Otsing sellest blogist

UUS!!!

Rabastuvad metsad

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige. Rabastuvad metsad  ...

esmaspäev, 14. august 2023

Bakterite geneetika 16

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

16. Bakterite geneetika.

 

Bakteri kromosoom on üldjuhul tsirkulaarne, kuigi on leitud ka lineaarse kromosoomiga baktereid. E. coli tüve K12 genoomi nukleotiidne järjestus on täielikult määratud, sekveneeritud: E. coli DNA rõngasmolekul on 4 639 221 aluspaari (bp) pikkune. 1 kb = 1000 bp. Seega on E. coli genoomi suurus 4,6 x 106 bp e. 4639 kb. Mida parasiitsem on organism, seda väiksem on ka tema genoom. Rickettsia prowazekii genoom on 1100 kb suurune ning mükoplasmadel veelgi väiksem - 600-800 kb suurune (Mycoplasma genitalium, Mycoplasma pneumoniae). Enamasti sisaldavad kõik vahetult loodusest isoleeritud bakterid ekstrakromosomaalseid DNA elemente e. plasmiide, mis on DNA rõngasmolekulid, harva lineaarsed DNA fragmendid. Võrreldes eukarüootse raku genoomiga on bakteri genoom oluliselt väiksem. Näiteks inimese raku genoom on 2,9 x 109 bp suurune.

 

Bakterikromosoom ei ole raku tsütoplasmast tuumamembraaniga eraldatud. Sellegipoolest on ta suhteliselt kompaktselt pakitud. Vastavat struktuuri nimetatakse nukleoidiks. E. coli raku pikkus on ~2 mm, kromosoomi kontuurpikkus aga ca 1 mm.  Bakteri genoomi muudavad unikaalseks järgmised asjaolud:

 

Bakteriraku genotüüp on haploidne, s.t., et genoom on esindatud ühe koopiana. Teistel organismidel on haploidsust kirjeldatud ainult teatud paljunemise staadiumis nagu näit. pärmidel või siis kõrgemate taimede ja loomade sugurakkude puhul. Diploidse  genotüübiga rakkudes on sama kromosoom esindatud kahe koopiana, järelikult on ka iga geen rakus olemas kahe alleelina. Rakud on heterosügootsed,  kui nad sisaldavad sama geeni erinevaid alleele. Ka kiiresti jagunevates bakterirakkudes (rakkude generatsiooniaeg 20 - 30 min) võib korraga olla rohkem kui üks genoom raku kohta, kuna aeg, mis kulub genoomi paljundamiseks (ca 40 min E. coli puhul), on sel juhul pikem kui ajavahemik, mille tagant toimub raku pooldumine. Tütarrakkudesse satuvad kromosoomid, millelt on uuesti algatatud replikatsioon, kuid see ei ole veel jõudnud lõpuni toimuda. Sellegipoolest on need rakud alati homosügootsed, sisaldades identseid geenikoopiaid. Haploidsus annab bakteri genoomile suure plastilisuse. Iga mutatsioon, mis juhuslikult suvalises genoomi piirkonnas piirkonnas tekib, olgu tal siis bakterirakule positiivne või negatiivne väärtus, satub koheselt loodusliku valiku alla.

 

Geneetilise informatsiooni vahetuseks bakterite vahel on vaja, et DNA lõik ühe bakteri (doonori) kromosoomist satuks teise bakterirakku (retsipienti). Rekombinatsioon toimub retsipiendis. Seega on geneetilise materjali ülekanne ühesuunaline. Doonori DNA fragmendi rekombinatsioonil retsipiendi kromosoomiga toimub paarisarv DNA ahelate vahetusi (tavaliselt 2 vahetust). Selle tulemusena integreerub doonori DNA fragment retsipiendi kromosoomi. Mõnikord toimub rekombinatsioon ka bakterikromosoomi ja tsirkulaarse ekstrakromosomaalse DNA molekuli (näit. plasmiid) vahel. Tsirkulaarse DNA molekuli integratsioonil bakteri kromosoomi piisab ühest rekombinatsioonisündmusest.

 

Geneetilise informatsiooni ülekandumiseks ühest bakterirakust teise on 3 võimalust:

 

1.         Transformatsioon – doonori DNA molekul satub retsipientrakku väliskeskkonnast.

 

2.         Transduktsioon – bakteri DNA kandub ühest rakust teise bakteriofaagide abil.

 

3.         Konjugatsioon – bakteri DNA vahetu ülekanne doonorist retsipienti, mis eeldab rakkudevahelist kontakti.

 

Plasmiidid.

 

Plasmiidid on  autonoomselt replitseeruvad ekstrakromosomaalsed DNA elemendid, valdavalt rõngasmolekulid. Nende suurus varieerub 1-200 kb ulatuses. Kirjeldatud on ka 200 kb-st suuremaid megaplasmiide. Sel juhul tekib küsimus, kas nimetada neid plasmiidideks või lisakromosoomideks. Plasmiide, mis võivad integreeruda kromosoomi (näiteks E. coli F plasmiid), nimetatakse episoomideks.

 

Enamus plasmiide sisaldavad võrreldes bakterikromosoomiga unikaalset geneetilist materjali. Kui bakteri kromosoom kodeerib rakule elutähtsaid funktsioone, siis plasmiidides sisalduv geneetiline informatsioon võimaldab bakteritel paremini kohastuda keskkonnatingimustega. Värskelt loodusest isoleeritud organism sisaldab sageli mitut erinevat plasmiidi, kuid pärast bakteritüve pikaajalist kultiveerimist laboritingimustes võivad plasmiidid kaotsi minna. Ka plasmiidse DNA paljundamine on rakule koormus. Juhul, kui plasmiidil ei ole laboritingimustes rakule positiivset selektiivset väärtust, saavad need rakud, mis on plasmiidi juhuslikult kaotanud, teiste ees eelise ja kasvavad kultuuris võrreldes plasmiidi sisaldavate rakkudega kiiremini ning saavutavad rakupopulatsioonis ülekaalu. Samas on laboris pikaajaliselt kultiveeritud bakteritüved nende tagasi loodusesse viimisel võrreledes looduslike tüvedega vähem eluvõimelised.

 

Kõigil plasmiididel on olemas põhireplikon, mis sisaldab replikatsiooni alguspunkti ja replikatsiooni initsiatsiooni kontrollivaid järjestusi. Suuremate plasmiidides sisalduvad ka tra-geenid, mis kodeerivad valke, mis on vajalikud plasmiidi ülekandumiseks konjugatsiooni teel.

 

Plasmiidi koopiaarv raku kohta on konstantne suurus (sõltuvalt plasmiidist 1-100 koopiat). Koopiaarvu kontrollimine toimub plasmiidi replikatsiooni initsiatsiooni kaudu. Selleks on erinevaid mehhanisme:

1)        Antisens-RNA seondub praimeriga;

2)        Toimub replikatsiooni initsiaatorvalgu inhibitsioon translatsiooni tasemel;

3)        Plasmiidis on replikatsiooni initsiaatorvalku siduvad järjestused, mis konkureerivad selle valgu ori piirkonnas asuvate sidumissaitidega.

 

Plasmiidide poolt kodeeritud funktsioonid.

 

Lisaks plasmiidi paljundamise ning koopiaarvu kontrollimise funktsiooni bakterirakus kodeerivad plasmiidid mitmeid teisi funktsioone:

1)        Resistentsus antibiootikumidele - R plasmiidid. Resistentsusmehhanismid on erinevad, toimides kas antibiootikumi modifitseerimise (kloroamfenikooli atsetüül transferaas), antibiootikumi degradeerimise (b-laktamaas degradeerib penitsilliine) või raku permeaabluse muutmise kaudu antibiootikumi suhtes (resistentsus tetratsükliinile).

2)        Virulentsusfaktoreid, toksiine kodeerivad plasmiidid.

3)        Bakteriotsiine kodeerivad plasmiidid. Näiteks ColE1 poolt on kodeeritud E. coli vastased kolitsiinid E1 (permeabiliseerib tsütoplasma membraani), E2 (DNA degradatsioon) ja E3 (ribosomaalse RNA degradatsioon).

4)        Antibiootikume produtseerivad plasmiidid streptomütseetidel.

5)        Degradatiivsed plasmiidid mullabakteritel (näiteks pseudomonaadid omavad plasmiide, mis võimaldavad neil kasutada süsinikuallikana orgaanilisi molekule nagu fenoolsed ühendid, kamfor, jt.).

6)        Ti plasmiidid Agrobacterium'il, mis indutseerivad taimedel tuumoreid.

 

Antibiootikumidele resistentsust kodeerivaid geene sisaldavad R-plasmiidid on probleemiks meditsiinis. Paljud R-plasmiidid kodeerivad resistentsust mitmele antibiootikumile korraga ja sellepärast on neid plasmiide sisaldavaid patogeene haiguskoldest äärmiselt raske tõrjuda. Lisaks kanduvad R-plasmiidid kergesti üle ka algselt neid mittesisaldavatele bakteritele, muutes ka need antibiootikumide suhtes resistentseteks. 

 

Plasmiidide klassifikatsioon.

 

Lisaks funktsioonidele, mida plasmiidid kodeerivad, on nende klassifitseerimise aluseks sobivus. Samasse sobivusgruppi kuuluvad plasmiidid ei ole võimelised samas bakterirakus stabiilselt koos püsima. Selle fenomeni molekulaarseid mehhanisme pole siiani täpselt selgitatud. Mittesobivust on kasutatud ühe kriteeriumina plasmiidide sugulusastme hindamisel. Seega võib üks bakterirakk sisaldada korraga mitut erinevat plasmiidi eeldusel, et need kuuluvad ka erinevatesse sobivusgruppidesse. Samas võib teatavat plasmiidi raku kohta olla isegi mitukümmend koopiat.

 

Plasmiide klassifitseeritakse ka nende permeesorganismide põhjal. Plasmiide, mis replitseeruvad üksnes vähestes väga lähedases suguluses olevates bakterites, nimetatakse kitsa peremeesringiga plasmiidideks, neid aga, mis võivad esineda praktiliselt kõigis graam-negatiivsetes organismides, laia peremeesringiga plasmiidideks.

 

Lisaks leviulatusest lähtuvale liigitamisele klassifitseeritakse plasmiide ka vastavalt sellele, kas nad on võimelised iseseisvalt kanduma ühest bakterirakust teise. Rakust rakku ülekanduvad plasmiidid on konjugatiivsed plasmiidid.

 

 

Bakterite fenotüübi kirjeldamine.

 

Bakterikultuuri piisaval lahjendamisel (tavaliselt kuni miljon korda) on võimalik selle lahjenduse külvamisel (plaatimisel) tardsöötmele jälgida üksikkolooniate moodustumist. Iga koloonia on ühe bakteriraku järglaskond. Bakterite kasvu testimine erinevatel söötmetel võimaldab iseloomustada bakterite genotüüpi. Bakterite geneetilisel analüüsil kasutatakse erinevaid mutante. Enamkasutatavaid mutante võib liigitada 3-ks:

 

1.         Antibiootikumile resistentsed mutandid – need mutandid on võimelised kasvama ja moodustama üksikkolooniaid söötmel, mis sisaldab teatavat antibiootikumi, näiteks streptomütsiini (Str) või tetratsükliini (Tet). Str-resistentsed mutandid (Strr) kasvavad streptomütsiini sisaldavas keskkonnas, str-tundlikud rakud (Strs) aga mitte. 

 

2.         Auksotroofsed mutandid – mutandid, kes pole võimelised kasvama minimaalsöötmel, mis sisaldab ainult süsinikuallikat ja mineraalsooli. Sellega eristuvad nad metsiktüüpi bakteritest (prototroofsed rakud). Auksotroofsed mutandid pole tavaliselt võimelised sünteesima mõnda aminohapet või nukleotiidi, ja vajavad kasvuks selle lisamist minimaalsöötmesse. Inglise keeles on kasutusel ka termin “nutritional mutants”.

 

3.         Süsinikuallika mutandid – need mutandid pole võimelised kasvuks kasutama teatavat süsinikuallikat. Näit. laktoosi mutandid ei kasva ega moodusta kolooniaid minimaalsöötmel, mis sisaldab ainsa süsinikuallikana laktoosi.

 

Lisaks eelpool klassifitseeritud mutantidele  kasutatakse bakterite geneetilises analüüsis ka mutante, mis erinevad üksteisest kolooniate morfoloogia, faagiresistentsuse või temperatuuritundlikkuse suhtes.

 

Bakteri genotüübi uurimiseks  külvatakse rakud esmalt mitteselektiivsele söötmele, millel saavad kasvada nii metsiktüüpi kui ka mutantsed rakud. Järgnevalt võetakse üksikkolooniatest rakke ning testitakse nende kasvu selektiivsöötmetel.

 

Bakteri fenotüüpi tähistatakse 3-täheliselt, neist esimene on suur ning indeksis on kas + või -, mis märgib vastava tunnuse olemasolu või puudumist (näit Lac- väljendab rakkude võimetust kasutada süsinikuallikana laktoosi). Kui indeksis on tähed r või s, viitab see resistentsusele või tundlikkusele teatava ühendi (näit. antibiootikumi) suhtes. Bakterite genotüüpi tähistatakse samal põhimõttel nagu fenotüüpi. Ainus erinevus on see, et kõik tähed on väikesed ja kursiivis. Näiteks auksotroofne mutant, mis pole ise võimeline sünteesima arginiini, on fenotüübilt Arg- ja genotüübilt arg-.

 

Mutatsioonid tekivad bakterirakus spontaanselt, keskmiselt sagedusega 10-7 geeni kohta ühe rakugeneratsiooni kohta. Mutatsioonide tekkesagedus tõuseb, kui töödelda rakke kas mutageenidega või UV-kiirgusega. Samuti ilmneb kõrgenenud mutatsioonisagedus mutaatortüvedes. Mutaatortüved on defektsed kas DNA reparatsiooniensüümide suhtes või puudub neis DNA polümeraasil III "proofreading" e. korrigeeriv aktiivsus.

 

B. Ames viis Salmonella typhimurium'i histidiini biosünteesi operoni kindlad mutatsioonid ning uuris revertantide (reverteerumine - mutatsiooni tulemusena taastub algne DNA järjestus) tekkesagedust erinevate kemikaalide toimel. Kemikaalide puhul, millel esines mutageenne toime, täheldati revertantide tekkesageduse tõusu. Ames'i testi kasutatakse ka kaasajal uute kemikaalide testimisel nende võimaliku mutageensuse suhtes. Osa kemikaale on pro-mutageenid, mille mutageenne toime organismile avaldub alles maksas toimuva detoksifikatsiooni käigus. Seetõttu töödeldatkse uuritavaid kemikaale enne Ames'i testi roti maksa ekstraktiga.

 

Mutantide isoleerimine bakterigeneetikas.

 

1)        Lokaliseeritud mutagenees. Mutatsioonid viiakse kindlatesse geenidesse. Eelnevalt on vaja, et huvipakkuv geen oleks isoleeritud ja selle primaarjärjestus teada. Seetõttu on selle meetodi rakendamisel töömaht väiksem bakterite puhul, kelle genoom on sekveneeritud. Siis on teada kõigi geenide primaarjärjestused. Uuritavasse geeni viiakse mutatsioonid ning homoloogilise rekombinatsiooni teel asendatakse bakteri genoomis algse geeni järjestus defektse geeni järjestusega.

2)        Negatiivne selektsioon. Kasutatakse "rikastusmeetodit", kus teatud söötmel kasvavad metsiktüüpi rakud lüüsuvad näiteks penitsilliini juuresolekul (penitsilliin toimib rakukestadele, mis sünteesitakse jagunevatele rakkudele), mutandid, mis aga antud tingimustes ei kasva, jäävad ellu. Tavaliselt viiakse läbi mitu rikastustsüklit.

3)        Transposoonmutagenees. Transposoon (mobiilne DNA element), mis kannab mingit geneetilist markerit, näiteks resistentsust antibiootikumile, inserteerub kromosoomi erinevatesse kohtadesse ning põhjustab insertsioonikohas asuvate geenide inaktivatsiooni. Selle tulemusena ilmnevad muutused bakteri fenotüübis. Inaktiveeritud geen(id) isoleeritakse transposoonis sisalduva geneetilise markeri avaldumise alusel.

 

Paljude bakterile eluliselt tähtsate geenide inaktivatsioon on rakule letaalse toimega. Sel juhul isoleeritakse ajutise fenotüübiga mutante (conditional mutants). Üheks selliseks võimaluseks on isoleerida temperatuuritundlikke (Ts) mutante, kus mutantsete geenide poolt kodeeritud valgud inaktiveeruvad kõrgemal temperatuuril (temperatuuri viimisel 42°C-ni).    

 

Põhilised meetodid testimaks, kas geneetilise informatsiooni ülekanne toimub transformatsiooni, konjugatsiooni või transduktsiooni teel.

 

DNaasi lisamisel bakterirakke sisaldavasse keskkonda saab testida seda, kas geneetilise info ülekanne on toimunud transformatsiooni teel. Kui rekombinandid ilmuvad üksnes siis, kui DNaasi pole lisatud, viitab see DNA ülekandele transformatsiooni teel. Konjugatsiooni ja transduktsiooni puhul ei satu DNA vabalt raku väliskeskkonda ega pole seetõttu ka DNaasi poolt atakeeritav.

 

Konjugatsiooni toimumiseks on vajalik rakkudevaheline kontakt. Üks klassikalisi meetodeid konjugatsiooni toimumise testimiseks on U-toru eksperiment (ingl. k. “U-tube experiment”). Kasutatakse U-kujulist klaastoru, mille õlad on teineteisest isoleeritud klaasfiltriga. Filtri pooridest mahuvad läbi DNA molekulid ja faagipartiklid, kuid mitte bakterirakud. Toru erinevates õlgades on erineva genotüübiga bakterite vedelkultuurid. Filtri tõttu ei saa erineva genotüübiga bakterirakud otseselt kontakteeruda - seega on konjugatsiooni toimumine välistatud. Juhul, kui bakterite kasvukeskkonda on lisatud ka DNaasi ning lõpptulemusena saadakse ikkagi rekombinante, viitab see geneetilise informatsiooni ülekandele transduktsiooni teel.

 

Transformatsioon.

 

Transformatsioon on protsess, kus retsipientrakk omandab vaba DNA ümbritsevast keskkonnast. Transformatsiooni avastamine oli väga olulise tähtsusega tõendamaks, et DNA on geneetiline materjal. Streptococcus pneumoniae on patogeenne bakter, mis võib põhjustada kopsupõletikku. Patogeensed on ainult limakapsliga rakud. Hiirte süstimisel limakapsliga rakkudega hiired surid, ilma kapslita rakkude süstimisel aga jäid ellu. 1928. a. demonstreeris Fred Griffith, et hiired surid ka siis, kui neid süstiti seguga, mis sisaldas kapslita elusaid rakke ning kapsliga surmatud rakke. Kapslita rakud omandasid surnud rakukultuurist midagi, mis muutis - transformeeris - nad patogeenseks kapsliga rakkudeks, võimaldes neil hiire immuunsüsteemile vastu seista. Hiljem näidati, et transformeeriv aine oli DNA, kuna valkude kõrvaldamisel surnud kapsliga rakkude ekstraktist efekt säilus. Küll kadus aga transformeeriv toime siis, kui ekstrakti töödeldi DNaasiga. 

 

 

 

 

 

Kompetentsus.

 

Selleks, et toimuks transformatsioon, peab DNA sisenema rakkudesse. DNA sisenemiseks peavad rakud olema eelnevalt kompetentsed. Kompetentsus võib olla loomulik või kunstlik, saavutatud laboritingimustes.

 

Looduslik kompetentsus esineb ainult osade bakteriliikide puhul, mille kõige tuntumad esindajad on Streptococcus pneumoniaeBacillus subtilis ja Haemophilus influenzae. Kompetentsuse saavutamiseks tekivad või aktiveeruvad rakupinnal retseptorid, mis on vajalikud eksogeense DNA esmaseks seondumiseks rakupinnale. Samuti on vaja valke, mis aitavad DNA rakku transportida. Mitte kõik rakud populatsioonis ei muutu korraga kompetentseteks. Näiteks S. pneumoniae puhul saavutab esialgu kompetentsuse üksnes väike osa rakupopulatsioonist, mis seejärel väljutab kasvukeskkonda kompetentsusfaktoreid, et muuta ka ülejäänud rakud kompetentseteks. Kompetentsus saavutub rakukultuuri teatavas vanuses, sageli eksponentsiaalses kasvufaasis ning sõltub ka rakkude kasvukeskkonnast. Enamikul juhtudel võtavad kompetentsed rakud sisse suvalist DNA-d. Erandiks on Haemphilus influenzae, mis võtab vastu üksnes sama liigi DNA-d. Nimelt tunnevad H. influenzae rakupinnal olevad retseptorid DNA ära järjestus-spetsiifiliselt. Äratundmisjärjestus on 11 bp pikkune (AAGTGCGGTCA) ning seda esineb keskmiselt iga 4 kb tagant (ligi 600 korda genoomi kohta).

 

Streptokokkide puhul seondub kaksikahelaline DNA retsipientraku pinnaretseptoritega. Enne, kui DNA siseneb rakku, lagundatakse üks ahel membraanseoselise eksonukleaasiga. Lagundamise käigus vabanev energia kulub üksikahelaliseks viidud DNA transportimiseks läbi rakumembraani. Rakku jõudnud üksikahelaline DNA rekombineerub bakterikromosoomiga homoloogilises piirkonnas. Haemophilus´e puhul siseneb rakku kaksikahelaline DNA, kuid ka sel juhul lülitub retsipientraku kromosoomi ainult üks doonor-DNA ahel.

 

Kunstlik transformatsioon.

  

Erinevate bakteriperekondade puhul tekib kompetentsus erineva efektiivsusega. Looduslikku kompetentsust on jälgitud eelpool mainitud streptokokkide ja Haemophilus´e korral, kuid ka Bacilluse, Neisseria, Acinetobacteri, Staphylococcuse ning Rhizobium´i korral. Kompetentsust on võimalik esile kutsuda ka kunstlikult, laboritingimustes. Sel juhul hoitakse rakke, näiteks Escherichia coli rakke jääl ning töödeldakse CaCl2 lahusega, mis muudab rakukesta struktuuri. Töötluse tulemusena muutuvad rakud DNA suhtes läbilaskvaks ning rakusisesed nukleaasid on ajutiselt inaktiveeritud. Kunstlik transformatsioon on efektiivne tsirkulaarsete DNA molekulide, plasmiidide korral, mis on võimelised retsipientrakus iseseisvalt replitseeruma. Lineaarse DNA puhul võib väga madala sagedusega toimuda rekombinatsioon (kui esineb homoloogia doonori ja retsipiendi DNA vahel), kuid enamasti lagundatakse DNA fragment eksonukleaasi toimel.

 

Kunstlikku transformatsiooni viiakse läbi ka elekroporatsiooni teel, kus DNA viiakse retsipientrakku elektri toimel.

 

Transformatsiooni kasutamine geenide kaardistamisel.

 

Streptococcus’e DNA ekstrahheerimisel fragmenteerub kromosoom keskeltläbi 50-ks tükiks. Seega sisaldab iga fragment ligikaudu 2% genoomist.  Transformatsiooni abil on võimalik uurida geenidevahelist distantsi. Kui geenid on lähestikku, on nad ühes ja samas fragmendis suurema tõenäosusega kui üksteisest kaugemal asuvad geenid. Lähestikku asuvate geenide puhul on nende poolt kodeeritud markerite kotransformatsiooni sagedus kõrgem kui seda üksteisest kaugel paiknevate geenide puhul, mis jäävad suure tõenäosusega pärast DNA fragmenteerumist erinevatesse lõikudesse. Jälgime näiteks eksperimenti, kus retsipiendi a-b- transformatsioonis on kasutatud 3 erineva genotüübiga doonor-DNA molekule (a+b-a-b+ ja a+b+). Erineva genotüübiga doonor-DNA fragmente kasutatakse paralleeleksperimentides ning võrreldakse transformatsioonisagedusi genotüüpide a-b-a+b- ja a-b+ suhtes. Teoreetiliselt peaks transformatsioonisagedus ühe markeri suhtes doonor-DNA hulga vähendamisel lineaarselt langema. Seejärel mõõdetakse transformatsioonisagedus sõltuvust doonor-DNA kontsentratsioonist korraga kahe markeri suhtes. Juhul, kui 2 markergeeni on omavahel tugevalt aheldanud (st. nad on lähestikku ja asuvad seetõttu suure tõenäosusega samas DNA fragmendis), avaldab DNA kontsentratsiooni vähendamine kotransformatsiooni sagedusele samasugust mõju nagu transformatsioonisagedusele ühe markeri suhtes. Kui 2 testgeeni paiknevad teineteisest kaugel ja satuvad seetõttu erinevatesse DNA fragmentidesse, on kotransformatsiooni toimumiseks vajalik kõigepealt nende DNA fragmentide sisenemine retsipientrakku ning seejärel mõlema fragmendi homoloogiline rekombinatsioon bakteri kromosoomiga. Vähendades transformatsiooniks võetava DNA kogust 10 korda, näeme ühe geneetilise markeri suhtes toimuva transformatsioonisageduse 10-kordset langust, kahe markeri suhtes samuti 10-kordset, kui vastavad geenid asuvad lähestikku, kuid 100-kordset langust (10 x 10 = 100) siis, kui geenid on teineteisest kaugel ja paiknevad seetõttu erinevates DNA fragmentides.

 

Bakterite konjugatsioon.

 

Kuigi E. coli on geneetiliselt üks kõige paremini iseloomustatud baktereid, ei ole ta looduslikult transformeeritav. E. coli geneetilisel kaardistamisel ristati erinevaid mutante ja mõõdeti rekombinantide (transkonjugantide) tekkesagedust. Bakterite geneetilise informatsiooni ülekandumise rakust rakku konjugatsiooni teel avastasid 1946-ndal aastal Lederberg ja Tatum. Nad analüüsisid erinevate E. coli auksotroofsete mutantide met-bio-thr+leu+ ja met+bio+thr-leu- segakultuure ja isoleerisid väljakülvidel minimaalsöötmetele prototroofseid üksikkolooniaid. Kumbki algtüvi eraldi prototroofseid revertante ei andnud. Samuti oli välistatud transformatsiooni toimumine. Kuna U-toru võeti Davis’e poolt kasutusele alles 4 aastat hiljem, ei tõestatud sel korral veel rakkudevahelise otsekontakti vajadust. 

 

Bakteritevaheliseks konjugatsiooniks on vajalikud geenid (tra geenid), mis kodeerivad geneetilist informatsiooni vahetavate bakterirakkude liitumist ning DNA liikumist rakust rakku. Enamasti on need geenid plasmiidis. Rakku, millest toimub DNA ülekanne, nimetatakse doonoriks. Rakk, mis võtab vastu võõra DNA, on retsipient. Rakkudevahelist kontakti aitavad saavutada doonorraku sugukiud e. piilid (ingl. k. “sex pili”).  Konjugatiivsed plasmiidid võivad mobiliseerida mittekonjugatiivsete plasmiidide ning isegi kromosomaalsete geenide ülekandumist. Tavaliselt on mobiliseerimiseks vajalik konjugatiivse plasmiidi integreerumine (kovalentne insertsioon) DNA molekuli, mida mobiliseeritakse. Mõnedel juhtudel ei sõltu mobilisatsioon aga integreerumisest, piisab üksikahelalisest liitekohast konjugatiivse plasmiidi ning mobiliseeritava DNA vahel. Bakteris E. coli on kirjeldatud F plasmiid (fertiilsusfaktor), mis integreerudes kromosoomi algatab kromosomaalsete geenide ülekande doonorrakku. Konjugatsioon toimub F+ rakust F- rakku. Integreerunud F plasmiidiga rakke nimetatakse Hfr (“high frequency recombination”) rakkudeks, kuna kromosomaalsete geenide ülekanne neist toimub kõrge sagedusega ja sellest tulenevalt on ka rekombinantide tekkesagedus kõrge. Integreerunud vormis kandub F plasmiid ise üle kõige viimasena, integreerumata F plasmiid aga kõige esimesena. Integreerumata F plasmiidi puhul on kromosomaalsete geenide ülekandumise tõenäosus väga väike.

 

Kui F plasmiid on integreerunud kromosoomi, algatab ta kromosomaalsete geenide ülekandumise integratsioonisaidist. Integratsioonisaidid võivad olla erinevad. F plasmiid integreerub E. coli kromosoomi homoloogilise rekombinatsiooni teel. Homoloogilist rekombinatsiooni võimaldab samade IS elementide (“insertion sequences”) olemasolu nii plasmiidis kui ka kromosoomis. Kuna F plasmiid võib bakterirakus olla nii kromosoomi koostises kui replitseeruda kromosoomist sõltumatuna, nimetatakse seda ka episoomiks.

 

Konjugatsiooniprotsessi käigus toimub DNA replikatsioon “veereva ratta” põhimõttel. Retsipientrakku kandub üle ainult üksikahelaline DNA, millele komplementaarne DNA ahel sünteesitakse retsipientrakus. Kogu bakteri kromosomaalse DNA ülekandumiseks doonorist retsipienti kulub ligikaudu 100 minutit. Enamasti kaob rakkudevaheline kontakt enne protsessi lõpulejõudmist. See on ka põhjuseks, miks üldjuhul F plasmiid ise integreerunud vormis üle ei kandu.

 

F’ konjugatsioon e. seksduktsioon.

 

Bakterikromosoomi integreerunud F plasmiid võib sealt välja tulla. Mõnikord pole väljatulek aga täpne, sest plasmiidi satub ka segment integratsioonisaidile külgnevast kromosomaalsest DNA-st. Kromosomaalseid geene sisaldavat F plasmiidi nimetatakse F’ plasmiidiks. Kuna F plasmiidi koostises ülekandunud geenid ei pea oma püsimajäämiseks bakterirakus kromosoomi integreeruma, on nende geenide ülekandesagedus retsipientrakku väga kõrge. Kromosomaalsete geenide ülekannet F’ plasmiidis nimetatakse seksduktsiooniks.  Seksduktsiooni tulemusena on rakud samal ajal nii F plasmiidis kui ka kromosoomis asuvate geenide suhtes diploidsed. Selline osaline diploidsus võimaldab bakterigeneetikutel hinnata kromosoomis ja plasmiidis olevate alleelide dominantsust ja retsessiivsust. Juhul, kui kromosomaalsed geenid on lülitunud F plasmiidi, peavad nad kromosoomis paiknema lähestikku.

 

Konjugatsiooni kasutamine geneetiliseks kaardistamiseks.

 

Hfr tüvede avastamine võimaldas välja töötada bakterikromosoomi geneetilise kaardistamise metoodika, mis põhineb konjugatsiooniprotsessi katkestamisel erinevatel ajamomentidel. Rakke lastakse konjugeeruda ning erinevate ajaintervallide tagant viiakse osa rakke segistisse, peatades rakkudevaheliste kontaktide kaotamisega konjugatsiooniprotsessi toimumise. Mida kauem on konjugatsioon toimuda saanud, seda rohkem on geneetilist informatsiooni üle kandunud. E. coli geneetiline kaart on jagatud 100-ks minutiks. Kuigi F plasmiid võib integreeruda bakterikromosoomi erinevatesse saitidesse ja seetõttu võib kromosomaalsete geenide ülekanne alata erinevatest kohtadest, on ajaloolistel põhjustel 0-punkti paigutatud thr (treoniini biosüntees) lookus. See lookus asus kõige esimesena kirjeldatud F plasmiidi integratsioonisaidi kõrval ning kandus sel juhul esimesena üle.

 

Graampositiivsetel bakteritel toimub konjugatsioon ilma piilideta. Doonorrakudest difundeeruvad bakterite kasvukeskkonda feromoonid, mis tõmbavad ligi retsipientrakke. Tekivad rakkude klombid, kus koos on palju rakke ning seejärel toimub DNA ülekanne doonorist retsipienti.

 

Transduktsioon.

 

Transduktsioon on bakteriofaagide poolt vahendatud geneetilise informatsiooni ülekanne ühest bakterirakust teise. 1952. a. leidsid Zinder ja Lederberg, et Salmonella typhimuriumi geneetiline informatsioon kandub üle nii bakterite konjugatsiooni teel kui ka siis, kui kasutati bakterifiltreid. Katsed viidi läbi auksotroofsete mutantidega, mis olid defektsed mitme erineva aminohappe biosünteesivõime suhtes. Transformatsiooni ja konjugatsiooni toimumise välistasid nad U-toru eksperimentidega, kus kahe erineva bakteritüve suspensioonid olid teineteisest eristatud bakterifiltriga ning suspensiooni oli lisatud DNaas. Ilmnes, et prototroofsus (võime kasvada minimaalsöötmel) tekkis ka siis, kui auksotroofset mutanti oli mõjutatud prototroofse bakterikultuuri filtraadiga. Prototroofsust põhjustas faag P22, mis oli bakteri kromosoomist haaranud kaasa komplementatsiooni võimaldavad geenid.

 

Eristatakse üldist ja spetsialiseeritud transduktsiooni.

 

Üldine transduktsioon.

 

Üldine transduktsioon toimub suvalise geneetilise markeri suhtes, kuna faagi valkkesta võidakse eksikombel pakkida suvaline DNA fragment bakteri genoomist. Näiteks P1 faagi puhul sisaldab 1 partikkel 1000 kohta faagi genoomi asemel bakteri DNA-d. Üldine transduktsioon avastati faagi P22 puhul. Bakteri ja faagi genoom märgistati erinevate N isotoopidega ja paljunemistsükli läbi teinud faagipartikleid tsentifuugiti CsCl gradiendis. Osa faagipartiklitest pärinevat DNA-d jaotus fraktsiooni, kuhu peaks jääma bakteri DNA. Koos kanduvad üle lähedalt aheldunud geenid (näit. gal-bio). Faagipartiklisse mahub 1 - 2% bakter genoomist. Geneetiliste kaartide koostamisel lähtutakse sellest, et kotransduktsiooni sagedus tõuseb kahe geneetilise markeri distantsi vähenedes. Faagi partikliga edasikantav DNA inserteerub nakatatava bakteri genoomi homoloogilise rekombinatsiooni teel. Juhul, kui homoloogilist rekombinatsiooni ei toimu, on bakterirakk osaliselt diploidne. Nähtust nimetatakse abortiivseks transduktsiooniks. Sel juhul rakku sissetoodud DNA ei replitseeru. Raku jagunemisel satub ühte tütarrakkudest doonori DNA ja avalduvad doonori geenid, teine rakk aga reverteerub ning seal taasub algne fenotüüp.

 

 

 

 

 

 

Spetsialiseeritud transduktsioon.

 

Spetsialiseeritud transduktsiooni puhul pärinevad ülekantavad geenid kromosoomi kindlast alast, mis külgneb sinna inserteerunud faagi genoomiga. Kui näiteks faag lambda on integreerunud E. coli kromosoomi gal ja bio geenide vahele, võib ta kromosoomist välja tulla ka ebatäpselt. Ebatäpne väljatulek toimub sagedusega 10-4 ning sel juhul on osa faagi geenidest asendatud bakteri geenidega (bio või gal operonist).

 

Faag lambda integreerumine kromosoomi toimub sait-spetsiifilise rekombinatsiooni teel. Kromosoomi integreerunud faagi nimetatakse profaagiks. Rekombinatsioon toimub 15-bp homoloogsete DNA järjestuste (att sait) baasil, mis on olemas nii E. coli kromosoomis gal ja bio geenide vahel kui ka faagi genoomis. Geen int - integraas - tunneb ära 15 bp homoloogsed alad ning nendega külgnevad alad faagi ning bakteri genoomis. Integraas viib läbi DNA ahelate retsiprookse rekombinatsiooni, mille tulemusena toimub faagi ja bakteri DNA ahelate ühinemine. Integraas ei tunne ära järjestust, kus ühel pool 15-bp homoloogset ala on bakteri ja teisel pool faagi järjestus. Sellise järjestuse äratundmiseks on vajalik xis geeni (“excisionase) produkt. Profaagi vabanemiseks kromosoomist on vajalik geenide int ja xis koosavaldumine ja vastavate geeniproduktide koostoime. Geeni xis transkriptsioon on pärsitav faag lambda poolt kodeeritud valgu cI poolt. Profaagi väljatulekut on võimalik kunstlikult indutseerida UV-kiirgusega.

 

Hübriidse faagi genoomi pikkus varieerub, moodustades 78% - 108% algse genoomi pikkusest. Genoomi pikkuse piirmäärad determineerib kapsiidi maht (lubab mahutada 36 - 51 kb DNA-d). Seetõttu on kromosoomist ebatäpselt välja tulnud faagide genoom sageli defektne – kui faagi genoomi on lisandunud bakteri geene, läheb hübriidse genoomi kapsiidi pakkimisel osa faagi geene kaotsi.

ldgal - puudu pea ja saba komponentide geenid, ei lüüsi rakke

ldbio - puudu intxis, põhjustavad lüüsilaike.

Defektsed faagid vajavad paljunemiseks helperfaagi.

 

Transduktsiooni kasutamine bakteriaalsete geenide kaardistamisel.

 

Bakteri geneetilise kaardi koostamine üldise transduktsiooni abil on põhimõtteliselt sarnane transformatsioonisageduste analüüsile. Mida lähemal paiknevad teineteisele geenid, seda kõrgem on kotransduktsiooni sagedus. Kuna faagi valkkesta pakitava DNA fragmendi pikkus on limiteeritud, ei saa geenid, mis paiknevad bakteri genoomis üksteisest kaugemal kui 2% genoomi ulatusest, samasse DNA fragmenti mahtuda. Näiteks vaadeldi kotransduktsiooni kolme erineva markeri leu+ (leutsiin), thr+ (treoniin) ja azir (resistentsus Na-asiidile) suhtes. P1-ga nakatatud rakud kandsid metsiktüüpi alleele leu+ thr+ azir. Nendes rakkudes paljundatud faagipartiklitega nakatati leu- thr- azis rakke ja viidi rakud selektiivsöötmetele, kus eeldati ühe või kahe, kuid mitte kunagi kolme erineva geneetilise markeri koosavaldumist. Järgnevalt testiti selekteeritud markeriga bakterikolooniaid mitteselekteeritud markeri avaldumise suhtes ning arvutati selle põhjal kotransduktsiooni sagedus. leu+azir kotransduktsiooni sagedus oli 50%, leu+ thr+  2% ning thr+ azir puhul ei nähtud kunagi kotransduktsiooni. Seega peaksid markergeenid asuma üksteisest erinevatel kaugustel järjekorras:

 

                     azi______leu__________________________________________________thr,

 

Sealjuures asuvad geenid azi ja thr teineteisest liiga kaugel, et nad saaksid transduktsioonil ühte DNA fragmenti sattuda. 

 

Spetsialiseeritud transduktsiooni abil saab kaardistada faagi integratsioonisaidile külgnevaid alasid bakterikromosoomis.

 

Faagiga nakatunud bakteritel võivad avalduda uued omadused. Sageli on need määratud faagi genoomi koostises olevate ja bakteri kromosoomis asuvate geenide koostoimena. Suurem osa bakteriaalseid virulentsusgeene on kodeeritud mitte kromosomaalsete geenide, vaid plasmiidide, transposoonide või bakteriofaagide poolt. Nende elementide puudumisel on Shigella, Salmonella, Yersinia, Staphylococcuse, Clostridiumi ja Escherichia coli tüve virulentsus nõrgem või puudub üldse. Samas aga ei ole eelpool mainitud geneetilised elemendid üksi võimelised virulentsust põhjustama. Mõnede patogeensete bakterite toksiinide produktsioon on määratud mõõdukate faagide poolt:

 

1)        Corynebacterium diphteriae patogeensus on seotud bakteriofaagi b poolt kodeeritud tox geeni avaldumisega. tox geen külgneb faagi kromosoomi integreerumisel vahetult bakteri DNA-ga. Ta kodeerib 58 kDa suurust valku. Juba 1 molekul on võimeline tapma ühe eukarüoodi raku, inhibeerides valgusünteesi. tox geeni avaldumine on reguleeritav bakteriaalse repressori DtxR poolt. Fe-rikkas keskkonnas on repressor seondunud tox geeni operaatoralale, takistades sellega geeni transkriptsiooni.

 

2)        Koolera toksiini A ja B subühikud  on kodeeritud Vibrio cholerae bakteriofaagi CTXF genoomis olevate geenide ctxAB poolt. Faag nakatab rakke, adsorbeerudes piilidele. Sageli paikneb ta virulentsete tüvede kromosoomis tandeemsetes kordustes. Ta võib ka replitseeruda ja kanduda vertikaalselt edasi plasmiidina. Koolera toksiini geenide puhul on täheldatud nende horisontaalset ülekannet V. cholerae biotüüpide vahel.

 

3)        Osa botulismi toksiinidest on samuti faagide poolt kodeeritud.