Geeniteraapia seisneb enamasti normaalselt talitleva geeni siirdamises raske kahjustusega koe rakkudesse. Vahel kasutatakse ravi ka mutantse geeni avaldumise vaigistamises, kuid üldiselt tegeldakse geeniteraapiaga vaid väga raskete haiguste leevendamiseks. Tänapäeval on see veel väga noor ja arenemisjärgus ravimeetod, millel on suur tüsistuste risk.
Idee kasutada geene ravimina teraapias tekkis 1970ndatel Ameerika Ühendriikides. Esialgselt kavandatud geeniteraapia oli pärilike retsessiivsete ühe geeni defektide raviks, näiteks tsüstiline fibroos, lihasdüstroofia, lüsosomaalne ladestushaigus, hemofiilia ning mitmed teised erinevad haigusvormid. 1980. aastal tegi Martin Cline esimese katse, kus ta modifitseeris inimese DNA-d. Esimene edukas ja tõestatud geneetilise materjali siirdamine toimus 1989. aasta mais. Esimese terapeutilise geenisiirde ning esimese otsese DNA viimise inimese genoomi teostas French Anderson aastal 1990.
Tänapäeval on geeniteraapia peamisteks uurimisvaldkondadeks vähk, südame- ja veresoonkonna haigused, kesknärvisüsteemi degeneratiivsed haigused ning nakkushaigused.
Geeniteraapia jaguneb kaheks:
1) Somaatiline geeniteraapia – pärilike haiguste ravimeetod, kus defektset alleeli kandvatesse keharakkudesse (mittesugurakkudesse) viiakse metsiktüüpi funktsionaalne geenikoopia.
2) Reproduktiivne (päranduv) geeniteraapia – pärilike haiguste ravimeetod, kus funktsionaalne (metsiktüüpi) geenikoopia lisatakse indiviidi sugurakkudesse, mis kannavad defektset geenikoopiat. Ideaaljuhul kandub sugurakkudega uude organismi edasi terve geen.
Valdkonna arengus on olulist rolli võtmas CRISPR-Cas9 süsteem, mis võimaldab kiirelt, täpselt ja odavalt DNA-d muuta.
Idee kasutada geene ravimina teraapias tekkis 1970ndatel Ameerika Ühendriikides. Esialgselt kavandatud geeniteraapia oli pärilike retsessiivsete ühe geeni defektide raviks, näiteks tsüstiline fibroos, lihasdüstroofia, lüsosomaalne ladestushaigus, hemofiilia ning mitmed teised erinevad haigusvormid. 1980. aastal tegi Martin Cline esimese katse, kus ta modifitseeris inimese DNA-d. Esimene edukas ja tõestatud geneetilise materjali siirdamine toimus 1989. aasta mais. Esimese terapeutilise geenisiirde ning esimese otsese DNA viimise inimese genoomi teostas French Anderson aastal 1990.
Tänapäeval on geeniteraapia peamisteks uurimisvaldkondadeks vähk, südame- ja veresoonkonna haigused, kesknärvisüsteemi degeneratiivsed haigused ning nakkushaigused.
Geeniteraapia jaguneb kaheks:
1) Somaatiline geeniteraapia – pärilike haiguste ravimeetod, kus defektset alleeli kandvatesse keharakkudesse (mittesugurakkudesse) viiakse metsiktüüpi funktsionaalne geenikoopia.
2) Reproduktiivne (päranduv) geeniteraapia – pärilike haiguste ravimeetod, kus funktsionaalne (metsiktüüpi) geenikoopia lisatakse indiviidi sugurakkudesse, mis kannavad defektset geenikoopiat. Ideaaljuhul kandub sugurakkudega uude organismi edasi terve geen.
Valdkonna arengus on olulist rolli võtmas CRISPR-Cas9 süsteem, mis võimaldab kiirelt, täpselt ja odavalt DNA-d muuta.
Geeniteraapia põhimõte
DNA struktuurid
Geeniteraapia ravi algab mutantse geeni kindlakstegemisest, mis on haiguse põhjustajaks. Järgmiseks sammuks on terve identse geeni kloonimine. Seda geeni kutsutakse terapeutiliseks geeniks ehk transgeeniks. Transgeen kohandatakse vajadusele ja seejärel pakitakse transportvektorisse. Vektori ülesandeks on transgeeni viimine patsiendi sihtmärkrakku. Kui transportvektor on sihtmärkrakku jõudnud, siis saadetakse geneetiline materjal rakutuuma. Rakutuumas integreerub geneetiline materjal DNA-ga ning parandatakse muteerunud või defektne DNA. Kõige raskem ja kriitilisem samm on õige vektori valimine.
Nukleiinhapete transport rakku
Geenivektorid on rekombinantse DNA konstruktid, mis kannavad geneetilist materjali paljudesse rakkudesse, kudedesse ning tervetesse organitesse. Optimaalne transportsüsteem sõltub sihtmärkrakust ja selle omadustest, geneetilise materjali avaldumise kestusest ja suurusest. Tänapäeval kasutatavad vektorid jagunevad viirusvektoriteks ja mitteviiruslikeks vektoriteks. Viirusvektoreid kasutatakse geeni transduktsiooniks. Kasutatavaimad viirusvektorid on retroviirus, adenoviirus ja adenoseoseline viirus. Mitteviirusvektoreid (näiteks plasmiide ja liposoome) kasutatakse geeni transfektsiooniks.
Viirusvektoreid kasutatakse geneetilise materjali rakku transportimiseks. Viirusvektoreid võib kasutada nii loommudelis ([[Loomkatse|in vivo]]) kui ka rakukultuuris (in vitro). Viirusvektorite abil teostatavat geenide ülekannet nimetatakse transduktsiooniks ja nakatunud rakke nimetatakse transdutseeritud rakkudeks. Molekulaarbioloogid rakendasid esimest korda transduktsiooni 1970ndatel. Paul Berg kasutas ahvi neerurakkude nakatamiseks modifitseeritud SV40 viirust, mis sisaldas bakteriofaagi λ DNA-d. Viirusvektorite kasutamisega kaasneb aga palju riske nagu immunogeensus, tsütotoksilisus ning insertsiooniline mutagenees, mis viib rakus pahaloomuliste muutuste tekkeni. Kuigi neid probleeme üritatakse lahendada, on oluline arendada ka alternatiivseid transportvektoreid.
Peamine väljakutse geeniteraapias on ideaalse meetodi väljatöötamine, mis suudaks transportida terapeutilised geenid valitud rakkudesse, kus saaks toimuda sobiva geeni avaldumine. Ideaalsel transpordimeetodil on 3 põhilist kriteeriumit: (1) transgeeni tuleks kaitsta lagunemise eest rakkudevahelises piirkonnas, (2) peaks tooma transgeeni läbi plasmamembraani ning läbi sihtmärkraku tuuma, (3) ei tohiks olla kahjulikke tagajärgi. Põhilisteks lähenemisteks mitteviirusvektorite transportimiseks on füüsikaline meetod (ei sisalda kandjat) ning keemiline meetod (baseerub sünteetilisel vektoril).
Plasmiidi ja lipiidi kompleksi efektiivsus sõltub katioonse lipiidi keemilisest struktuurist, katioonse lipiidi ja DNA laengu suhtest, kompleksis oleva lipiidi struktuurist ja kogusest, liposoomide suurusest ja kujust, kompleksi kogusest ja raku tüübist. Katioonsed lipiidid sisaldavad katioonset ja lipiidset fragmenti. Molekul koosneb hüdrofiilsest peast ja hüdrofoobsest osast. Katioonse lipiidi keemilisest struktuurist sõltub transportimise efektiivsus. Multivalentsed lipiidid pika ja küllastumata süsivesinikahelaga on enamasti efektiivsemad kui monovalentsed katioonsed lipiidid sama hüdrofoobse ahelaga. Paljud katioonsed lipiidid näitavad suurepärast transfektsiooniefektiivsust rakukultuuris, aga ei toimi nii hästi seerumi juuresolekul ja ainult vähesed on aktiivsed loommudelis (in vivo).
Katioonsete polümeeride kompleksid DNA-ga on enamasti stabiilsemad katioonsetest lipiididest moodustatud kompleksidest. Aastate jooksul on avastatud märkimisväärselt palju lineaarseid või hargnenud katioonseid polümeere, mida võib kasutada nii rakukultuuris kui ka loommudelis, näiteks polüetetüleenimiin (PEI), polüpropüülamiini dendrimeerid, kitosaan, katioonsed proteiinid (polülüsiin, histoon) ja katioonsed peptiidid. Ka katioonsete polümeeride kasutamist takistab toksilisus ja osad polümeerid pole biolagunevad, näiteks PEI.
Rakku sisenevad peptiidid on suhteliselt lühikesed peptiidid, mis koosnevad vähem kui 40 aminohappejäägist. Nad on võimelised kandma kovalentselt või mittekovalentselt konjugeeritud bioaktiivseid aineid (nukleiinhappeid ja väikese molekulmassiga ravimeid läbi rakumembraani), omades seejuures vähest toksilisust. Peamiseks rakku siseneva peptiidi rakku tungimise mehhanismiks on endotsütoos.
Viirusvektorid
Adenoviirus on üks kasutatavaim viirusvektor geeniteraapias
Mitteviirusvektorid
Mitteviirusvektorid on väiksema patogeensusega, odavamad ja neid on lihtsam toota. Mitteviirusvektoritel on viirusvektoriga võrreldes olulised eelised ohutuse poole pealt. Kõige tähtsaimaks eeliseks on bioloogiline ohutus. Varem kasutati mitteviirusvektoreid vähem, sest nende geneetilise materjali transportimise efektiivsus oli väiksem. Mitteviirusvektorite kasutamine kliinilistes katsetes tõusis aastatel 2004–2013 ning viirusvektorite kasutamine vähenes. Efektiivsus, spetsiifilisus, geeni avaldumise kestus ja ohutus annavad võimaluse kaasata rohkem mitteviiruslikke vektoreid kliinilistesse katsetesse. Kahjuks pole praegusel ajal ideaalsete omadustega mitteviiruslikke vektoreid.Peamine väljakutse geeniteraapias on ideaalse meetodi väljatöötamine, mis suudaks transportida terapeutilised geenid valitud rakkudesse, kus saaks toimuda sobiva geeni avaldumine. Ideaalsel transpordimeetodil on 3 põhilist kriteeriumit: (1) transgeeni tuleks kaitsta lagunemise eest rakkudevahelises piirkonnas, (2) peaks tooma transgeeni läbi plasmamembraani ning läbi sihtmärkraku tuuma, (3) ei tohiks olla kahjulikke tagajärgi. Põhilisteks lähenemisteks mitteviirusvektorite transportimiseks on füüsikaline meetod (ei sisalda kandjat) ning keemiline meetod (baseerub sünteetilisel vektoril).
Füüsikalised meetodid
Füüsikalised meetodid hõlmavad nõelaga süstimist, elektroporatsiooni, geenipüssi, ultraheli, hüdrodünaamilist transporti ja füüsilist jõudu. Füüsikalised meetodid geeni transpordiks kutsuvad rakumembraanis esile mööduvaid vigastusi või defekte, et DNA saaks rakkudesse siseneda difusiooni teel.- Süsti meetodiga süstitakse plasmiidi DNA koesse, meetod ei kaasa keemilist ühendit ega füüsikalist jõudu. Plasmiidse DNA süstimine toimub peamiselt lihasesse, maksa, nahka või läbi inhalatsiooni kopsudesse, kuid meetod ei taga suurt efektiivsust.
- Geenipüss on ideaalne meetod geenide transportimiseks rakkudesse läbi naha, limaskesta või kirurgiliselt paljastatud koe rakkudesse. Kullaga kaetud nanoosakestele rakendatakse DNA transpordiks survet. Impulss annab osakestele võimaluse läbida sihtmärkorganeid ja kudesid paari millimeetri ulatuses. DNA vabaneb metalliosakeste küljest ning satub rakkudesse. Geenipüssi meetod pole rakendatav kõikides keha kudedes.
- Elektroporatsiooni saab teostada koes, kuhu on võimalik elektroode sisestada. Suurimaks probleemiks on koekahjustuste teke elektriimpulsside tagajärjel. Meetod piirab elektroporatsiooni kasutamist elusorganismides.
- Sonoporatsiooni käigus tekitatakse ultraheli mõjul membraani poorid, kuid geeni transpordiefektiivsus on madal.
- Hüdrodünaamiline geeni transport on lihtne meetod, kus süstitakse DNA sisemiste organite rakkudesse. Efektiivsus sõltub organi anatoomilisest struktuurist, süstitavast ruumalast ja süstimise kiirusest.
Keemilised meetodid
Keemilisi vektoreid klassifitseeritakse laialt anorgaanilisteks osadeks, lipiidideks, polümeerideks ja peptiidideks.Plasmiidi ja lipiidi kompleksi efektiivsus sõltub katioonse lipiidi keemilisest struktuurist, katioonse lipiidi ja DNA laengu suhtest, kompleksis oleva lipiidi struktuurist ja kogusest, liposoomide suurusest ja kujust, kompleksi kogusest ja raku tüübist. Katioonsed lipiidid sisaldavad katioonset ja lipiidset fragmenti. Molekul koosneb hüdrofiilsest peast ja hüdrofoobsest osast. Katioonse lipiidi keemilisest struktuurist sõltub transportimise efektiivsus. Multivalentsed lipiidid pika ja küllastumata süsivesinikahelaga on enamasti efektiivsemad kui monovalentsed katioonsed lipiidid sama hüdrofoobse ahelaga. Paljud katioonsed lipiidid näitavad suurepärast transfektsiooniefektiivsust rakukultuuris, aga ei toimi nii hästi seerumi juuresolekul ja ainult vähesed on aktiivsed loommudelis (in vivo).
.svg)
Bioaktiivsete ainete sisenemine rakku endotsütoosi teel
Rakku sisenevad peptiidid on suhteliselt lühikesed peptiidid, mis koosnevad vähem kui 40 aminohappejäägist. Nad on võimelised kandma kovalentselt või mittekovalentselt konjugeeritud bioaktiivseid aineid (nukleiinhappeid ja väikese molekulmassiga ravimeid läbi rakumembraani), omades seejuures vähest toksilisust. Peamiseks rakku siseneva peptiidi rakku tungimise mehhanismiks on endotsütoos.
