldustel on organismile positiivne valikuväärtus ja sel juhul jääb mutatsioon genoomis püsima. Enamik mutatsioone, mis transposoonide sisenemine genoomi põhjustab, on siiski bakterile kahjulikud. Seega on transposoonid kui parasiidid, mis paljunevad organismis raku sisemiste ressursside arvelt ja kutsuvad genoomis esile enamasti kahjulikke muutusi.

Transposoonmutageneesi läbiviimine bakteris

Minitransposoon

Minitransposoon mini-Tn5Cm. Cm^r tähistab klooramfenikooli resistensuse geeni. Nooltega on tähistatud pöördkordusjärjestused (IR) minitransposooni otstes

Minitransposoonid on biotehnoloogiliselt konstrueeritud hõlbustamaks transposoonmutageneesi laboratoorseks läbiviimiseks. Minitransposoonid sisaldavad ainult transpositsiooni jaoks vajalikke otsmisi pöördkordusjärjestusi ja antibiootikumi resistentsusgeeni. Minitransposooni puhul on oluline, et selle koosseisus ei oleks transposaasi kodeerivat geeni. Transposaasi geeni puudumine muudab minitransposooni sisestamise stabiilseks, sest ilma transposaasita ei ole transposoon võimeline edasi "hüppama".

Minitransposoon on näiteks mini-Tn5, mis on konstrueeritud nii, et see sisaldab transpositsiooni jaoks vajalikke 19 aluspaari pikkusi Tn5 otsmisi pöördkordusjärjestusi. Nende vahele on konstrueeritud erinevaid resistentsusgeene, näiteks kanamütsiini, klooramfenikooli, 

tetratsükliini, streptomütsiini resistentsusi kodeerivaid geene. Erinevad resistentsusgeenid võimaldavad kasutada mini-Tn5 transposooni transposoonmutageneesiks mitmesugustes organismides.

Plasmiidse vektori valik

Bakter. 1 – kromosomaalne DNA 2 – plasmiidid

Plasmiid on rõngakujuline kaheahelaline DNA molekul, mis sisaldab autonoomset paljunemist võimaldavaid geneetilisi elemente (eelkõige replikatsiooni alguskohta e originit). Plasmiidi replikatsioon toimub peremeesraku ensüümsüsteemi abil. Vektori all mõistetakse DNA "kandurmolekuli", mille koosseisu saab sisestada uuritava DNA järjestusi ja mille abil saab uuritavat DNA-d paljundada peremeesorganismis. Lisaks originile sisaldavad plasmiidsed vektorid selektiivset markerit (näiteks ampitsilliini resistentsust tagavat geeni) ja unikaalseid restriktaaside lõikamiskohti, mis esinevad plasmiidis ainult üks kord.

Transposoonmutageneesi läbiviimiseks mingis bakteritüves on kõigepealt vajalik transposoon bakterirakkudesse sisestada. Selleks kasutatakse erinevaid plasmiidseid vektoreid, millesse on kloneeritud minitransposoon, näiteks pUTmini-Tn5. Oluline on, et minitransposooni kandev plasmiidne vektor ei replitseeruks bakteritüves, kus transposoonmutageneesi läbi viiakse. See omadus on vajalik selleks, et minitransposooni kandev plasmiid võimaldaks ainult minitransposooni ülekannet bakterirakkudesse, kuid ei jääks uuritavasse tüvesse püsima. Seetõttu kasutatakse minitransposooni kandvate plasmiididena "suitsiidplasmiide". "Suitsiidplasmiidid" on saanud oma nime selle järgi, et need suudavad replitseeruda vaid kindlalt selleks konstrueeritud bakteritüvedes. Nende viimisel teistesse tüvedesse ei ole "suitsiidplasmiidid" võimelised replitseeruma ning need elimineeruvad.

Kolmikristamine

Kolmikristamise käigus toimub minitransposooni kandva plasmiidi konjugatsioon doonortüvelt retsipienttüvesse, mida vahendab abistajatüvi.

Minitransposooni kandev plasmiid sisestatakse bakteritüvesse, kus soovitakse transposoonmutageneesi läbi viia, konjugatsiooni teel. Konjugatsiooniks nimetatakse bakteri DNA vahetut ülekannet doonortüvest retsipienttüvesse (vastuvõtjatüvesse), mis eeldab rakkudevahelist kontakti. Minitransposooni kandev plasmiid asub bakteritüves, mis on konjugatsiooni protsessis doonortüveks. Samasse plasmiidi on sisestatud transponeerumiseks vajalik transposaasi kodeeriv geen. Doonortüve kromosoomi on viidud geen, mis kodeerib plasmiidi replikatsiooniks vajalikku valku. Kuna see tüvi ei ole ise võimeline konjugatsioonil plasmiidi teise organismi üle kandma, kasutatakse lisaks veel nn helper- ehk abistajatüve, mis sisaldab minitransposooni konjugatsiooniks vajalikke valke kodeerivat plasmiidi. Retsipienttüved, kus transposoonmutageneesi teostada, võivad kuuluda paljude bakteriliikide hulka, näiteks Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Erwinia carotovora. Minitransposooni kandva doonortüve, helpertüve ja retsipienttüve rakud kasvatatakse eksponentsiaalsesse kasvufaasi ning segatakse kokku mitteselektiivsele tardsöötmele ristumisplärakaks. Eksponentsiaalne kasvufaas on ajavahemik, kus uusi baktereid tekib ajaühikus proportsionaalselt olemasolevate bakterite hulgaga.

Transposoonmutantide selektsioon

Pärast konjugatsiooni toimumist plaaditakse kolme bakteri segu minimaalselektiivsöötmele, mille tingimused võimaldavad vaid transposoonmutandi kasvu. Minitransposooni kandvat plasmiidi sisaldava doonottüve ja helperplasmiidi sisaldava abistajatüve rakud ei ole võimelised kasvama minimaalsöötmel, mis ei sisalda ühtegi aminohapet, sest need on auksotroofsed proliini suhtes. Seega jäävad selektiivsöötmel ellu ja moodustavad kolooniaid vaid need retsipienttüve rakud, mille genoomi on juhuslikult lülitunud minitransposoon. Selektsiooniks kasutatakse antibiootikumi, mille resistentsusgeeni kannab konkreetne minitransposoon. Minitransposooni kandev doonorplasmiid elimineerub ja kuna transponeerumiseks vajalikku transposaasi ei kodeerita minitransposooni poolt, vaid plasmiidilt, siis ei saa minitransposoon hiljem enam esmasest sisenemiskohast edasi "hüpata".

Transposooni sisenemiskoha tuvastamine

Minitransposooni sisenemiskoha identifitseerimiseks genoomis kasutatakse mitut meetodit.

Kloneerimisvõte

Üks klassikalistest metoodikatest on transposoonmutandist kromosomaalse DNA eraldamine ja sellest minitransposooni sisaldava DNA lõigu kloneerimine koos seda ümbritseva DNA-ga. Kloneerimist hõlbustab minitransposooni koosseisus olev antibiootikumi resistentsusgeen, mis võimaldab antibiootikumi selektsiooni abil antud DNA regiooni sisaldavat plasmiidi teistest eraldada. Pärast kloneerimist määratakse sekveneerimisega minitransposooni sisenemiskoha DNA järjestus ja võrreldakse seda DNA andmebaasis olevate järjestustega selleks, et teada saada, millisesse geeni või regulatoorsesse piirkonda minitransposoon on inserteerunud.

ARB-PCR

Teine, enamkasutatud meetod minitransposooni sisenemiskoha kindlakstegemiseks on ARB-PCR. Selleks kasutatakse praimerite komplekti, millest üks praimer on disainitud komplementaarsena minitransposooni otsale, teine praimer, nn kõdupraimer, sisaldab oma järjestuses juhuslikke nukleotiide ja vaid 4–6-nukleotiidseid järjestusi – ankurjärjestusi, mis korduvad uuritava organismi genoomis sageli. Ankurjärjestuse abil seondub praimer erinevatesse genoomi regioonidesse ja juhul kui selle praimeri seondumine on piisavalt lähedal minitransposooni otsale, sünteesitakse PCR produkt minitransposooni otsa spetsiifilise praimeri ja kõdupraimeri abil. Seejärel määratakse saadud PCR produkti järjestus sekveneerimisega ja saadakse teada minitransposooni sisenemiskoht genoomis.

Kasutusalad

Transposoonmutageneesi kasutatakse bakterigeneetikas laboratoorse meetodina mutantsete bakteritüvede saamiseks. Transposooni sisenemise abil genoomi saab välja lülitada juhuslikke geene ning jälgida, kas ja kuidas bakter sellise olukorraga toime tuleb, või avastada geene, mille rikkumine mõjutab oluliselt mutatsioonisagedust. Üldjuhul on transposoonmutageneesi läbiviimise eesmärgiks uurida teatud geeni või valgu funktsiooni.

Transposoonmutagenees on alternatiivne meetod insertsioonilisele mutageneesile onkogeenide identifitseerimiseks selgroogsetes loomades. Sel juhul konstrueeritakse selline transposoon, mis häirib geeni funktsiooni maksimaalselt (näiteks Sleeping Beauty). Täpsemalt sisaldab taoline transposoon signaale, et katkestada rikutud geeni ekspressioon sisenemiskoha lähedalt ja seejärel taaskäivitada teise katkestatud geeni ekspressioon.

Multiresistentsed bakteritüved

Antibiootikumide kasutuselevõtmisest alates on bakterid arendanud omale kaitsemehhanisme, mis võimaldaksid neil antibiootikume sisaldavas keskkonnas toime tulla. Tänapäeval on meditsiinis suur probleem patogeensete bakteritega, mis on endale hankinud erinevaid resistentsusgeene, olles sel viisil resistentsed mitmele antibiootikumile korraga st multiresistentsed. Multiresistentsed patogeensed bakterid põhjustavad haiglates, kus kasutatakse palju antibiootikume, raskeid epideemiaid, mille kontrolli alla saamine on järjest raskem.

Enamus transposoone kannavad antibiootikumide resistentsusgeene. Seega soodustab transposoonide "hüppamine" ühest DNA molekulist teise (plasmiidist kromosoomi ja vastupidi) resistentsuse kiiret levikut bakteripopulatsioonis.

Multiresistentsus levib näiteks R-plasmiidide (R-resistance) abil. R-plasmiidid on kahekomponendilised, koosnedes ülekandefaktorist RTF (resistance transfer factor), mis annab plasmiidile võime konjugatsiooni teel üle kanduda, ja R-determinandist, mis sisaldab resistentsusgeene. Enamasti paiknevad resistentsusgeenid transposoonides, mis on läinud R-plasmiidi koosseisu. Kuna R-plasmiidid pole liigispetsiifilised, võivad nad üle kanduda eri liiki bakteritele. See on peamine multiresistentsete bakterite kiire leviku põhjus.

Horisontaalne geeniülekanne

Horisontaalne geeniülekanne ehk horisontaalne geenisiire on geneetilise informatsiooni kandumine ühest organismist teise muul viisil kui traditsioonilise paljunemise kaudu. Nimetatakse ka lateraalseks geeniülekandeks, vastandudes vertikaalsele, kus geenide ülekandmine toimub vanempõlvkonnalt järglastele seksuaalse või aseksuaalse sigimise kaudu. On näidatud, et horisontaalne geeniülekanne on oluline paljude organismide evolutsioonis.

"Elu puu", ilmestamaks horisontaalset ja vertikaalset geeniülekannet

Horisontaalne geeniülekanne on peamiseks bakterite 

antibiootikumiresistentsuse põhjuseks ja mängib olulist rolli nende võimes lagundada uusi ühendeid, näiteks inimese loodud keemilisi taimekaitsevahendeid.

Horisontaalses geeniülekandes osalevad tihti mõõdukad bakteriofaagid ja plasmiidid. 

Geenid, mis vastutavad antibiootikumiresistentsuse eest ühes bakteriliigis, kanduvad üle teistele liikidele läbi erinevate mehhanismide (näiteks F-pilide kaudu). See on muutumas laialdaseks probleemiks meditsiinis ning üheks oluliseks põhjuseks, miks patsiendid ei tohiks antibiootikume manustada ilma arsti vastava retseptita.

Viimastel aastatel on kindlaks tehtud, et bakterite vahel toimub horisontaalne geeniülekanne palju sagedamini kui varem arvati. Seetõttu on geneetikud hakanud vertikaalse ülekande kõrvalt sellele ka järjest enam tähelepanu pöörama.

Kunstlik horisontaalne geeniülekanne on põhiliseks tööriistaks geenitehnoloogias.

Ajalugu

1951. aastal täheldati horisontaalset geeniülekannet esmakordselt. Artiklis kirjeldati kuidas virulentsusgeeni ülekandumise tagajärjel muutus avirulentne Corynebacterium diphtheriae tüvi virulentseks. Sellega lahendati ka difteeria mõistatus (bakteriga nakatunud patsientidel ei pidanud esialgu haiguslikke sümptomeid esinema, need võisid aga hiljem tekkida). See fenomen oli ühtlasi esimeseks näiteks lüsogeense tsükli olulisusest.

1959. aastal kirjeldati esimesena bakteritesisest geeniülekannet. Väljaandes demonstreeriti antibiootikumiresistentsuse edastamist ühelt bakteriliigilt teisele. 1980. aastate keskel ennustas Syvanen, et on olemas lateraalne geeniülekanne, millel on bioloogiline tähtsus ning mis on osalenud evolutsioonilise ajaloo kujundamises Maal alates elu tekke algusest.

1999. aastal märkisid Jain, Rivera ja Lake: "Geenide ja genoomide uuringud näitavad, et prokarüootide vahel on toimunud märkimisväärselt palju horisontaalseid geeniülekandeid ning sel protsessil on tähtsus ka üherakuliste eukarüootide hulgas ja protistide evolutsioonis."

Levimus ja olulisus hulkraksete eukarüootide seas on tänapäeval veel ebaselge.

Järjest kasvava tõendusmaterjali valguses, mis vihjab selle fenomeni evolutsioonilisele olulisusele, on molekulaarbioloogid horisontaalset geeniülekannet kirjeldanud ka kui "uut paradigmat bioloogias".

On kardetud, et see protsess kujutab endast varjatud ohtu, kuna võimaldab transgeense DNA levimist liikide vahel.

Mehhanismid

Horisontaalne geeniülekanne võib toimuda mitme erineva mehhanismi kaudu:

• Transformatsioon, geneetilise info sisenemine väliskeskkonnast bakterisse läbi rakumembraani. Seda protsessi kasutatakse tihti geenitehnoloogias, et sisestada bakteritesse uusi geene, mis võimaldaksid neid kasutada tööstuslikel või meditsiinilistel eesmärkidel.
• Transduktsioon, geneetilise info kandumine ühelt bakterirakult teisele viiruste (bakteriofaagide või faagide) vahendusel.
• Konjugatsioon, geneetilise info kandumine ühelt bakterilt teisele otsese rakk-rakk kontakti läbi.
• Geene kandvad vahendajad, raku poolt kodeeritud viirusesarnased elemendid, mida on leitud alfaproteobakterite hulka kuuluva Rhodobacterales seltsi esindajatelt.

Viirused

Viirus nimega Sputnik nakatab amööbe, kuid ei suuda paljuneda, kui Mimiviirus pole eelnevalt sama rakku nakatanud. Kuigi Sputniku 13. geenil on vähe ühist ühegi teise teadaoleva geeniga, on kolm neist lähedalt suguluses Mimi- ja Mamaviiruse geenidega. See võimaldab oletada, et satelliitviirus saab teostada horisontaalset ülekannet viiruste vahel analoogselt bakteriofaagidele, mis vahendavad geneetilist informatsiooni bakterite vahel.

Prokarüoodid

Horisontaalne geeniülekanne on bakterite hulgas väga levinud, seda ka evolutsiooniliselt kaugete liikide vahel. Arvatakse, et see protsess on oluliseks põhjuseks kasvavale ravimiresistentsusele. Üks bakterirakk, omandades resistentsuse, kannab vastavad geenid kiiresti üle teistele liikidele. See protsess mängib rolli ka virulentsusfaktorite, eksotoksiinide ja -ensüümide levikus. On välja pakutud strateegiaid, võitlemaks kindlate bakteriaalsete infektsioonide vastu, mille sihtmärgiks oleksid spetsiifilised virulentsusfaktorid ja mobiilsed geneetilised elemendid.

Eukarüoodid

"Järjestuste võrdlemine viitab paljude geenide hiljutisele horisontaalsele ülekandele eri liikide vahel, hõlmates ka fülogeneetiliste domeenide vahelisi ülekandeid. Mis tähendab, et liikide fülogeneetilist ajalugu ei saa lõplikult määrata ainult üksikute geenide evolutsioonipuu järgi."

• DNA järjestuste analüüs vihjab, et horisontaalne geeniülekanne on toimunud eukarüootides ka kloroplastide ja mitokondrite genoomidest tuumagenoomi. Endosümbioositeooria väidab, et kloroplastid ja mitokondrid pärinevad rakkudest, kes on eukarüootide poolt fagotsüteeritud ja jäänud sinna endosümbiontideks.
• Hästi on dokumenteeritud horisontaalset geeniülekannet bakteritelt seentele, eriti pagaripärmile.
• Arizona Ülikooli teadlased on leidnud, et herne-lehetäi (Acyrthosiphon pisum) genoom sisaldab mitmeid geene, mis on ülekandunud seentelt. Taimed, seened ja mikroorganismid suudavad sünteesida karotenoide, aga toruleeni sünteesivad herne-lehetäid on teadaolevalt ainukesed omataolised loomariigis.
• Hiljuti hüpotiseeriti, et malaariat põhjustav patogeen Plasmodium vivax on horisontaalse ülekande abil omandanud geneetilist informatsiooni inimestelt, mis võib kaasa aidata tema pikaajalisele vastupidavusele inimkehas.
• 2012. aastal kirjeldati uut võimalikku horisontaalse geeniülekande mehhanismi, mida vahendas bakteriofaag ja mis toimus prokarüootide ja eukarüootide vahel.
• Hypothenemus hampei genoomis on geen HhMAN1, mis sarnaneb bakteriaalsete geenidega. Arvatakse, et see on pärit bakteritelt mardika seedekulglast.

Kunstlik horisontaalne geeniülekanne

Insenergeneetika on põhimõtteliselt geenide ülekandmine horisontaalselt, kuigi selleks kasutatakse kunstlikke ekspressioonikassette. "Uinuva kaunitari" transposoonsüsteem arendati välja sünteetiliseks geene ülekandvaks vahendajaks, mis baseerus teadaoleval Tc1/meremees-transposoonide võimes sisse tungida väga erinevate liikide genoomidesse. Seda süsteemi on kasutatud geenijärjestuste sisendamiseks mitmete loomade genoomidesse.

Tähtsus evolutsioonis

Fülogeneetiline elu puu 16s rRNA subühiku analüüsi alusel

Horisontaalne geeniülekanne on võimalikuks segavaks faktoriks fülogeneesipuude konstrueerimisel ühe geeni järjestuse järgi. Näiteks kui kaks omavahel kaugelt suguluses olevat bakterit vahetavad geeni, siis neid liike sisaldaval puul märgitakse nad lähedasteks sugulasteks, kuna võrdluse aluseks olev geen on identne. Seda isegi siis, kui ülejäänud geenid on erinevad. Seetõttu on tihti parem kasutada teistsugust informatsiooni fülogeneesipuudelt järelduste tegemiseks, nagu geenide olemasolu või puudumise hindamine ja kaasata fülogeneetilisse analüüsi võimalikult lai valik geene.

Levinuim geen, mille põhjal koostatakse prokarüootide fülogeneetilisi suhteid, on 16S rRNA geen. Selle järjestused on küllalt konserveerunud lähedaste sugulaste määramiseks, kuid samas piisavalt muutuvad, et erinevusi mõõta. Viimastel aastatel on arutletud, et ka need geenid võivad horisontaalselt üle kanduda. Ehkki see võib toimuda harva, tuleks siiski 16S rRNA põhjal konstrueeritud fülogeneesipuid uuesti hinnata.

Bioloog Johann Peter Gogarten soovitab, et hiljutiste genoomianalüüside valguses tuleks traditsiooniline "puu" asendada "mosaiigiga", mis kirjeldaks erineva ajalooga geenide kombinatsiooni genoomides. Ning "võrk" oleks sobiv metafoor visualiseerimaks tihedat geeniülekannet mikroobide vahel.

Kasutades üksikuid geene fülogeneetiliste markeritena, on horisontaalse geeniülekande tõttu raske jälgida organismi fülogeneesi.

Geenid

Leidub tõendeid, et ajalooliselt on toimunud horisontaalset ülekannet järgmiste geenide puhul:

• Lükopeeni tsüklaas, mis on vajalik karotenoidide biosünteesiks, rohelise väävlibakteri ja tsüanobakteri vahel.
• TetO geen, mis annab resistentsuse tetratsükliinile, Campylobacter jejuni vahel.

Williamsi sündroom

Williamsi sündroom ehk Williamsi-Beureni sündroom (lühend WBS) on inimestel kaasasündinud haruldane sündroom. Williamsi sündroomi põhjustab umbes 26 geeni pikkune mikrodeletsioon 7. kromosoomi pikas õlas. Williamsi-Beureni sündroomi identifitseeris J. C. P. Williams aastal 1961 Uus-Meremaal ja selle esinemissagedus on 1:7500 kuni 1:20000 sünni kohta.

Williamsi sündroom
Klassifikatsioon ja välisallikad
RHK-10	QQ.93.8
RHK-9	758.9
OMIM	194050
MedlinePlus	001116
eMedicine	ped/2439
MeSH	D018980

Williamsi sündroomiga haigetele on iseloomulikud "haldjalikud" näojooned koos madala ninajuurega, ebaharilikult rõõmsameelne käitumine ja sundimatu suhtlemine võõrastega, arenguline mahajäämus koos hästi arenenud keeleoskusega ning kardiovaskulaarsed häired, näiteks aordiklapi stenoos ja hüperkaltseemia.

Sümptomid

Williamsi sündroomiga inimestel avalduvad sümptomid võivad ulatuda kergetest väga raskete vormideni, näiteks:

• kaasasündinud südamehaigused
• näoluustiku anomaaliad nagu hüpertelorism ja mikrognaatia ehk pisilõugsus
• närvisüsteemi töö häired
• õpiraskused
• psüühikahäired
• vaegkuulmine (conductive jasensorineuraalne vaegkuulmine)
• kaltsiumipuudus – hüpoparatüroidismi tõttu krampidega ja ilma
• kaltsiumiliigsus
• kasvupeetus hüpoparatüroidismi jms tõttu
• autoimmuunhaigused
• immuunpuudulikkus
• neeru anomaaliad
• seedekulgla häired
• laryngotracheoesophageal anomaaliad – raskused söömisel, neelamisel ja rääkimisel
• luustiku anomaaliad

Poor little birdie teased, viktoriaanliku ajastu illustraatori Richard Doyle'i kujutatud haldjas näojoontega, mida seostatakse Williamsi sündroomiga

Kõige sagedasemad sümptomid on vaimne alaareng, südamerikked ja ebatavalised näojooned. Teised sümptomid hõlmavad kasvupeetust lapseeas ja madalat lihastoonust. Enamikul Williamsi sündroomiga patsientidel on kõrgelt arenenud verbaalsed võimed ning nad on väga suhtlusaltid, omades nii-öelda kokteilipeo tüüpi iseloomu, mida iseloomustab märkimisväärne hulk kognitiivseid tugevusi ja nõrkusi. Suheldes keskenduvad sügavalt teiste inimeste silmadele. Patsientidel on tihti laiad hambavahed, pikk vagu ülahuule kohal ja lamenenud ninajuur. Samuti esineb neil palju südame- ja veresoonkonna haigusi, millest sagedamini südamekahinaid, suuremate veresoonte ahenemist ning aordiklapi stenoosi. Esineda võivad veel häired seede- ja erituselundkonna toimises nagu ägedad või kauakestvad koolikud (gaasivalud), alakõhuvalud ja divertikuliit (soole väljasopistuste ehk divertiikulite põletik), enurees (voodimärgamine) ja urineerimishäired, maloklusioon (hambumushäire) ja nõrk hambaemail, samuti hormonaalsed probleemid, millest sagedamini esineb hüperkaltseemia (kõrgenenud kaltsiumi tase veres). Lastel on kirjeldatud hüpotüreoosi (kilpnäärme alatalitlust), kuid selle esinemist täiskasvanutel pole tõestatud. Diabeeti on kirjeldatud täiskasvanutel juba 21-aastaselt.

Williamsi sündroomi põdevatel lastel ja täiskasvanutel võivad kaasuda aktiivsus- ja tähelepanuhäire sümptomid.

Williamsi sündroomiga patsiendid kannatavad tihti hüperakuusi (ülitundlikkus helide suhtes) ja fonofoobia (hirm valjude helide ees) all, mis sarnaneb müra indutseeritud kuulmislangusega, kuid võib olla põhjustatud kuulmisnärvi talitlushäirest. 

Siiski võivad nad demonstreerida suurt kiindumust muusikasse ja omada väga head muusikalist kuulmist ning helitunnetust. Samuti näib esinevat tihedamini vasakukäelisust ja vasaku silma domineerimist. Williamsi sündroomiga patsientidel on täheldatud ka suurenenud ärevust ning foobiate teket, mis võib olla seotud hüperakuusiga.

Kirjeldatud on ka probleeme visuaalse protsessinguga, kuid see tuleneb pigem raskustest toime tulla esemete asukoha määramisega ruumis kui probleemidest esemete sügavuse tajumisega.

Grupi Williamsi sündroomi põdevate lastega tehtud eksperiment näitas, et erinevalt tervetest lastest puuduvad neil märgid rassiliste eelarvamuste omamisest.

Tähelepanuväärne Williamsi sündroomi puhul on see, et tänu haigusele esinevad topeltseosed verbaalse ja kujundliku mõtlemise vahel. Patsiendid võivad olla kõrgelt arenenud verbaalsete võimetega. Kui Williamsi sündroomiga lastel paluda nimetada rida loomi, siis võivad nad loetleda väga laia valiku olendeid, nagu koaala, mõõkhambuline tiiger, kotkad, ükssarvik, merilõvi, jakk, kaljukits ja "Brontosaurus rex".

Mõned kultuuriajaloolased usuvad, et omadussõna "haldjalik" võeti kasutusele, et kirjeldada Williamsi sündroomiga inimeste näojooni, sest enne seda, kui mõisteti WBS-i teaduslikke põhjuseid, uskusid inimesed, et vastava haiguse all kannatajad, kes võrreldes teiste inimestega olid väga võluvad ja ebatavaliselt südamlikud, olid õnnistatud ebaharilike, isegi maagiliste võimetega. Seda on tihti peetud haldjate ning teiste "heade olendite" päritoluks folklooris. Kuigi Williamsi sündroomiga indiviide on kirjanduses tihti kirjeldatud kui haldjaliku näoga inimesi, ütleb Steven Pinker oma raamatus "The Language Instinct", et tema jaoks näevad nad rohkem välja kui Mick Jagger.

Närvisüsteem

Mitmete geenide puudumine Williamsi sündroomiga patsientidel mõjutab oluliselt aju funktsioone, hõlmates hälbeid väikeajus, paremas kiirusagaras ja vasaku otsmikusagara piirkonnas. See muster on kooskõlas visuaal-ruumiliste häiretega ning probleemidega käitumise ajastamisel, mida on Williamsi sündroomiga patsientidel tihti täheldatud. Frontaal-väikeaju-rajad on seotud käitumise ajastamisega ning neokorteksi parietaal-dorsaalpiirkonnad tegelevad visuaalse protsessinguga, mis toetab keskkonna (kuid mitte nägude) visuaal-ruumilist analüüsi. Williamsi sündroomiga inimesed on tavaliselt sõbralikud, ülijutukad ning võivad tihti pahvatada, mis demonstreerib dorsaal-ventraalsetest puudujääkidest tulenevat sisemiste piirangute vähenemist. On tehtud ka uuringuid, mis näitavad Williamsi sündroomiga inimeste mandelkeha suurenemist, võrreldes seda mandelkeha keskmise suurusega inimestel. Teades, et mandelkeha kontrollib inimeste hirmutunnetust, võib näha, miks on WBSiga indiviidid altid suhtlema kõigiga, kaasa arvatud võõrastega.

2010. aasta uuringud näitasid vasaku auditoorse korteksi suurenemist ning selle kõrgemat aktivatsiooni, mida interpreteeritakse kui neuraalset korrelatsiooni nende rütmitunnetuse ja kiindumusega muusikasse. Sarnase suurusega auditoorseid kortekseid on varem leitud ainult professionaalsetel muusikutel.

Põhjused

Williamsi sündroomi geenid
ASL · BAZ1B · BCL7B · CLDN3 · CLDN4 CLIP2 · EIF4H · ELN · FZD9 · FKBP6 GTF2I · GTF2IRD1 · HIP1 · KCTD7 LAT2 · LIMK1 · MDH2 · NCF1 NSUN5 · POR · RFC2 · STX1A · TBL2 TRIM50 · TRIM73 · TRIM74 WBSCR14 · WBSCR18 · WBSCR21 WBSCR22 · WBSCR23 · WBSCR24 WBSCR27 · WBSCR28

Williamsi sündroomi põhjustab geneetilise materjali mikrodeletsioon 7. kromosoomi q11.23 regioonis. Deleteeritud piirkond hõlmab rohkem kui 25 geeni ning teadlased usuvad, et neist mitmete geenide puudumine põhjustabki selle haiguse iseloomulikke jooni. CLIP2, ELN, GTF2I, GTF2IRD1 ja LIMK1 on geenide seas, mis tüüpiliselt on Williamsi sündroomiga patsientide genoomist deleteerunud. Teadlased on leidnud, et elastiini kodeeriva ELN geeni puudumine on seotud sidekoe haigustega ja kardiovaskulaarsete häiretega (eriti aordiklapi stenoos ja mitraalklapi stenoos), mida esineb paljudel Williamsi sündroomiga inimestel. Uuringud viitavad, et LIMK1, GTF2I, GTF2IRD1 ja võib-olla veel mõnede teiste geenide deletsioon võib aidata seletada iseloomulikke probleeme visuaal-ruumilistes ülesannetes. Lisaks on tõendeid, et mitmete geenide, kaasa arvatud CLIP2 puudumine võib kaasa aidata unikaalsete käitumuslike iseärasuste tekkele, õpiraskustele ja teistele kognitiivsetele häiretele, mis on seotud Williamsi sündroomiga.

Diagnoosimine

Indiviidide väliste tunnuste põhjal klassifitseerimine ei ole piisav. Tänapäeval kasutatakse diagnoosi kinnitamiseks geneetilisi teste, mille korraldavad geneetikud koostöös laboritega.

Eristusdiagnoos

• DiGeorge'i sündroom
• loote alkoholisündroom ehk fetaalalkoholisündroom
• CATCH-22 ehk VCFS sündroom ka 22q11 kromosoomi mikrodeletsioon
• D-vitamiini ülitundlikkus
• tüümuse hüpoplaasia
• kõrvalkilpnäärmete anomaaliad ja puudumine jtm.

Ravi

Williamsi sündroomile ei ole ravi. Soovitatav on vältida liigse kaltsiumi ja D-vitamiini tarvitamist, liiga suure vere kaltsiumisisalduse korral tuleb seda ravida. Veresoonte ahenemine võib olla oluline terviseprobleem, mida tuleb ravida individuaalselt. Liigeste jäikuse korral on vajalik füsioteraapia. Williamsi sündroomiga lapsi saab aidata ka arengu- ja kõneteraapiaga (verbaalsed tugevused aitavad hüvitada nõrkusi). Ülejäänud raviviisid põhinevad patsiendi konkreetsetel sümptomitel. Ameerika Pediaatrite Akadeemia on avaldanud juhtnöörid, mis sisaldavad kardioloogilist, arengu-, psühholoogilist ja hariduslikku hinnangut ning palju soovitusi, kuidas Williamsi sündroomi korral käituda ja milleks valmis olla.

Kirurgiline ravi

Williamsi sündroomiga inimesed võivad vajada kardiokirurgilist operatiivset ravi, korrigeerimaks kaasasündinud aordi stenoose (näiteks aordiklapi stenoos jm).