Otsing sellest blogist

UUS!!!

Palumetsad

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige. Palumets  on pohla ...

reede, 11. august 2023

Viiruste geneetika 15

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

15. Viiruste geneetika

 

Viiruste definitsioon.

 

Viirused on obligatoorsed rakusisesed parasiidid. Samas on rakusisesed parasiidid ka mitmed prokarüootsed organismid, näit. bakterid perekonnast Rickettsiae ja Chlamydiae, mis suudavad rakuväliselt eksisteerida ainult väga lühiajaliselt. Seetõttu on viiruste defineerimiseks vaja juurde tuua veel lisaparameetrid:

1) Viiruspartiklid assambleeritakse eelnevalt valmissünteesitud komponentidest

2) Viiruspartiklid ei kasva ega jagune

3) Puudub geneetiline info energia tootmiseks ja valgusünteesiks.

 

Viiruste spetsiifika:

Iga viirus on võimeline nakatama ainult teatud tüüpi rakke. Vastavalt sellele klassifitseeritakse viiruseid loomaviirusteks, taimeviirusteks ning bakteriviirusteks e. bakteriofaagideks. Viirusega nakatamiseks on vaja, et viiruse välispind interakteeruks rakupinna spetsiifiliste retseptoritega. Loomaviiruste retseptorid paiknevad plasmamembraaanil, faagide retseptorid bakteriraku rakukestal või kiududel e. piilidel. Viirusega nakatumise tagajärjel toimub raku metabolismi ümberlülitamine normaalselt elutegevuselt viiruse paljundamisele. 

 

Viiruste avastamine.

 

Nimetus viirus tuleneb ladinakeelsest sõnast virus, mis tähendab tõlkes mürki. Kuni 20-nda sajandini tähistati terminiga “viirus” kõiki haigustekitajaid. Kuigi paljudel juhtudel oli tegemist bakteriaalsete infektsioonidega, nimetati ka neid viirusinfektsioonideks.  Eraldi rühmana toodi viirused välja alles 20-nda sajandi künnisel. Keskmise bakteriraku pikkus 2-3 mm. Viiruspartikli e. viriooni suurus varieerub aga vahemikus 20 - 400 nm. Viirused tuvastati kui haigusi tekitav toimeaine, mis läbib bakterifiltreid, mille pooride läbimõõt on väiksem kui 0,4 mm.

 

Eelajalugu.

Esmased teated viirushaiguste kohta pärinevad Egiptusest 3500 a. tagasi. Memphises on leitud hieroglüüfe, mis kujutavad templipreestrit tüüpiliste poliomüeliidi nähtudega. Ka Kairos eksponeeritud vaarao Ramses V muumial (vaarao suri 1196. a. e. m. a.) on täheldatavad viirushaiguse - rõugete - tunnused. Esimesed katsed vältida viirushaigusi pärinevad vanast Hiinast. Rõugete vältimiseks oli Hiinas juba 3000 a. tagasi kasutusel variolatsioon, kus haiguse läbipõdenute paranevatest rõugekahjustuskohtadest võeti materjali ning kraabiti laste käsivartele. Variolatsioon oli kasutusel sajandeid ka Euroopas. Tulemus oli tõhus, kuid sisaldas alati riskimomenti. Nii oleks äärepealt variolatsiooni tagajärjel 7-aastaselt surnud Edward Jenner, kes hiljem, 1796. a. viis läbi esimese vaktsineerimise. E. Jenner märkas, et lüpsinaised haigestusid võrreldes teistega rõugetesse vähem, kuna nad puutusid lüpsmise käigus kokku lehmarõugetega. E. Jenner viis oma kodukülas Berekeley’s läbi eksperimendi, kus võttis lüpsinaise Sarah Nemes kätelt lehmarõugete materjali ning nakatas sellega 8-aastast poissi James Phipps. Poiss osutus hiljem rõugete suhtes immuunseks. 19. sajandil võeti vaktsineerimine lehmarõugetega laialdaselt kasutusele üle kogu maailma.

  

L. Pasteur isoleeris marutaudi viiruse. Samas ei eristanud ta haigustekitajat bakeritest ning seega kuulub viiruste esmaavastaja au Vene botaanikule Dimitri Ivanovile, kes demonstreeris 1892. a., et tubaka haigust põhjustab bakterifiltreid läbiv taimeviirus. 1898. a. kordas Martinus Beijerinick Ivanovski katseid tubakataimedega ning nimetas haigust põhjustava viiruse tubaka mosaiigiviiruseks (TMV). Järgnesid teated teistest viirushaiguistest:

1898 Loeffler ja Frosch - veiste suu- ja sõrataud

1908 Ellerman ja Bang - kodulindude leukoos

1909 Landsteiner ja Popper - poliomüeliit inimestel on viirushaigus

 

1915. a. näitasid Twort ning 1917. a. d’Herelle, et ka baktereid nakatavad viirused - bakteriofaagid, põhjustades bakterirakkude lüüsi.

 

 

 

Viriooni ehitus.

 

Viiruspartikkel sisaldab nukleiinhapet, mis kodeerib viirusspetsiifilisi valke. Viiruse geneetiliseks materjaliks on kas DNA või RNA molekul. Eristatakse üksikahelalise (ss -single strand) ja kaksikahelalise (ds - double strand) genoomiga viirusi. dsDNA viirused on näiteks loomaviirustest papilloomiviirus ning bakteriofaagidest T4 ja lambda faag; ssDNA genoomiga on bakteriofaag M13. Reoviiruste (põhjustavad hingamisteede haigusi) genoomiks on dsRNA. ssRNA genoomiga viiruste näiteks võib tuua retroviirused, näit. HTLV, mis põhjustab leukoosi ja HIV, mis põhjustab AIDS-i.

 

Retroviiruste genoomiks on ssRNA molekul. Pärast raku nakatamist retroviirusega sünteesitakse rakus viiruse RNA-le komplementaarse dsDNA. DNA sünteesi viib läbi pöördtranskriptaas e. revertaas, mis on viiruse poolt kodeeritud ja on valmiskujul olemas juba viiruspartiklites. dsDNA integreerub raku genoomi viiruse poolt kodeeritud integraasi abil. Integreerunud DNA võib genoomis püsida pikka aega latentsena, proviirusena. Viiruse genoomi paljundamisel muutub ta transkriptsiooniliselt aktiivseks. Viiruse valkude sünteesiks avalduvad viiruse-spetsiifilised geenid. Samuti toimub viiruse genoomi (RNA) amplifikatsioon. 

 

Viiruse nukleiinhapet ümbritseb valkkate - kapsiid, millel võib olla ümbris. Genoomi pakkimine kapsiidi on vajalik selleks, et kaitsta nukleiinhapet välismõjude eest. Pakkimisel osalevad spetsiifilised pakkimisvalgud, mis tunnevad nukleiinhappel ära pakkimissignaale. Selleks, et stabiliseerida pakitud nukleiinhapet, vältida negatiivsete laengute tõukumist, jääb nukleiinhape seotuks positiivselt laetud ioonidega, polüamiinide ning valkudega. Valgu monomeerid kapsiidis moodustavad kapsomeeri. Kapsiidi struktuurüksused on omavahel ühendatud mittekovalentsete sidemetega.

 

Viiruspartiklite arv ja nende infektsioonivõime on vaid harva 1:1 vastavuses. Mitte kõik virioonid ei sisalda kogu viiruse geneetilist informatsiooni.

 

Kapsiidi sümmeetria:

 

1. Helikaalne (TMV, faag M13;)

 

TMV (Tubaka Mosaiigiviirus): 6400 nt, 2130 identset valgu subühikut pakitud helikaalselt ümber ssRNA, iga valgu subühik interakteerub 3 nt-ga. Assambleerumise ühikuks 34 subühikut. 1955. a. näitasid Fraenkel-Conrat ja Williams, et dissotseerunud valgud ja NH on võimelised spontaanselt reassambleeruma.

 

2. Ikosaeedriline - 12-nurkne 20 võrdkülgse kolmnurgaga hulktahukas. Näit. faag FX174, adenoviirused, pikornaviirused. Kui kapsiidis on rohkem kui 60 subühikut, on kapsiid kvaasi-ekvivalentne.

 

Viiruste ümbris ehk kest esineb peamiselt loomaviirustel.

 

Ümbris pärineb peremeesraku membraanist; herpesviiruste puhul on ümbriseks tuumamembraan. Ümbris sisaldab lipiide ja valke. Valgud on viirusspetsiifilised:

1. Maatriksvalgud, tavaliselt glükosüleerimata

2. Glükoproteiinid

   a) eksternaalsed - "spikes" (gripiviirus - hemaglutiniin)

   b) transportkanalivalgud.

Ümbrisega virioonid võivad olla pleomorfsed, s.o. erineva kujuga.

 

Komplekssed viirused

 

Rõugeviirused - omavad ümber DNA mitut valkkesta

Kapsiid lisastruktuuridega (T faagid)

Bakuloviirused - viiruspartiklid kahesugused

 

 

 

Bakteriofaagid uurimisobjektina geneetikas.

 

Pärast bakteriofaagide avastamist jätkati nende uurimist eeskätt meditsiinilistel eesmärkidel. Kuna faagid hävitavad baktereid, siis loodeti neid kasutada bakteriaalsete haiguste (nt. koolera, tüüfus) raviks. Selgus aga, et faagide viimisel haige organismi asub neid tõrjuma organismi immuunsüsteem. Geneetikud avastasid bakteriofaagid kui uurimisobjekti 30-ndate aastate algul. Bakteriofaagide uurimine oli perspektiivikas eeskätt nende lihtsuse tõttu ja võimaldas täpsemalt defineerida geenide olemust.

 

Bakteriofaagi elutsükkel.

 

Vastavalt faagide paljunemisstrateegiale jaotatakse nad virulentseteks ja mõõdukateks faagideks. Virulentsed faagid (näit. T4) põhjustavad alati pärast faagipartiklite taastootmist peremeesraku surma. Sellist elutsüklit nimetatakse lüütiliseks tsükliks. Mõõdukad faagid (näit. faag lambda) võivad aga pärast bakteriraku nakatamist valida kas lüütilise tsükli või lülituda bakteri kromosoomi, replitseeruda kromosoomi koostisosana ja püsida seal, ilma et faagi paljundamisega seotud geenid avalduksid, paljude rakupõlvkondade vältel. Sellist kromosoomi integreerunud faagi nimetatakse profaagiks ja tema paljunemisstrateegiat lüsogeenseks. Mingil hetkel profaag vabaneb ja paljuneb lüütilise tsükli teel.

 

T4 ja tema sugulased (T2, T6).

 

E. coli T-faagid on dsDNA faagid, lineaarse genoomiga (T2, T4, T6 - ~167000 bp; T7 - ~39000 bp). Nad on virulentsed faagid.

 

Need faagid on nii seroloogiliste kui ka morfoloogiliste tunnuste põhjal omavahel suguluses. Nende DNA on 80% ulatuses homoloogiline, võimaldades liikidevahelist rekombinatsiooni. Ka geenide järjekord ja regulatsiooniskeem on sarnased. Enamus uuringuid on kontsentreerunud T4-le. T-faagide paljunemistsükkel sõltub peremeesraku energiametabolismist, rakumembraani ehitusest, transkriptsiooni- ja translatsiooniaparaadist. Bakteriraku funktsioonid allutatakse faagipartiklite taastootmisele. T-faagide partiklid on teadaolevatest viiruspartiklitest ühed kõige komplekssemad. Kapsiidi struktuurvalgud ja assambleerumisel osalevad valgud võtavad enda alla üle 40% kogu geneetilisest informatsioonist: 24 geeni - pea morfogenees; 25 geeni saba ja sabakiud; assambleerumisel osalevad valgud.

 

Infektsioonitsükkel.

 

T-faagide saba keskel on helikaalse ehitusega toru, mille kaudu DNA pääseb rakku.Toru on ümbritsetud helikaalse tupega, mis on võimeline kokku tõmbuma. Tupe peapoolne ots on ühendatud kaelusega ja teine ots basaalplaadiga. Basaalplaat on 6-nurkne, igas nurgas on nõel (pin). Saba pikkus on konstantne. Basaalplaadilt algavad ka 6 sabakiudu. Sabakiud tunnevad ära raku pinnal olevaid faagi-spetsiifilisi retseptoreid. Erinevad T-faagid tunnevad ära erinevaid retseptoreid. Faagi kinnitumine rakupinnale sabakiududega on pöörduv protsess. Seejärel toimib kinnitumine basaalplaadi nõelte abil, mis on pöördumatu. Basaalplaat lõhub rakukesta basaalplaadis sisalduva lüsosüümi toimel. Plaadis toimuvad konformatsioonilised muutused ning ta avaneb DNA väljutamiseks. ATP-d tarbiv tupe kontrakteerumine surub faagi pead basaalplaadi ja kiudude suunas. Saba südamikus olev toru läbib rakukesta, kuid mitte rakumembraani ning valkkatteta DNA siseneb läbi rakumembraani. Selleks, et faagi DNA oleks kaitstud rakusiseste nukleaaside eest, on ta modifitseeritud.

 

Faagi paljunemistsükli erinevatel etappidel avalduvad erinevad geenid. Varajases infektsioonistaadiumis inaktiveeritakse faagi poolt kodeeritud valkude abil raku geenide transkriptsioon ja translatsioon. Bakteri RNA polümeraas modifitseeritakse nii, et ta tunneb ära faagi geenide promootoreid. Toimub ka intensiivne faagi genoomi paljundamine. Hilised geenid kodeerivad faagi kapsiidi valke ja faagi DNA-d lahtilõikavaid ensüüme. Lisaks basaalplaadis sisalduvale lüsotsüümile sünteesitakse ka lahustuvat lüsotsüümi, mis hävitab rakuseina. Vabaneb 200 viiruspartiklit, kogu infektsioonitsükkel kestab 25 minutit.

 

Faag paljuneb erinevates bakteritüvedes erineva edukusega. Seda nähtust kirjeldati esmalt faag lambda ja P2 puhul. W. Arber leidis, et T4 paljunemine on osades E. coli tüvedes restrikteeritud (piiratud). Rakus on olemas metülaasid, mis modifitseerivad nukleotiide spetsiifiliselt restriktaaside poolt äratuntavatest 4 - 6 bp pikkustest DNA järjestustest. Metüleerimata DNA on substraadiks restriktaasidele, mis lõikavad DNA kleepuvate või tömpide otstega fragmentideks. Edasise degradatsiooni viib läbi rakuline nukleaas ExoV. Restriktsiooni-modifikatsioonisüsteemi bioloogiliseks funktsiooniks on võõra DNA degradatsioon (raku enda DNA on spetsiifiliselt samade restriktaaside äratundmissaitidest metüleeritud). Enamlevinud on klass I ja klass III restriktsiooni-modifikatsiooni süsteem.

 

T-faagide DNA sisaldab hüdroksümetüültsütosiini (HMC) tsütosiini (C) asemel. Selline modifikatsioon kaitseb T4 faagi DNA-d T4 poolt kodeeritud endonukleaaside eest. Vahetult peale faagi infektsiooni ja faagi varajaste geenide avaldumist toimub bakteri DNA degradatsioon mononukleotiidideks. Seejärel konverteerib faagi poolt kodeeritud ensüüm tsütosiini HMC-ks. Faagi genoomi replikatsioonil osaleb ka valk, mis takistab C lülitumist HMC asemel sünteesitavasse DNA ahelasse. Selline DNA jääb aga atakeeritavaks bakteriraku poolt kodeeritud restriktsioonisüsteemi poolt. Et seda vältida, on HMC alused lisaks veel faagi poolt kodeeritud glükosüültransferaasi poolt glükosüleeritud. T2 ja T4 (kuid mitte T6 DNA) on metüleeritud ka adeniini N6 positsioonist enamasti GATC järjestustest. Metülatsiooni läbiviiv ensüüm omab valgu tasemel sarnasust E. coli Dam metülaasiga.

 

Bakteriofaagi genoomi kaardistamine.

 

Suvalise organismi geneetilise kaardi koostamine eeldab ristamiskatseid nende isendite vahel, mis sisaldavad sama geeni erinevaid alleele. Faagide puhul saab erinevaid fenotüüpe kirjeldada ainult läbi faagi ja bakteriraku interaktsioonide. Üks põhilisi tunnuseid, mida faagigeneetikud jälgivad, on faagi laikude morfoloogia. Kui tardsöötmetele on külvatud bakterirakud ja osa rakke on nakatunud faagiga, siis infektsioonitsoonis bakterirakud kas lüüsuvad või on nende kasv tugevalt pärsitud. Selle tulemusena pole söötme pind bakterirakkudega ühtlaselt kaetud, vaid sisaldab rakuvabu tsoone. Sõltuvalt faagi genotüübist ja faagi ning bakterivahelisest interaktsioonist on faagilaikude morfoloogia erinev. Metsiktüüpi T faag (r+) põhjustab väikeseid laike säbruliste äärtega. Tema kiirelt lüüsiv mutant r aga põhjustab bakterikultuuris suuri laike, mille ääred on selgelt piiritletud.

 

Teine üks sagedamini jälgitavaid faagi fenotüüpe on seotud faagi peremeesringiga. Peremeesringi mutandid on võimelised nakatama ainult teatavaid bakteritüvesid. Näiteks faag T2 nakatab E. coli tüve B rakke. Selle tüve mutant B/2 on T2 infektsiooni suhtes resistentne. Faagi T2 peremeesringi mutant T2h on võimeline nakatama mõlemaid E. coli tüvesid. Nii faagi T2 kui ka tema mutandi T2h laikude morfoloogia on sarnane. Kui aga segada kokku E. coli tüved B ja B/2, tekivad läbipaistvad laigud üksnes bakteri segakultuuri nakatamisel T2h-ga. T2-ga (T2h+) nakatamisel on faagilaigud hägused, sest see faagi tüvi on võimeline paljunema ainult algses E. coli tüves B, B/2 rakkude kasv saab toimuda aga ka seal, kus tüve B rakud on lüüsunud.

 

Geneetiline rekombinatsioon faagides.

 

1946-ndal aastal teatasid Delbrück ja Hershey geneetilise rekombinatsiooni toimumisest bakteriofaagidel. Nad nakatasid E. coli tüve kahe erineva faagi T2 tüvega – rh+ ja r+h (seda protseduuri nimetatakse faagide ristamiseks) ning seejärel nende järglaskonnaga bakteritüvede B ja B/2 segu. Faagide genoomide vahel oli toimunud geneetiline rekombinatsioon. Seda näitas faagilaikude morfoloogia. Genotüüp rh+ põhjustab suuri häguseid laike, r+h väikeseid ning läbipaistvaid. Lisaks kirjeldati ka suuri läbipaistvaid laike (genotüüp hr) ja ja väikeseid häguseid (genotüüp r+h+), mis saavad ilmneda ainult siis, kui genoomid on rekombineerunud. Rekombinante oli järglaskonnas 2%, mis näitab, et geenid h ja r paiknevad T2 geneetilisel kaardil teineteisest 2 ühiku kaugusel. Faagide genoomidevaheline rekombinatsioon võib aset leida suvalisel hetkel faagi elutsükli vältel, kui genoom pole pakitud kapsiidi.

 

Faagi geenide peenstruktuur.

 

50-ndate aastate keskel hoogustus faagide geenistruktuuri uurimine. Seymor Benzer kaardistas faagi T4  rII lookuse mutatsioone kahes järjestikku paiknevas geenis rIIA ja rIIB. rII mutandid põhjustasid suurte terava servaga faagilaikude teket. Algse faagitüve puhul olid laigud jälle väiksemad ning säbruliste servadega. rII mutandid tekkisid algsest tüvest spontaanselt, sagedusega 1/100 000 kohta. Mutatsioonisagedust oli võimalik kemikaalide ja UV-kiirguse toimel tõsta. Erinevalt algsest T4 faagist polnud rII mutandid võimelised paljunema E. coli tüves K12. E. coli tüvi B võimaldas aga paljuneda nii algsel kui ka mutantsel faagil. Benzer ristas 2 erinevat rII mutanti E. coli tüve B rakkudes ja analüüsis järglaskonda tüve K12 nakatamisvõime suhtes. Rekombinatsiooni tulemusena tekkis väga madala sagedusega (10-6) variante, kus rII lookuses oli taastunud algne DNA järjestus (olid võimelised paljunema tüves K12) ja topeltmutante. Rekombinatsioonisagedus oli madal seetõttu, kuna mutatsioonikohad geneetilisel kaardil paiknesid väga lähestikku, kahes kõrvutiasuvas geenis. Juhul, kui kindla faagi kogusega nakatamisel ilmus K12 plaadile 2 faagi laiku, näitas see, et tegemist 4 rekombinandiga, millest 2 olid metsiktüüpi ning 2 topeltmutanti. Rekombinatsioonisageduse arvutamiseks on vaja eelnevalt teada, mitu baktereid nakatavat faagi (infektsiooniühikut) sisaldub ühes ruumalaühikus (seda nimetatakse faagi tiitri määramiseks). Kui algset faagipreparaati oli lahjendatud 107 korda ja kui sellega E. coli tüve B rakkude nakatamisel saadi 100 faagilaiku, siis algne preparaat sisaldas 109 faagi. Seega toimus rekombinatsioon kahe mutantse piirkonna vahel sagedusega 4x10-9. Antud juhul tuli arvestada ka võimalusega, et mutandid võisid spontaanselt metsiktüübiks reverteeruda. Seetõttu tuli leida ka spontaansete revertantide tekkesagedus ning see rekombinatsioonisagedusest maha arvutada.

 

Edaspidi täiustas Benzer metoodikat ning asus kaardistama deletsioonmutante, mis ei olnud võimelised spontaanselt metsiktüübiks reverteeruma. Kui mõlemal mutandil oli deletsioon samast piirkonnast, ei saanud rekombinatsiooni teel metsiktüüpi tekkida. Kahe mutandi ristamisel ilmnes metsiktüüp üksnes siis, kui deletsioonid ei kattunud. Nii sai erinevate mutantide ristamisel mutatsioonide asukohti geenis juba täpsemalt lokaliseerida. 2400 rII mutandi analüüsimisel lokaliseeriti kokku 308 erinevat mutatsioonisaiti. Samas leiti osades saitides mutatsioone sagedamini kui teistes. Neid saite hakati nimetama kuumadeks punktideks. Benzeri uuringud näitasid, et kõige väiksemaks mutatsiooniüksuseks on 1 aluspaar (bp) ning rekombinatsioon võib toimuda kahe külgneva aluspaari vahel. Tema tööd lükkasid ümber seni levinud seisukoha, nagu oleks geen jagamatu ja seega kõige väiksem mutatsiooni ja rekombinatsiooni üksus.

 

Miks on lineaarse kromosoomiga faagi geneetiline kaart esitatud rõngasmolekulina?

 

Erinevate faagimutantide ristamistel leitud rekombinatsioonisageduste põhjal koostatud geneetiline kaart viitas sellele, et T4 kromosoom on rõngasmolekul. Tegelikult on T faagide kromosoom lineaarne. Millest sellised vastuolulisena näivad tulemused? T4 genoom on 168000 bp suurune. Viriooni pakitud DNA molekulid sisaldavad 3 - 5% ulatuses terminaalseid kordusi. Lineaarse DNA replikatsioonil jäävad molekulide otstesse üksikahelalised alad. DNA replikatsioon toimub ainult ühes suunas (5’®3’) ning seetõttu jääb praimerialune ala lineaarse DNA molekuli otstes pärast täis sünteesimata (praimeriks on RNA ja see kõrvaldatakse DNA molekulist DNA sünteesi järgselt). Selleks, et üksikahelalistele regioonidele sünteesitaks komplementaarsed ahelad, moodustuvad konkatemeerid (sama genoomi lineaarsed kordused). Konkatemeeride lahtilõikamine toimub faagi genoomi kapsiidi pakkimisel konstantse nukleiinhappe pikkuse tagant (ületab genoomi täismahu). Seetõttu on T4 DNA molekulid oma otsmistelt järjestustelt redundantsed (sisaldavad samu järjestusi, näit. abcdefg....wxyzabc) ja  tsirkulaarselt permuteeritud (võivad alata suvalisest geenist, näit abcdef...xyzabc ja defghi...xyzabcdef jne.).

 

Lisaks geneetilistele katsetele kinnitasid T4 kromosoomi terminaalsete järjestuste redundantsust ja DNA molekulide tsirkulaarset permuteeritust hübridisatsioonikatsed. T4 DNA-d töödeldi 3’ eksonukleaasiga. Selle protsessi tulemusena tekkisid molekulid, mis sisaldasid mõlemas otsas üksikahelalisi järjestusi, mis olid komplementaarsed (kleepuvad otsad). Nende otste omavahelise hübridiseerumise tulemusena moodustusid DNA rõngasmolekulid, mida sai vaadelda elektronmikroskoobi abil. Juhul, kui faagi lineaarse genoomi otsad poleks olnud redundantsed, poleks rõngasmolekule üksikahelaliste otste hübridiseerumise tulemusena tekkida saanud. Viidi läbi ka sellised DNA hübridisatsioonikatsed, kus T4 kromosoomid kõigepealt denatureeriti, seejärel aga hübridiseeriti omavahel. Erinevatest DNA molekulidest pärinevate üksikahelate hübridiseerumise tulemusena tekkisid kaksikahelalised DNA rõngasmolekulid üksikahelaliste otstega. Kuna erinevad DNA molekulid sisaldasid erinevaid otsmisi kordusi, polnud omavahel juhuslikult hübridiseerunud DNA ahelate otsad komplementaarsed.

 

Bakteriofaagi FC174 genoom.

 

Faagi FC174 genoomiks on üksikahelaline DNA rõngasmolekul, mis koosneb 5386-st nukleotiidist. Kui arvestada keskmise valgu pikkuseks 400 aminohapet, ei saaks FC174 genoom kodeerida enam kui 4 – 5 valku. Tegelikult kodeerib FC174 genoom 11 erinevat valku. Seda võimaldab geenide kattuvus – erinevad valgud on kodeeritud sama DNA järjestuse poolt erinevates lugemisraamides. Valke kodeerivad lugemisraamid algavad erinevatest kohtadest, sõltuvalt initsiaatorkoodoni (AUG järjestus mRNA-s, TAC järjestus DNA molekulis) asukohast. Näiteks faagi FC174 geen E (rakkude lüüs) sisaldub geenis D (viiruspartikli assambleerumine). Need 2 geeni paiknevad erinevates lugemisraamides. Geen J, mille produkt on samuti viiruspartikli üks komponente, paikneb geeni D järjestuse kolmandas lugemisraamis. Geenide kattuvust on kirjeldatud ka teiste faagide genoomide korral.

 

Faagide heterosügootsus.

 

Faagi genoomiks on kas DNA või RNA molekul. Seega, kui mitte arvestada osade lineaarse genoomiga faagide DNA molekulide otstes asuvate geenijärjestuste redundantsust, sisaldab faagi genoom kõiki geene ühealleelsena. 1951. aastal juhtisid Hershey ja Chase tähelepanu sellele, et teatavatel juhtudel esineb ka faagide puhul heterosügootsus, mis väljendub näiteks faagilaikude morfoloogias – laigud on ebaühtlased, kirjud (ingl. k. “mottled plaques”). T2 r ja r+ faagide ristamisel tekitas järglaskond ka laike, millel esines samaaegselt nii metsiktüübi kui ka mutantse faagi laikude omadusi. Selline morfoloogia saab ilmneda ainult siis, kui mõlemad alleelid on korraga esindatud. Heterodupleksi moodustumine on DNA rekombinatsiooni üks vaheetappe. Faagide ristamisel võib r ja r+ molekulide rekombinatsiooni tulemusena r lookuses moodustuda heterodupleks, kus üks DNA ahel sisaldab r alleeli ning teine r+ alleeli. Heterodupleksit sisaldava DNA molekuli replikatsioonil toimub lahknemine, üks tütarmolekul kannab r ja teine r+ alleeli.

 

Eukarüootne viirus HIV.

 

1981. a. kirjeldati Los Angeleses ja New York'is homoseksuaalsetel meestel immuunpuudulikkusest põhjustatud haruldast kopsupõletiku vormi (haigustekitajaks parasiit Pneumocystis carinii, millega normaalne immuunsüsteem toime tuleb) ja Kaposi sarkoomi, mis on samuti haruldane haigus. Sündroomi hakati nimetama AIDS-iks (acquired immune deficiency syndrome). Haigust põhjustab viirus HIV (human immunodeficiency virus). Praeguseks on teada üle 30 miljoni HIV-ga nakatanu. Mõnes Aafrika riigis on nakatunud veerand täiskasvanud elanikkonnast.

 

HIV-i struktuur ja elutsükkel.

 

Viiruspartikkel on ikosaeedrilise kujuga. Kapsiid on kaetud lipiidse membraaniga (ümbrisega), millest ulatuvad välja pulgakommi-kujulised glükoproteiinid (koosnevad 41 kd suurusest tüviosast ja ja 120 kd peast - gp120). HIV-i genoomiks on 2 identset RNA molekuli, mis on koos pöördtranskriptaasiga pakitud valkkesta.

 

Infektsiooni algstaadiumis toimub HIV-i spetsiifiline seondumine gp120 valkude abil T helperrakkude membraanil asuvate CD4 retseptoritega. T helperrakkude funktsiooniks on aktiveerida teisi immuunsüsteemi rakke. Kui need rakud on hävitatud, "kukub kokku" ka organismi immuunsüsteem. CD4 retseptorid asuvad ka teist tüüpi immuunrakkudel, mida nimetatakse makrofaagideks. Kui HIV on rakuga seondunud, liitub tema membraan rakumembraaniga ja rakku siseneb RNA.

 

Genoomselt RNA molekulilt sünteesitakse pöördtranskriptaasi abil dsDNA molekul, mis integreerub integraasi abil raku genoomi. Integreerunud DNA-lt toimub peremeesraku RNA polümeraasi abil transkriptsioon, mille tulemusena saadakse nii mRNA kui ka genoomne RNA. Genoomselt RNA-lt DNA süntees on mitmeetapiline protsess, mille käigus sünteesitakse DNA molekuli otstesse pikad terminaalsed kordused LTR  (long terminal repeats) (vt. joonis 16.21). LTR-e on vaja viiruse genoomi integreerumiseks peremeesraku kromosoomi.

 

Viiruse RNA-lt esimese DNA ahela sünteesil (süntees algab molekuli keskelt) kasutatakse kõigepealt praimerina tRNA-d, mis on komplementaarne HIV RNA järjestusega PBS (primer binding site). Vastav tRNA on juba rakke nakatavates viiruspartiklites viiruse PBS-ga seondunud. Kui DNA süntees on jõudnud molekuli otsani, degradeerib ribonukleaas H (RNaas H) RNA-DNA dupleksist RNA. Seejärel toimub sünteesitud DNA 3' otsas asuva ja genoomse RNA 3' otsas asuva kordusjärjestuse R (repeated sequence) paardumine ning DNA süntees jätkub eelnevalt sünteesitud DNA 3' otsalt. Seejärel degradeerib RNaas H jällegi RNA-DNA dupleksist RNA, väljaarvatud spetsiifilise polü-puriin ala (koosneb peamiselt A-st ja G-st). Allesjäänud RNA järjestus on praimeriks teise DNA ahela sünteesil. Süntees toimub jällegi kaheetapiliselt, nii et algul sünteesitakse genoomist 3' pool, kõrvaldatakse RNA praimer ja tRNA ning seejärel toimub "hüpe". Teise DNA ahela 3' otsas olev PBS hübridiseerub temale komplementaarse PBS järjestusega esimese DNA ahela 3' otsas ja mõlemad käituvad praimeritena. Lõpptulemuseks on kaksikahelaline DNA, mille otstes on pikad kordusjärjestused LTR.

 

HIV-DNA integreerumisel raku genoomi tekitab endonukleaasse aktiivsusega integraas LTR-desse üksikahelalised katked, mille tulemusena tekivad "kleepuvad otsad", kus 3' otsad on 5' otstest lühemad (3' recessed ends). 3' otste kaudu atakeeritakse fosfodiestersidemeid märklaud-DNA-s ning seejärel moodustuvad uued fosfodiestersidemed HIV-DNA 3' otste ning ning peremeesraku genoomse DNA 5' fosfaatide vahel. Üksikahelalised alad täidetakse DNA reparatsiooniensüümide poolt ja lõpptulemusena on HIV-DNA peremeesraku genoomiga kovalentselt seotud. Integreerunud HIV genoom võib olla transkriptsiooniliselt kas inaktiivne või aktiivne. HIV genoomi aktivatsioonil osalevad nii viiruse kui ka peremeesraku valgud.

 

Kuna HIV-i genoomiks on RNA molekul, millelt sünteesitakse peremeesraku genoomi integreeruv DNA molekul, kuulub HIV retroviiruste klassi. HIV-i genoom sarnaneb teiste retroviiruste genoomidega:

                     gag - kapsiidivalgud

                     pol - pöördtranskriptaas, integraas ja ribonukleaas

                     env - ümbrises asuvad glükoproteiinid.

HIV-i genoomis on lisaks veel 6 geeni, mis kodeerivad regulatoorsete funktsioonidega valke. Geenidest väljapoole jäävad LTR järjestused, mis sisaldavad regulatoorseid elemente transkriptsioonifaktorite seondumiseks. Sarnaselt eelpoolkirjeldatud bakteriofaagile FC174 on ka HIV-i geenid kattuvad.

 

Kui inimene on nakatunud HIV-iga, järgneb sellele paarikuine akuutne faas, mille käigus nakatanul esineb palavikku, ta tunneb pea- ja lihasvalu. Sel ajal on haige veres palju HIV-i partikleid. Akuutse faasi järel sümptomid kaovad, partiklite arvukus veres langeb ning viirus lokaliseerub lümfisüsteemi. Latentne periood kestab 8-10 aastat ning sel ajal on organismi immuunsüsteem võimeline HIV-i partikleid hävitama. Lõppfaasis annab organismi immuunsüsteem alla. Selleks ajaks on 75% T helperitest hävinud.

 

Kuigi kuni tänaseni pole suudetud luua ravimeid AIDS-ist vabanemiseks, on võimalik haiguskulgu latentsusperioodi arvel pikendada. Selleks kasutatakse kombineerituna 3 ravimit. 2 neist, Epvir ja Retrovir inhibeerivad pöördtranskriptaasi, kolmas, Crixivan toimib proteaasi inhibiitorina. Proteaasi on vaja HIV-i primaarse translatsiooniprodukti lõikamisel individuaalseteks viirusvalkudeks. Kõiki neid ravimeid on vaja võtta regulaarselt 2-3 korda päevas. Kui ka üks ravimitest ära jätta, tõuseb viiruse hulk organismis kiiresti. Ravimid on kallid ning nende tarvitamine kutsub esile nõrkust, unetust ning iiveldustunnet.