LEONHARDI BLOGI: 08/18/23

reede, 18. august 2023

Reparatsioon ja rekombinatsioon

386Reparatsioon ja rekombinatsioon

XIII. REPARATSIOON JA REKOMBINATSIOON

1. DNA REPARATSIOON

1.1. DNA-KAHJUSTUSED

DNA-kahjustusi tekib pidevalt ja hulgaliselt nii rakkude sisekeskkonna (rakusiseste

protsesside) kui ka väliskeskkonna tegurite toimel. Hinnanguliselt arvatakse toimuvat

inimese igas rakus päevas kuni 1 miljon DNA-kahjustust, mis üldjuhul kõik ära paran-

datakse. Seda parandusprotsessi nimetatakse reparatsiooniks (ingl. reparation).

Mitteparandatud DNA-kahjustused võivad põhjustada raku hukkumist. Kahjustuse

ebatäpsel parandamisel kinnistub kahjustus muutusena, veana e. mutatsioonina (ingl.

mutation). Seega väljendavad mutatsioonid reparatsiooniprotsessi nõrkust.

1.1.1. DNA-d kahjustavad tegurid

Peamised DNA-d kahjustavad tegurid jaotuvad nelja gruppi:

1) oksüdatiivne stress;

2) kiirgused;

3) kemikaalid ja keskkonnategurid;

4) vead DNA replikatsiooniprotsessis.

Raku ainevahetusahelate vaheproduktidena moodustuvad keemiliselt aktiivsed, kuid

ebastabiilsed tugevalt reaktiivsed vabad hapniku radikaalid, mis põhjustavad oksü-

datiivset stressi (ingl. oxydative stress). Rakkudes on mehhanismid, mis lagundavad

või neutraliseerivad selliseid vaheühendeid. Kui seda ei suudeta teha, võivad tekkida

DNA-kahjustused, mis väljenduvad näiteks DNA lämmastikaluste oksüdeerimisena

(moodustub 8-oksü-7,8-dihüdroguaniin) või DNA üksikahelaliste katketena.

DNA-d kahjustavad nii ioniseeriv kiirgus (nt. gamma- ja röntgenikiirgus) kui ka

mit eioniseeriv kiirgus. UV-kiirgus (10–400 nm) on lühema lainepikkusega kui nähtav

valgus ning pikema lainepikkusega kui röntgenikiirgus. Ta on valdavalt mit eioniseeriv

elektromagnetiline kiirgus, mille väiksematel lainepikkustel (10–120 nm) esinev ioni-

seeriv toime blokeeritakse õhuhapniku poolt. Ioniseeriv kiirgus, mis põhjustab eelkõige

DNA kaksikahelalisi katkemisi, toimib pidevalt loodusliku radioaktiivse fooni tõttu,

mis on maakera eri piirkondades väga erinev. Mitteioniseerivast kiirgusest on olulisim Reparatsioon ja rekombinatsioon

387

juba nimetatud UV-kiirgus, mis põhjustab DNA-ahelas kõrvutiasetsevate pürimidii-

nide vahele ristsidemete moodustumist (sagedamini tümiini dimeeride T-T teke) ja nn.

6-4-fotoproduktide teket. UV lainepikkus ≈260 nm absorbeerub DNA-ga maksimaal-

selt, omades seega ka maksimaalset mõju. Tuntud on UV-lambid, mida kasutatakse õhus

olevate mikroobide hävitamiseks (nt. haiglaruumides).

DNA-kahjustuste tekkel on oluline siiski ka atmosfääri osoonikihti läbiv pikema lai-

nepikkusega UV-kiirgus (põhjustab nt. päikese käes naha punetust), kusjuures kõik üle

280 nm ja enamuse üle 315 nm lainepikkusega kiirgusest blokeerib tegelikult nimetatud

osoonikiht. Selge, et osoonikihi puudumine oleks elusorganismidele hävitav. Inimese

silm UV-kiirguse suuremaid lainepikkusi (violetne osa) otseselt ei erista, küll eristavad

seda putukad ja linnud. Selle spektriosa UV-kiirgus on inimesele nähtav kaudselt, sest

ta põhjustab paljude f uorestseeruvate materjalide helendumist, mida inimene näeb näh-

tavas valguses (390–750 nm). Pikalainelised f uorestsents-UV-lambid annavad lillakat

valgust. Nn. optiline aken võimaldab nähtaval valgusel tungida läbi atmosfääri ning et

sel puhul murdub sinise valguse lainepikkus rohkem, on keskpäevane taevas sinine.

Mutageense ja kantserogeense toimega on mitmesugused kemikaalid. Tuntuimad

olmekemikaalid on sigaretisuitsus ja praepanni kõrbenud rasvas olevad süsivesikud,

näiteks bensopüreenid. DNA-le mõjuvad ka paljud taimede ja mikroobide poolt moo-

dustatud ühendid, näiteks maapähklite seenhallituse korral moodustuvad alfatoksiinid.

Kemoteraapias kasutatavad keemilised ühendid on samuti kahjulikud, eriti need, mida

kasutatakse vähkkasvajate ravil. DNA-aluste hüdrolüüs ja kõrgendatud temperatuur

põhjustavad DNA nukleotiidipaaride lämmastikaluste eemaldumist teineteisest (kaksik-

ahelate lahtikeerdumist) või nende keemiliste omaduste muutumist.

Kõik DNA polümeraasid teevad töötamisel vigu, mille nad tavaliselt küll ise ära

parandavad. Erisugustel DNA polümeraasidel on vigade parandamise efektiivsus väga

erinev. Näiteks Y-perekonna prokarüootide DNA polümeraasid Pol IV ja Pol V on

võimelised toimima kahjustatud DNA matriitsil ning põhjustama vigade teket. Neid

polümeraase nimetatakse ka vea-aldisteks DNA polümeraasideks (ingl. error-prone

polymerases).

1.1.2. DNA-kahjustuste tüübid

Peamisi DNA-kahjustuste tüüpe on neli:

1) lämmastikaluste eemaldamine DNA-st;

2) nukleotiidide desamiinimine ja nukleotiidide valesti paardumine;

3) DNA-ahelate katkemine;

4) kovalentsete keemiliste ristsidemete teke (ahelasiseselt või -vaheliselt).

DNA lämmastikaluste hüdrolüüsil ei toimu DNA-ahelate selgroos (ingl. DNA backbone)

katkemist (DNA-niidid ei katke, -ahelad lähevad vaid teineteisest lahku). See-eest või-

dakse kõrvaldada DNA kaksikahela üksikute nukleotiidide koosseisust kas puriinalus

(A või G), kui toimub depuriinimine (ingl. depurination), või pürimidiinalus (T või C),

kui toimub depürimidiinimine (ingl. depyrimidination).

Kõiki nelja DNA lämmastikalust võidakse erinevates positsioonides ka kovalentselt

modif tseerida. Üheks sagedamaks juhuks on aminogrupi kaotamine e. desamiinimine

(ingl. deamination). Tsütosiini (C) desamiinimisel muudetakse ta uratsiiliks (U). DNA 388Reparatsioon ja rekombinatsioon

replikatsioonil võib DNA polümeraas läbi viia mit ekorrektse DNA korrektuuri e. redi-

geerimise (ingl. proof eading), põhjustades sellega DNA-ahelas mit epaarduvate (ingl.

mismatch) lämmastikaluste paaride teket. Tavajuhuks on tümiini (T) asemel ahelasse

uratsiili (U) lülitamine, ehkki U on tavaliselt RNA koosseisus.

DNA-ahelate selgroo katkemisi võib et e tulla nii üksikahelates (ingl. single-strand

break, SSB) kui ka kaksikahelates (ingl. double-strand break, DSB). DNA-ahelate katke-

mise iseloomulikuks põhjuseks on kiirgused, kuid ka mõningad kemikaalid.

DNA-s võivad moodustuda lämmastikaluste vahele ebaharilikud kovalentsed

ristsidemeid (ingl. crosslinks). See protsess võib toimuda nii samas DNA-ahelas e.

ahelasiseselt (ingl. intrastrand) kui ka DNA-ahela ning tema vastasahela vahel (ingl.

inter strand). Ahelasisestest ristsidemetest on tuntumad pürimidiini dimeeride vahelised

kovalentsed sidemed ning DNA nukleotiidide ristsidemed valkudega (nt. lämmastikus-

happe, formaldehüüdi jms. kemikaalide toimel). Ahelatevahelisi ristsidemeid põhjustavad

näiteks alküülivad ühendid ja sinepigaas (kasutatakse kemoteraapias), kus guaniini läm-

mastiku N7-asendis moodustuvad kovalentsed sidemed DNA vastasahelaga.

Meeldejätmiseks

• DNA-d kahjustavateks teguriteks on oksüdatiivne stress, kiirgused, keskkonna keemilised ja füüsikalised

tegurid ning DNA replikatsiooniprotsessi ebaefektiivsus.

• Põhilised DNA-kahjustuste tüübid on DNA-ahelast lämmastikaluste kõrvaldamine või nende desamiini-

mine, lämmastikaluste valepaardumine, üksik- ja kaksikahelalised katkemised ning ahelasiseste ning

-vaheliste kovalentsete keemiliste ristsidemete teke.

1.2. REPARATSIOONI TÜÜBID

Protsesse, mis võimaldavad kõrvaldada DNA-st kahjustusi, nimetatakse DNA paranda-

miseks (ingl. DNA repair) e. reparatsiooniks. Selleks, et hoida mutatsioonide hulk väike,

on elusorganismidel välja kujunenud rida mitmesuguseid reparatsioonimehhanisme,

mille funktsiooniks on DNA defektide parandamine ja organismide geneetilise infor-

matsiooni muutumatul kujul säilitamine ning selle edasikandumine läbi sugurakkude

järgnevatele põlvkondadele. DNA reparatsioonirajad on erisuguste DNA-kahjustuste

tüüpide puhul erinevad. Siiski esineb ka mõningane kattuvus, olukord, kus erinevad DNA parandusprotsessid kulgevad samal ajal.

DNA reparatsioon jaotub kaheks alaosaks, sõltuvalt sellest, kas DNA-ahelad on kat-

kenud või mit e:

1) kahjustatud või valede lämmastikaluste reparatsioon;

2) DNA-ahelate katkemiskohtade reparatsioon.

DNA reparatsioonimehhanismid jaotuvad kolmeks põhitüübiks:

1. Otsesed keemilised pöördreaktsioonid (ingl. direct chemical reversal), kus muu-

tuste tekke kohal toimub konkreetsete spetsiif liste kahjustuste kõrvaldamine ja

algse oleku taastumine (nt. T-T-dimeeride kõrvaldamine).

Reparatsioon ja rekombinatsioon

389

2. Kahjustuse kõrvaldamine väljalõikega e. ekstsisioonreparatsiooniga (ingl.

excision repair) tähendab DNA parandamist, kus kahjustatud lämmastikalused

kõrvaldatakse esmalt väljalõikega ning väljalõigatud osa asendatakse järgnevalt

õigega lokaalsel DNA sünteesil. Väljalõikega reparatsioonimehhanisme on kolm:

2.1. lämmastikaluste väljalõige e. BER (ingl. base excision repair, BER) repa-

ratsioon;

2.2. nukleotiidide väljalõige e. NER (ingl. nucleotide excision repair, NER)

reparatsioon;

2.3. valepaardumise reparatsioon e. MMR (ingl. mismatch repair, MMR).

3. Rekombinatsioonisõltuv reparatsioon (ingl. recombination-dependent repair),

mis toimub tegelikult kahe erisuguse mehhanismi alusel:

3.1. homoloogne rekombinatsioon e. HR (ingl. homologous recombination);

3.2. mit ehomoloogne DNA otste ühendamine e. NHEJ (ingl. non-homolo-

gous end joining).

Väljalõikereparatsiooni e. ekstsisioonreparatsiooni mehhanismid on evolutsiooniliselt

konserveerunud, olles põhimõt eliselt samased bakteritest imetajateni. Väljalõikerepa-

ratsioonil toimub DNA-kahjustuse kõrvaldamine kolmes etapis.

1. DNA reparatsiooniline endonukleaas või endonukleaasi sisaldav ensüümikomp-

leks tunneb kahjustatud N-aluse(d) või nukleotiidi(d) ära, seondub nendega ja

lõikab nad DNA-st välja.

2. Moodustunud tühikusse sünteesitakse DNA polümeraasi abil normaalsed

N-alused või nukleotiidid, kasutades matriitsina komplementaarset DNA-ahe-

lat.

3. DNA ligaas ühendab uuestisünteesitud DNA-lõigu intaktseks kõrvaloleva DNA-

ahela otsaga.

Reparatsioonisüsteemid on üldiselt väga täpsed. Täpsus nõuab aga vahendeid (energia-

kulu). Kui rakk on väga tugevalt kahjustatud, siis peab ta võitlema vaid selle eest, et ellu

jääda ning vigade täpne parandamine ei ole enam kõige olulisem. Kõigest hoolimata peab

toimuma aga geneetilise materjali paljundamine tütarrakkude vahel. Niisuguses situat-

sioonis käivitub bakterites hädaabivastus e. SOS-vastus (ingl. SOS responce), millega

kaasneb vigaderohke DNA süntees kahjustatud DNA-lt. Seda teostavad prokarüootidel

veaaltid (ingl. error-prone) DNA polümeraasid Pol IV ja Pol V.

Kui reparatsioonis osalevad mõningad reparatsioonigeenid on defektsed, siis DNA-

kahjustusi ei parandata ning sellega kaasneb mutatsioonitaseme oluline tõus. Inimesel on

teada kümneid reparatsiooni puudulikkusega seotud pärilikke haiguseid, mida põhjusta-

vad päritavad reparatsioonivead. Tuntuimaks näiteks on xeroderma pigmentosum, kus

inimesel ei parandata UV-kiirgusest tekkinud kahjustusi, mistõt u neil inimestel areneb

tavaliselt juba lapseeas välja nahakasvaja.

1.2.1. Reparatsioon keemiliste pöördreaktsioonidega

Vea tekke kohal toimuv kahjustuste parandamine otseste keemiliste pöördreaktsiooni-

dega toimub vaid spetsiif liselt ja kindlate kahjustuste eemaldamisel. Selliseks juhuks on

näiteks tümiini (T-T) dimeeride või teiste 6-4-fotoproduktide parandamine spetsiif liste

390Reparatsioon ja rekombinatsioon

ensüümide kaasabil. Niisugust reparatsiooniprotsessi nimetatakse DNA valgustund-

likuks reparatsiooniks (ingl. light-dependent repair) e. fotoreaktivatsiooniks (ingl.

photoreactivation), sest see toimub valguse poolt aktiveeritava ensüümi DNA-fotolüaasi

(ingl. DNA photolyase) toimel. UV-kiirguse mõjul moodustunud pürimidiindimeerid

tunneb ära fotolüaas, mis on kodeeritud phr-geenide poolt. Ensüüm aktiveerub vaid

sinise lainepikkusega valguse (440–490 nm) toimel. Aktiveeritud ensüüm kõrvaldab

tümiini dimeeride, tsütosiini dimeeride ja tsütosiini-tümiini dimeeride vahelised kova-

lentsed sidemed ning taastab kiirguseelse olukorra (jn. 13.1). Kui me aga soovimegi

saada UV-kiirguse toimel mutatsioone, siis tuleb rakke pärast kiiritamist hoida vähemalt

mõne põlvkonna vältel pimedas, et kahjustusi ei repareeritaks ning vead kinnistuksid, s.t.

tekiksid mutatsioonid. Fotolüaasi on leitud bakterites, pärmides, äädikakärbses, kannus-

konnas, kuid mit e imetajates.

Fotodimeer

Tümiin Tümiin UV-

kiirgus

Fotolüaas +

sinine valgus

T T

A A

T=T

A A

T=T

A A

T T

A A

T T

A A

Tümiini dimeer

Fotolüaas seondub

Sinine valgus

Ristsideme katke

Ensüümi vabanemine

A B

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

Fotolüaas

Joonis 13.1. Fotoreaktivatsioon (DNA valgustundlik reparatsioon): tümiini dimeeride vaheliste ristsidemete

katkemine valgus-aktiveeritud fotolüaasiga. A – fotoreaktivatsiooni toimumine DNA-ahelas. B – fotodimee-

ride teke ja lagunemine.

Üheks kõige sagedamaks punktmutatsioonide tekke põhjuseks on alküülimine (ingl.

alkylating), näiteks metüülgrupi (-CH3

) spontaanne lisandumine tsütosiinile (C) koos

järgneva desamiinimise ja tümiini (T) moodustumisega. Õnneks kõrvaldatakse enamik

selliseid muutuseid monofunktsionaalsete DNA glükosülaaside (ingl. monofunctional Reparatsioon ja rekombinatsioon

391

DNA glycosylases) abil. Nendel ensüümidel on ainult glükosülaasne aktiivsus ja nad kõr-

valdavad mit epaardunud T ning taastavad algse C. Protsessis ei põhjustata DNA selgroos

katkete teket.

Otsese keemilise pöördreaktsiooniga on võimalik parandada ka vigu guaniin aluste

metüülimises. Metüülguaniini parandab metüülguaniini metüültransferaas (ingl.

methylguanine methyltransferase) (MGMT-geeni produkt), mis peale reaktsiooni toi-

mumist inaktiveerub. Seepärast vajab iga metüülgrupi kõrvaldamise reaktsioon üht

ensüümimolekuli. O6

-metüülguaniin (ingl. O6

-methylguanine) on teatavasti geneetili-

selt väga ohtlik lämmastikaluse modif katsioon, sest see modif tseeritud nukleotiid võib

edukalt paarduda nii C- kui ka T-nukleotiididega, kuid DNA replikatsiooni käigus lülitab

DNA polümeraas vastasahelasse üksnes T-nukleotiidi, millega põhjustatakse mutatsiooni

teke.

1.2.2. Lämmastikaluste väljalõikereparatsioon

Lämmastikaluste väljalõikereparatsiooni (BER – ingl. base excision repair) käigus

eemaldatakse DNA-ahelast üksik kahjustatud nukleotiid ning asendatakse õigega. Arva-

takse, et igas meie keharakus toimub sellist tüüpi reparatsioone ühes päevas ca 20 000

korda. BER-i alustavateks ensüümideks on erinevate geenide poolt määratud DNA

glükosülaasid (ingl. DNA glycosylases), mis leiavad DNA-s esinevad valed N-alused

(oksüdeeritud, alküülitud, hüdroksüülitud või desamiinitud) ning osalevad nende välja-

vahetamisel.

DNA glükosülaas katkestab vale N-aluse ja 2-desoksüriboosi vahelise glükosiidsi-

deme, põhjustades apuriinse või apürimidiinse saidi e. AP-saidi (ingl. AP sites) tekke

ning N-aluse vabanemise. DNA-ahela suhkur-fosfaat-selgroog jääb selles etapis intakt-

seks. Glükosülaase on kahte tüüpi. Enamik glükosülaase on monofunktsionaalsed ja neil

on vaid glükosülaasne aktiivsus. Bifunktsionaalsetel komplekssetel glükosülaasidel on

lisaks veel 3´ - 5´-eksonukleaasne AP-lüaasi (ingl. AP lyase) aktiivsus. Sõltumata sellest,

kas DNA glükosülaasil on või pole lüaasset aktiivsust, katalüüsib N-aluste väljalõike-

reparatsiooni järgmist etappi ensüüm AP-endonukleaas (ingl. AP endonuclease), mis

põhjustab AP-saidi 5´-otsas DNA selgroos DNA üksikahelalise katke ning vaba 3´-OH-

otsa tekke. Üllatavalt on AP-endonukleaasil lisaks ka 3´- 5´-eksonukleaasne aktiivsus.

Edasi sünteesitakse 3`-OH-otsast lähtuvalt DNA polümeraasi abil DNA AP-sait täis ning

ahel muudetakse DNA ligaasi toimel intaktseks. Vaatleme kahte näidet.

Tsütosiini desamiinimisel tekib uratsiil. Valestipaardunud nukleotiidile (U) seon-

dub DNA glükosülaas ja lõikab U välja, põhjustades AP-saidi tekke (jn. 13.2). Uratsiili

DNA glükosülaas on väga spetsiif line, kõrvaldades ahelast vaid uratsiili ning tal pole

AP-endonukleaasset aktiivsust. AP-saidi tunneb ära teine ensüüm, AP-endonukleaas, mis

toimib koos fosfodiesteraasiga (ingl. phosphodiesterase), et kõrvaldada saidist suhkur-fos-

faatgrupid, ning mille tulemusel DNA kaksikahelas üks ahel katkeb. Järgnevalt lisab DNA

polümeraas puuduvad nukleotiidid juba komplementaarses ahelas sisalduva info põhjal.

Lõpuks seob DNA ligaas DNA-ahela otsad kokku.

Guaniini oksüdeerimisel moodustub 8-hüdroksüguaniin (GO) (ingl. 8-hydroxy

guanine). Selliseid kahjustusi tekib ka normaalses raku ainevahetusprotsesside käi-

gus, sest kahjustusi põhjustavaid vabu hapnikuradikaale tekib elektroni transpordil,

peroksüdatsiooniprotsessides jms. Niisuguste kahjustuste kõrvaldamist nimetatakse Reparatsioon ja rekombinatsioon

393

GO-reparatsiooniks (ingl. GO repair). Põhiliselt vastutavad E. coli rakkudes GO-repa-

ratsiooni eest kolm valku (MutM, MutT, MutY). MutT on ennetava funktsiooniga, sest ta

lagundab rakkudes GO-d. MutM ja MutY on glükosülaasid. MutM kõrvaldab DNA-ahe-

last GO, mutY kõrvaldab aga valesti paardunud A paarist A:G või A:GO.

1.2.3. Nukleotiidide väljalõikereparatsioon

Nukleotiidide väljalõikereparatsioon e. ekstsisioonreparatsioon (NER) erineb läm-

mastikaluste väljalõikereparatsioonist (BER) rea omaduste poolest.

1. Kasutatakse erinevaid ensüüme.

2. Isegi üksiku vale N-aluse väljalõikeks haaratakse NER-i puhul DNA-kahjustu-

sest mõlemalt poolt (kahele poole samas ahelas lähtuvalt kahjustusest) kaasa rida

nukleotiide.

3. Kahjustatud DNA-ahelasse tekitatakse NER-i puhul kahjustatud ala lokaliseeri-

miseks katked kahjustusest nii 3´- kui ka 5´-suunas.

Bakterite ja eukarüootide NER-mehhanismid on sarnased, kuid eukarüootidel osaleb

protsessis palju rohkem erinevaid valke.

E. coli DNA nukleotiidide ekstsisioonreparatsioon teostatakse UvrABC endonuk-

leaasse ensüümkompleksi toimel, mis koosneb tegelikult neljast Uvr-valgust: UvrA,

UvrB, UbrC ja DNA helikaas II (e. UvrD). NER toimib näiteks tümiini dimeeride kõr-

valdamisel (jn. 13.3). Esmalt skaneerib UvrA-UvrB-kompleks DNA-l vigu ning kui UvrA

tunneb ära DNA-heeliksis näiteks tümiini dimeeri, siis UvrA vabaneb ning UvrB sulatab

lahti DNA-ahelatevahelised H-sidemed. Edasi ühineb UvrC-valk UvrB-DNA-komp-

leksiga ning moodustunud kompleksis põhjustab endonukleaas UvrC katkete tekke 8

nukleotiidi kaugusel kahjustuse 5´-otsast ja 4 nukleotiidi kaugusel kahjustuse 3´-otsast.

Tekitatakse 12-nukleotiidiline üksikahelaline ala e. 12-mer (ingl. 12 mer), mis kõrval-

datakse DNA-st DNA helikaasi II toimel. Järgnevalt sünteesib DNA polümeraas Pol I

tühiku täis (kasutades matriitsina komplementaarset ahelat) ja DNA ligaas ühendab

DNA-ahelad.

Eukarüootidel jaotatakse NER kahte klassi.

1. Transkriptsiooniseoseline reparatsioon e. TCR (ingl. transcription-coupled

repair), mis aktiveerub siis, kui RNA polümeraas jääb transkribeeritaval DNA-

ahelal seisma.

2. Globaalne genoomne reparatsioon e. GGR (ingl. global genome repair), mis

toimub transkriptsioonist sõltumatult ning parandab vigu ka transkribeeritava

geeni mit ekodeerivas DNA-ahelas.

TCR-i ja GGR-i erinevus seisneb eelkõige selles, kuidas avastatakse erinevate valgukomp-

leksidega DNA vigastusi. Pärast vigastuse avastamist, järgmises etapis, on nii TCG kui

ka GGR-i puhul vaja kohale tuua eukarüootne transkriptsioonifaktor TRIIH. TFIIH on

10 alaüksusest koosnev valgukompleks, kus asub ka DNA helikaas, mille toimel avatakse

DNA vigastatud piirkonnas DNA-ahelad. Inimesel on kõrvaldatav ala 24–32 bp pikkune

ja tühik täidetakse DNA polümeraasi (kas δ või ε) poolt ning DNA ligaas ühendab lõpuks

DNA-ahelad.

392Reparatsioon ja rekombinatsioon

AP sait

Tsütosiini desamiinimine

Uratsiili seondamine

DNA glükosülaasiga

Uratsiili väljalõikamine

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

Glükosülaas

3´

5´

3´

5´

3´ Suhkurfosfaatgrupi

kõrvaldamine AP-endonukleaasi

ja fosfodiesteraasiga

Puuduv nukleotiid

3´

5´

Üksikahelaline katke

DNA polümeraas

DNA ligaas

3´

5´

3´

Repareeritud sait

5´

3´

Joonis 13.2. DNA ekstsisioonreparatsioon: N-aluste kõrvaldamise ahel.

394Reparatsioon ja rekombinatsioon

12-mer

DNA polümeraas I sünteesib

tühiku täis, kasutades

matriitsina komplementaarset

DNA-ahelat, ning DNA ligaas

ühendab üksikkatked.

Tümiini dimeer

3´

5´

3´

Valguline trimeer (2 koopiat

UvrA- ja 1 koopia UvrB-valku)

tunnevad ära ja seonduvad

kahjustatud DNA-ga

Asendatud 12 nukleotiidi

ATP

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´ B

3´

5´

3´

A A

3´

5´

3´

POL I

3´

5´

3´

3´-katke 5´-katke

A A

ADP + Pi

A A

ATP

ADP + Pi

ATP energiaga painutatakse

DNA-d ja muudetakse UvrB-

valgu konformatsiooni ning

UvrA dimeer vabaneb

UvrC-valk seondub

UvrB-DNA-ga ja põhjustab

3´- ja 5´-katkete teket

ATP energia abil vabastab

UvrD helikaas

väljalõigatava oligomeeri

(12-mer) ning vabastab

ka UvrC-valgu

Ekstsinukleaasne aktiivsus

DNA polümeraas I

asendab UvrB-valgu

Joonis 13.3. DNA ekstsisioonreparatsioon: nukleotiidide väljalõikamine. Ekstsinukleaasse aktiivsuse avaldumiseks (E. coli´ l 12 nukleotiidi väljalõikamine) on vaja kolme

geeni (uvrA, uvrB, uvrC) produkte. Funktsionaalse DNA moodustumiseks on vajalikud veel DNA polümeraas Pol I ja DNA ligaas.

Reparatsioon ja rekombinatsioon

395

1.2.4. Valepaardumisega reparatsioon

DNA polümeraasil on korrektsiooniline e. redigeerimisaktiivsus (ingl. proof eading

activity), mis tähendab, et tema koosseisus olev 3´→5´-eksonukleaasne aktiivsus kõrvaldab

kasvava ahela 3´-otsast valesti paardunud nukleotiidid. Sellele replikatiivsele korrek-

tuurile sekundeerib teine, replikatsioonijärgse DNA reparatsiooni toimemehhanism,

mida nimetatakse valepaardumise reparatsiooniks (MMR). Nii parandatakse paar-

dumisvead, mis jäid DNA-sse pärast replikatsiooni. Replikatsiooni käigus võib tekkida

mikroinsertsioone või -deletsioone, mille tagajärjel on uues ahelas mõni nukleotiid üle või

puudu. Eriti lihtsalt tekivad sellised vead 1–2-nukleotiidilisi korduseid sisaldavate DNA

piirkondade replikatsioonil. Lisaks võidakse DNA sünteesi vigade tõt u lülitada DNA-sse

mit ekomplementaarseid nukleotiide. Näiteks lülitatakse nukleotiidi T vastu vastasahelas

nukleotiid G. Kuna normaalsele DNA-le on iseloomulikud ka valepaardumisi põhjusta-

vad nukleotiidid, peab olema spetsiif line reparatsioonisüsteem, mis suudaks eristada

uut DNA-ahelat vanast matriitsahelast. E. coli bakterites on see võimalik tänu sellele, et

vana DNA-ahel on metüülitud, uus aga veel mit e. E. coli´s metüülitakse A kindla inter-

valliga pärast replikatsiooni järjestuses GATC Dam-metülaasi (ingl. Dam methylase)

poolt. Valepaardumise reparatsioonisüsteem kasutab ära seda, et hemimetüülitud (ingl.

hemimethylated) olekus (vana DNA-ahel on metüülitud, uus aga veel mit e) kõrvaldatakse

mit emetüülitud ahela valestipaardunud nukleotiid(id) koos külgnevate nukleotiididega

ja nende asemele sünteesitakse uus DNA-lõik, kasutades matriitsina metüülitud ahela

nukleotiidset järjestust.

E. coli´s on valepaardumisega reparatsioonil (MMR) vajalikud nelja geeni, mutH,

mutL, mutS ja mutU (=uvrD) produktid. Mit epaardunud alaga metüülitud DNA-ahelaga

ühineb otseselt MutS, seejärel ühineb moodustunud kompleksiga MutL. MutS ja MutL

aktiveerivad GATC-spetsiif lise endonukleaasi MutH (ingl. GATC-specif c endunucle-

ase), mis teeb mit emetüülitud DNA-ahelasse katke valepaardumisest kas 3´- või 5´-suunas

(jn. 13.4). Sõltuvalt GATC-järjestuse kaugusest mit epaardunud nukleotiidide suhtes võib

katke toimuda valepaardumisest isegi rohkem kui 1000 nukleotiidi kaugusel. Kui sisselõige

tehti GATC-järjestusest paardumisvea suhtes 5´-suunaliselt, kõrvaldatakse nukleotiidid

DNA-ahelast 5´→3´ eksonukleaasi, näiteks eksonukleaas VII abil. Kui sisselõige toimus

aga paardumisveast 3´-suunas, siis vajatakse 3´→5´ eksonukleaasset aktiivsust, näiteks E. coli

eksonukleaasi I. Nukleotiidide kõrvaldamisel uuest, mit emetüülitud DNA-ahelast osaleb

ka DNA helikaas II (UvrD). Seejärel sünteesitakse üle 1000-nukleotiidine tühik täis DNA

polümeraas III poolt ning DNA-ahela otsad liidetakse DNA ligaasi toimel.

Bakterite M MR-geenide homolooge on k irjeldatud ka seentel, loomadel ja

imetajatel. See näitab, et valepaardumisega reparatsioon on kõrgkonserveerunud

universaalne mehhanism kontrollimaks geneetilise informatsiooni säilimist kaksikahe-

lalises DNA-s. Inimesel soodustab MMR subtüüpide defektsus päriliku mit epolüüpse

käärsoole-pärasoolevähi e. HNPCC (ingl. hereditary nonpolyposis colorectal cancer), soole-

(nt. Muir-Torre sündroom), nahavähi ja ka teiste vähivormide teket.

1.2.5. Rekombinatsiooniline reparatsioon

Lisaks eespoolkirjeldatud DNA reparatsioonisüsteemidele võib kahjustuste kõrvaldamine

toimuda ka rekombinatsioonisõltuva reparatsiooni (ingl. recombination-dependent repair)

abil. DNA üksikahelaliste ja kaksikahelaliste katkete parandamine toimub kahel viisil.

396Reparatsioon ja rekombinatsioon

MutS

CH3

3´

5´

3´

GATC GATC

CH3 Vanemahel

Tütarahel

A-metüülgrupid GATC-saidis eristavad

DNA vanemahelat tütarahelast

Valepaardunud

nukleotiid

CH3

3´

5´

3´

GATC GATC

CH3

3´

5´

3´

GATC GATC

CH3

MutH

MutL

MutL-

MutS MutH- MutL

MutS MutH

ATP ADP + Pi

CH3

3´

5´

3´

GATC GATC

CH3

3´

5´

3´

GATC GATC

CH3 CH3

3´

5´

3´

GATC GATC

CH3

Asendatud

nukleotiidid

MutSHL reparatsioonisüsteem

tunneb ära valepaardunud

nukleotiidi ja seondub sellele

MutH liigub mööda DNA-d

kuni vanemahela metüülitud

N-aluseni, seondub DNA-le

ning MutL seondub MutS ja

MutH-ga

MutH teeb katke mitte-

metüülitud ahelasse

Helikaas II + üksikahelaline

eksonukleaas kõrvaldavad

DNA-segmendi DNA polümeraas I täidab tühiku õigete nukleotiididega

ja DNA ligaas ühendab

ahelad

Tütarahel metüülitakse

CH3

Joonis 13.4. Valepaardumisega reparatsioon E. coli`s. MutSHL reparatsioonisüsteem (MutS, MutH, MutL) tunneb ära DNA metülatsioonikohad. MutH sisaldab spetsiif list

GATC-endonukleaasset aktiivsust (ahelasse tehakse katke). DNA helikaas II on MutU valk.

Reparatsioon ja rekombinatsioon

397

1. Homoloogne rekombinatsioon e. HR (ingl. homologous recombination), mille

puhul kaksikahelaline katkekoht taastatakse täielikult homoloogse kromosoomi,

tütarkromatiidi või mingi teise homoloogse DNA kaasabil ilma mutatsioonideta.

2. Mit ehomoloogsete DNA-otste ühendamine e. NHEJ (ingl. non-homologous

end joining). Selle korral liidab DNA ligaas katkenud ahelad, kuid isegi lühikeste

üksikahelaliste homoloogiate esinemisel põhjustatakse siin mutatsioonide teke

(eriti lühikesed deletsioonid). Raku seisukohalt on see siiski parem variant kui

jät a DNA otsad üldse ühendamata.

HR on iseloomulik prokarüootidele, kuid toimub ka eukarüootide rakutsükli S- ja G2

-faa-

sides. Kui E. coli DNA polümeraas III jõuab DNA replikatsioonil matriitsahelas asuva

kahjustuseni, näiteks tümidiini dimeerini (ingl. thymine dimer), siis võib DNA süntees

sellest kohast katkeda ja jätkuda kaugemalt. Kui DNA-s viga ei parandata, tekib järgmise

DNA replikatsiooni tulemusena selles kohas juba DNA kaksikahelaline katke, DSB

(ingl. double strand break, DSB). DSB-d parandatakse homoloogse rekombinatsiooni teel,

kus osalevad RecA-valk ning RecBCD-kompleks. RecA-valk aktiveerub kokkupuutes

üksikahelalise DNA-ga, ssDNA (ingl. single strand DNA, ssDNA) ning viib üksteisega

kontakti homoloogsed DNA-ahelad, mis asuvad erinevates DNA-molekulides, nii et

Tümiini dimeer

RecA-valk

Endonukleaasne katke

T=T

5´

3´

5´

T=T

5´

3´

5´

3´

5´

5´ 3´

3´ 5´

T=T

3´ 5´

5´ 3´

3´ 5´

T=T

3´ 5´

5´ 3´

3´ 5´

T=T

3´ 5´

5´ 3´

Endonukleaasne katke

DNA polümeraas

DNA ligaas

DNA replikatsioon

Joonis 13.5. RecA-sõltuv rekombinatsiooniline reparatsioon prokarüootidel (üksikahelalised katkemised).

RecA-valk aktiveerub üksikahelalise DNA (ssDNA) toimel DNA üksik- või kaksikahelalise katkemise

korral. RecA katalüüsib DNA-ahelate vahetust homoloogsete DNA piirkondade vahel. Tümiini dimeeri ei

kõrvaldata, kuid saavutatakse ülejäänud DNA täpne replikatsioon.

398Reparatsioon ja rekombinatsioon

kahjustamata ahel ühest DNA-molekulist oleks DNA sünteesil matriitsiks katket sisalda-

vale ahelale teisest DNA-molekulist (jn. 13.5). Selleks, et katketega DNA-molekuli ahelad

eralduksid teineteisest ning saaksid paarduda teise, intaktse DNA-molekuli homoloog-

sete ahelatega, on vajalik RecBCD-kompleksi aktiivsus. RecBCD-kompleksil on lisaks

nukleaassele aktiivsusele ka helikaasne aktiivsus, mis võimaldab üksikahelalise ala teket

ning mis on vajalik DNA-dupleksi moodustumiseks homoloogse alaga teises DNA-

molekulis. Rekombinatsiooni käigus toimub homoloogselt DNA matriitsilt DNA süntees

DNA polümeraasi (enamasti DNA Pol III) vahendusel.

DNA üksikahelaliste katkete (ingl. single strand break, SSB) puhul katalüüsib

homoloogseks rekombinatsiooniks vajalikku üksikahelate teket RecFOR-kompleks.

Eukarüootidel on RecA-valgu homoloogiks Rad51, mis vahendab ühe tütarkromatiidi

kaksikahelalise katkenud DNA-ahela paardumist teises kromatiidis paikneva terve homo-

loogse ahelaga (jn. 13.6). Järgneb DNA süntees, kus matriitsina kasutatakse tervet ahelat.

Homoloogsest rekombinatsioonist tuleb detailsemalt jut u käesoleva peatüki alaosas 2.

NHEJ toimib sagedamini eukarüootide rakutsükli G2

-faasis. NHEJ toimumiseks on

vajalik, et katkenud DNA otsad oleksid teineteise lähedal. Katkenud DNA otsi tunneb

ära kahest valgust moodustunud kompleks Ku, mis koosneb alaüksustest Ku70 ja Ku80.

Järgmisena seondub DNA otstega DNA-sõltuv proteiinkinaas e. DNA-PK (ingl. DNA

dependent protein kinase). DNA-PK seondub ka nukleaasiga, mis on vajalik DNA otstest

mõnede nukleotiidide eemaldamiseks ning DNA otstes lokaalse homoloogia leidmiseks,

näiteks DNA lühikeste kordusjärjestuste puhul. DNA-PK-Ku-kompleksiga ühineb DNA

ligaas IV, mis ühendab DNA vabad otsad. Kordusjärjestuste olemasolu ongi peamiseks

põhjuseks, miks rakud parandavad kaksikahelalisi DNA katkeid NHEJ abil, riskides

seejuures geneetilise informatsiooni muutumisega. DNA kaksikahelate ühendamine

on ülimalt tähtis ka antikehade varieeruvate piirkondade reassambleerimisel ja V(D)

J-ühendpiirkondade tekkel. On näidatud, et Ku80 nokauditud hiired pole võimelised

parandama kaksikahelalist DNA katket.

1.2.6. SOS-vastus ja vea-aldis DNA süntees kahjustatud DNA-lt

Bakteritel käivitub DNA-kahjustuste korral, mida põhjustavad näiteks UV-kiirgus ja

mitmed mutageensed kemikaalid, SOS-vastus (ingl. SOS response). SOS-vastust on

põhjalikult uuritud bakteris E. coli. E. coli’s indutseeritakse SOS-vastuse korral mitmed

DNA reparatsioonivalgud, mis osalevad kas NER-is või homoloogsel rekombinatsioonil,

ning DNA polümeraasid, mis on võimelised jätkama DNA sünteesi kahjustatud DNA-lt

olukorras, kus replikatiivne DNA polümeraas Pol III on DNA-kahjustuse kohal peatu-

nud. Selline kahjustatud DNA-lt toimuv süntees (ingl. translesion DNA synthesis, TLS)

võib olla vearohke, kui seda viivad läbi Y-perekonna DNA polümeraasid Pol IV (DinB)

või Pol V (UmuD’C), sest neil puudub vigu korrigeeriv (ingl. proof-reading) aktiivsus

(jn. 13.7). Kui DNA polümeraas V põhjustab valdavalt asendusmutatsioonide teket, siis

DNA polümeraas IV-le on iseloomulikud raaminihkemutatsioonid (ühenukleotiidilised

deletsioonid ja insertsioonid).

SOS-vastus aktiveeritakse kahe regulaatorvalgu, LexA ja RecA koostoimel (jn. 13.7).

Tavaolukorras on nende ensüümide tase rakus madal. Sel juhul on transkriptsiooni

negatiivne regulaatorvalk LexA-repressor seondunud DNA lex-geenide operaator-

piirkondadesse, pidurdades geenide uvrA, umuCD ja lexA transkriptsiooni. Esimesed Reparatsioon ja rekombinatsioon

401

kaks geeni määravad vastavalt UvrA- ja UmuCD-valkude sünteesi, mis osalevad vea-

altil DNA reparatsioonil. Kolmanda geeni produktiks on Lex A-valk. SOS-vastuse

käigus indutseeritavate valkude tase on rakus DNA-kahjustuste puudumisel madal.

Rakkude eksponeerimisel ultraviolettkiirgusele või mõnele muule DNA-d kahjusta-

vale tegurile tekivad DNA-ahelates kahjustused, mis pärsivad DNA replikatsiooni ja

põhjustavad üksikahelaliste DNA (ssDNA) piirkondade teket. ssDNA-ga seondub

RecA-valk, moodustades RecA-ssDNA nukleoproteiinse filamendi. RecA-valgu

interaktsioon ssDNA-ga aktiveerib RecA-valgu. Aktiveeritud RecA-valk stimuleerib

LexA-repressorvalgu autoproteolüüsi e. iseenda katkilõikamist (degradatsiooni). Kui

LexA inaktiveerub, siis suureneb transkriptsioonitase neilt geenidelt, mis olid varem

LexA poolt pärsitud.

LexA-repressor seondub erinevate SOS-vastuse käigus aktiveeritavate geenide pro-

mootoraladele erisuguse af insusega. Geenidelt, mille regulatoorsetele aladele seondub

LexA nõrgema af insusega, suureneb transkriptsioon varem kui geenidelt, mille puhul

LexA afiinsus on kõrgem. Esmajärjekorras tõuseb transkriptsioonitase DNA reparat-

sioonivalke kodeerivatel geenidel, k.a. recA-geenil ning alles hiljem DNA polümeraasi

V geenidel umuC ja umuD. Lisaks transkriptsioonitasemele kontrollitakse Pol V eks-

pressiooni ka valgu aktiivsuse kaudu. Pol V aktiveerimiseks on vajalik UmuD subühiku

proteolüüs. Pol V aktiveerimine toimub hilinemisega seetõt u, et selle DNA polümeraasi

poolt läbiviidav DNA süntees suurendab rakkudes oluliselt mutatsioonisagedust, mis võib

viia kahjulike mutatsioonide kuhjumisele. Pol V aktiveeritakse alles siis, kui muud või-

malused DNA-kahjustustega toimetulekuks ei ole osutunud piisavaks. Pol V-st sõltuvat

mutageneesi on varem nimetatud ka SOS-mutageneesiks või UV-mutageneesiks.

1.2.7. Pärilikud reparatsioonivead

Päikesevalguse suhtes ülitundlikel e. xeroderma pigmentosum’iga (XP) patsienti-

del areneb kergesti nahavähk, sest nukleotiidi väljalõikereparatsiooni NER defektsuse

tõttu ei parandata UV-kiirguse poolt põhjustatud DNA-kahjustusi. XP areneb välja, kui mutatsioonid esinevad NER- geenides XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XPF, XPG jt. Need

geenid vastutavad kahjustatud nukleotiidide, näiteks tümiini dimeeride väljalõikamise

eest. Eukarüootses NER-is osalevate valkude hulk on võrreldes bakterite NER-iga tundu-

valt suurem – eukarüootidel on NER-iga seotud 15 valku. Lisaks XP-le on NER-i geenide

defektidega seotud veel vähemalt kaks inimese pärilikku haigust, Cockayne’i sündroom

ja trihhotiodüstroof a, kuid neil juhtudel pole tegemist nahavähi tekkega, vaid neuroloo-

giliste nähtustega, vaimse alaarenguga (jn. 13.8).

Inimesel on peale nimetatud kolme haiguse veel mitmeid päranduvaid DNA-st

sõltuva ainevahetuse defektidega seonduvaid pärilikke haigusi. Nimetame siin atak-

sia-telangiektaasiat e. Louis’-Bari sündroomi, Fanconi aneemiat ning Bloomi,

Rothmundi-Thomsoni, Werneri ja Nijmegeni sündroome. Kõiki neid haigusi põh-

justavad autosoomretsessiivse pärandumistüübiga geneetilised defektid ning kõik nad

suurendavad kasvajate tekke riski. MMR-i (valepaardumise reparatsioon) defektsus

suurendab soolevähi tekke riski. Samas on nende pärilike haiguste toime erinev: ühtedel

juhtudel on ülitundlikkus ioniseeriva kiirguse, teistel juhtudel DNA-ga interkaleeruvate

ühendite (nagu mitomütsiin C), kolmandatel juhtudel kromosoomide katkemiste (aber-

ratsioonide) suhtes. Seega, erinevate sündroomide korral esineb erinevate ensüümide

defektsus. Defektsed võivad olla kas DNA reparatsiooniga seotud kinaasid, helikaasid või

DNA kaksikahelalisi katkemisi äratundvad valgud.

Meeldejätmiseks

• Elusorganismidel on välja kujunenud rida erisuguseid DNA reparatsioonisüsteeme, mille funktsiooniks on

säilitada organismide geneetilist informatsiooni muutumatul kujul.

• Erinevatel DNA reparatsiooniradadel on võime parandada DNA-kahjustuste teatavaid tüüpe.

• Otseste keemiliste pöördreaktsioonidega parandatakse DNA-kahjustusi kohapeal, näiteks fotoreaktivat-

sioonil valgustundliku ensüümi DNA fotolüaasi toimel.

• Lämmastikaluste väljalõike reparatsioonil tekib apuriinne/apürimidiinne AP-sait ning kahjustatud

nukleotiid lõigatakse DNA-st DNA glükosülaaside kaasabil välja.

• Nukleotiidide väljalõikel lõigatakse välja ja parandatakse kahjustatud alast pikem nukleotiidne lõik.

• Valepaardumisega reparatsioonil kõrvaldatakse vigastused, mis on tekkinud DNA replikatsioonil või

rekombinatsioonil.

• Rekombinatsioonisõltuv reparatsioon toimub kas homoloogse rekombinatsioonina või DNA katkenud

otste mittehomoloogsel ühendamisel.

• On teada kümneid inimese pärilikke haigusi, mis on põhjustatud DNA reparatsioonisüsteemide defek-

tidest.

• DNA reparatsioonidefektidega on seotud osa kasvajate teke.

DNA reparatsiooni defektsusest põhjustatud

pärilikud haigused inimesel

Ekstsisioonreparatsiooni

defektid

DNA metabolismi

defektid

Xeroderma pigmentosum

Cockayne’i sündroom

Trihhotiodüstroofia

Ataksia-teleangiektaasia

Fanconi aneemia

Bloomi sündroom

Werneri sündroom

Rothmundi-Thompsoni sündroom

Nijmegani katkemise sündroom

Joonis 13.8. DNA reparatsiooni defektsus põhjustab inimesel pärilike haiguste avaldumist.

Reparatsioon ja rekombinatsioon

399

3´

5´ 3´

5´

Tütarkromatiidid Kaksikahelaline katkemine DNA-valk-filamendi

moodustumine

Homoloogsuse otsimine

Ahelate ümberpaiknemine

5´-otste trimmimine

katketega ahelas

RAD51

Lühikesed DNA-ühendused

DNA ligaas

Ahelate

kokkukleepimine

DNA polümeraas

DNA süntees Parandatud tütarkromatiidid

Homoloogne

tütarkromatiid

Joonis 13.6. RecA-sõltuv rekombinatsiooniline reparatsioon eukarüootidel (kaksikahelalised katkemised). Rad51 on eukarüootidel prokarüootide RecA homoloog, mis

vahendab tütarkromatiidi kaksikahelalise katkega DNA-ahela paardumist teise tütarkromatiidi homoloogse terve ahelaga. Reparatsioonilisel DNA sünteesil kasutatakse

matriitsina tervet ahelat.

400Reparatsioon ja rekombinatsioon

III

RecA

LexA repressor

DNA polümeraas III

Tugevalt kahjustatud matriitsahel

RecA-ssDNA filament

ssDNA aktiveerib

RecA-valgu

DNA polümeraas V

LexA proteolüüs

Inaktiivne LexA

repressor

ssDNA

SOS-vastuse

initsiatsioon

Veaaldis DNA

süntees

RecA seondub

ssDNA-ga

Replikatsioonivead

RecA inaktiveerib

LexA-valgu

Olex recA

Olex uvrA

Olex umuCD

Olex lexA

RecA-valk

LexA-valk

(repressor)

DNA PolV

LexA pidurdamine

Struktuurgeenid

UvrA-valk

Skaneerib

DNA

kahjustusi

Joonis 13.7. SOS-vastus bakterites (vea aldis DNA reparatsioon). DNA polümeraas III pole võimeline kasutama DNA-sünteesil vigast matriitsahelat. Üksikahelalise DNA

teke aktiveerib RecA-valgu (homoloogse rekombinatsiooni valgu). Aktiivne RecA-valk stimuleerib transkriptsioonil negatiivse regulaatori Lex A proteolüüsi (inaktiveerib

Lex A), millega suurendatakse oluliselt DNA reparatsioonil ja DNA-sünteesil osalevate geenide transkriptsiooni. RecA-valk initsieerib SOS-vastuse, seondudes tugevalt

kahjustatud üksikahelalise DNA matriitsahelaga (moodustub RecA-ssDNA nukleoproteiinne f lament). DNA polümeraas V viib läbi vea alti DNA sünteesi, kus vigaselt

matriitsilt sünteesitakse vigane DNA-ahel (mutatsioonisagedus tõuseb replikatsioonivigade tõttu).

Reparatsioon ja rekombinatsioon

403

2. GENEETILINE REKOMBINATSIOON

2.1. REKOMBINATSIOONIMEHHANISMID

2.1.1. Homoloogne retsiprookne rekombinatsioon

Krossingoveri (ingl. crossing over) molekulaarne mehhanism eeldab DNA-molekulis kat-

kete teket ja ahelate otste taasühinemist. Seepärast on siin vajalik ka DNA reparatsiooni

toimumine. Homoloogsete DNA-molekulide vahelisel rekombinatsioonil osalevad paljud

ensüümid, mis katkestavad DNA-ahelaid, keeravad neid lahti, stimuleerivad üksikahelate

teket ning viivad läbi katkenud DNA-ahelate reparatsiooni ja katalüüsivad DNA-ahelate

taasühinemist. Molekulaarsel tasemel nimetame DNA-molekulide-vahelist rekombinat-

siooni krossingoveriks. Krossingoveri sünonüümina kasutame terminit „ristsiire”.

Eukarüootidel on ristsiire ja sünapsite teke meioosi esimeses profaasis teineteisega

seotud. Huvitaval kombel ei toimu ristsiiret isaste äädikakärbeste spermatogeneesis ning

sel puhul ei täheldata ka sünaptiliste komplekside esinemist. Selle nähtuse geneetilist

tagapõhja selgitavad katsed emaste äädikakärbestega, kus näidati, et mutatsioonid geenis

c3G elimineerivad nii ristsiirde toimumise kui ka sünapsite tekke. Niisuguseid mutante

nimetatakse rekombinatsiooni-defektseteks mutantideks (ingl. recombination-def cient

mutants). Arvatakse, et neil mutantidel ei toimu täiendavat DNA sünteesi, mis esineb nii

sünapsite kui ka krossingoveri toimumisel. Samuti arvatakse, et isastes äädikakärbestes

c3G geen seniteadmata põhjustel ei funktsioneeri.

Kuivõrd eukarüootidel toimub ristsiire paardunud DNA homoloogide vahel meioosi

esimeses profaasis, siis saab siin arusaadavalt rääkida eelkõige homoloogsest rekombi-

natsioonist (ingl. homological recombination) ning DNA-lõikude võrdsest vastastikusest

(retsiprooksest) vahetusest. Lisaks DNA-ahelate homoloogsusele on tõestatud ka DNA-

ahelate füüsiline katkemine ja taasühinemine ning DNA reparatsiooni toimumine neis

protsessides. Homoloogses rekombinatsioonis osalevad paljud valgud ning erinevates

olukordades võib protsess toimuda erisuguste molekulaarsete mehhanismide alusel. Laias

laastus toimub homoloogne rekombinatsioon, lähtudes kas üksik- või kaksikahelalistest

DNA katketest.

2.1.1.1. Üksikahelaliste katkemiste mudel

Üheks esimeseks rekombinatsiooniprotsessi molekulaarseks mudeliks on Briti mole -

kulaarbioloogi Robin Holliday (snd. 1932) poolt 1964. a. väljapakutud krossing overi

üksikahelaliste katkemiste mudel (ingl. single-strand break model). Rekombinat-

siooniprotsess algatatakse endonukleaasi toimel üksikahelaliste DNA-katkete tekkega

mõlema DNA-molekuli ühes ahelas (jn. 13.9). Järgnevalt toimub DNA helikaaside toi-

mel DNA-ahelate lahtikeerdumine, lahtisulanud üksikahelate seondumine valkudega ja

katkega ahelate paardumine nendega homoloogse vastasahelaga teisest DNA-moleku-

list. Üksikahelate ümberasetumist stimuleerib RecA-valk. Seda protsessi nimetatakse

ka DNA üksikahelate assimileerimiseks (ingl. single-strand assimilation) e. protsessiks,

kus DNA üksikahel ühest DNA-molekulist paardub temaga rekombineeruvast DNA-

molekulist pärit komplementaarse DNA-ahelaga. RecA-valk viib DNA kaksikheeliksis

läbi võrdväärseid e. retsiprookseid vahetusi ning teeb seda kahes etapis: esmalt seondub

üksikahel ühest DNA-molekulist teise DNA-molekuli komplementaarse ahelaga, jättes Reparatsioon ja rekombinatsioon

405

selles molekulis üksikuks teise ahela, toimub DNA-ahelate asendamine (ingl. strand

displacement) ning seejärel paardub see üksikuks jäänud ahel talle komplementaarse

esimesest DNA-molekulist pärit üksikahelalise piirkonnaga, s.o. toimub DNA-ahelate

vahetus (ingl. strand exchange). Selleks et teostada kahe DNA-molekuli ahelate vahetu-

misel toimuvat homoloogset paardumist, seondub RecA-valk üksikahelalise DNA-ga.

Kui homoloogsed ahelad on teineteist leidnud, siis RecA-valk võimendab homoloogsete

DNA-ahelate paardumist ligikaudu 50 korda. Katkestatud ja asendatud ahelate kova-

lentne kokkupanek e. taasühinemine (ingl. reunion) toimub DNA ligaasi kaasabil. Kui

üksikahelalised katked ja taasühinemised ei toimu täpselt samas punktis, on juba selles

etapis, enne ahelate taasühendamist DNA ligaasiga, vajalik DNA reparatsioon.

Ülalkirjeldatud protsesside tulemusel toimuvad mõlemas DNA kaksikahelas üksik-

ahelalised katkemised ja taasühendamised, mille tulemusena moodustub DNA-ahelatest

X-kujuline struktuur, mida nimetatakse hii-vormiks (ingl. chi forms) (jn. 13.9) ning mis

on hästi detekteeritav ka elektronmikroskoopiliselt. Sellist DNA struktuuri nimetatakse ka

Holliday ühenduseks (ingl. Holliday junction). Holliday ühendusi võib lahti lõigata kahel

viisil. Ühel juhul toimub krossingover, teisel juhul mit e. Nimelt võivad üsikahelaliste sil-

dade kaudu ühendatud ja teineteisega risti asetsevad DNA-ahelad roteeruda (pöörduda)

180O ümber oma telje. Selle tulemusena ei ole üksikahelalised sillad enam üksteisega risti.

Järgnevalt võib endonukleaas sillad kas horisontaal- või vertikaaltasapinnas katki lõigata.

Erinevate lõigete puhul saadakse erisugused rekombinatsiooniproduktid. Näiteks, kui enne

rekombinatsiooni külgnesid rekombinatsioonisaidiga homoloogsete geenide alleelid A ja

B ühes ning alleelid a ja b teises kromosoomis (DNA-molekulis), siis pärast rekombinat-

siooni asetsevad kõrvuti alleelid a ja B ning A ja b. Alternatiivsel katkemisel rekombinantseid

DNA-molekule kõrvalolevate geenide suhtes aga ei teki. E. coli´l kõrvaldatakse hii-struktuu-

rid DNA-st geenide recG või ruvC produktide toimel.

2.1.1.2. Kaksikahelaliste katkemiste mudel

Rekombinatsioon võib toimuda erinevate molekulaarsete mehhanismide abil. 1983. a.

esitasid Jack W. Szostak (snd. 1952) ja Franklin Stahl (snd. 1929) pärmseente uurimise

tulemuste alusel krossingoveri kaksikahelaliste katkemiste mudeli (ingl. double-strand

break model). Nimetatud mudeli kohaselt toimub esmalt ühes kaksikahelalises DNA-s

kaksikahelaline katkemine, kus homoloogsete kromosoomide DNA niidid jäävad rekombi-

natsioonikohas teineteisega ühendatuks üksikahelaliste sildade kaudu. Niisugune ühendus

on vajalik, sest vastasel juhul kaotaksid kaksikahelaliste katkemiste tõt u erinevad DNA-

fragmendid teineteisega kontakti. Rekombinatsiooniga kaasneb ka DNA süntees.

2.1.2. Homoloogne mitteretsiprookne rekombinatsioon (geeni konversioon)

Kui seentel Neurospora crassa uurida teineteisele väga lähedal asetsevaid aheldunud mar-

kereid (geene), ei saada sageli retsiprookse homoloogse rekombinatsiooni tulemusena

oodatavat askospooride suhet 1 : 1. Näiteks saadakse kahe lähedalasetseva mutatsiooni

(m1

ja m2

) uurimisel ristamisest m1

+ x m1

järgmised askospooride paarid:

1) paar 1: m1

+ m2

2) paar 2: m1

+ m2

3) paar 3: m1 m2

4) paar 4: m1 m2

404Reparatsioon ja rekombinatsioon

Homoloog 1

Homoloog 2

A B

a b

Homoloogsete

kromosoomide

paardumine

Üksikahelaliste

katkete

teke

Ahelate

ümberasetus

Ahelate

vahetus

Kovalentsete

üksikahelaliste

sildade teke

Endonukleaas

Helikaas,

SSB-valk

RecA-

valgud

DNA ligaas

Rotatsioon

180o

Endonukleaas

DNA ligaas

Üksikahelaliste

sildade katkilõikamine

kas horisontaal- või

vertikaaltasapinnas

Kahemõõtmeline

struktuur

Rekombinantne

kromosoom

Kolmemõõtmeline

struktuur

Ekvivalentne 3D

struktuur

Joonis 13.9. Holliday homoloogsete kromosoomide retsiprookse krossingoveri (rekombinatsiooni) ehk üksikahelaliste katkemiste mudel.

406Reparatsioon ja rekombinatsioon

Siit on näha, et järglaste (askospooride) hulgas tuleb et e metsiktüüpi m1

+ m2

-spoore, ei

esine aga kaksikmutantseid m1

-spoore, mis peaksid tekkima homoloogsel rekombi-

natsioonil. Siin saadakse m2

+ : m2 askuste suhe 3 : 1 (mit e aga oodatav 2 : 2-jaotus e. 1 :

1-suhe) (jn. 13.10). Antud juhul oleks nagu üks m2

-alleelidest konverteeritud m2

+-allee-

liks. Sellist tüüpi mit eretsiprookset rekombinatsiooni nimetatakse geenikonversiooniks

(ingl. gene conversion) e. geeni ümbermuutmiseks.

Homoloogsel retsiprooksel rekombinatsioonil vaadeldakse rekombinatsiooni toimu-

mist teineteisest suhteliselt kaugel asetsevate geenide suhtes. Sel juhul võib uuritavate

geenide (a ja b) vahele jääda näiteks geen m, mille DNA osas võib olla mit epaardunud

nukleotiide (ingl. mismaches). Sellisel juhul asetuvad krossingoveri esimeses etapis kõr-

vutiolevate DNA-molekulide üksikahelad ümber nii, et mutantne (mit epaardumisega)

ahel saab kokku mit emutantse ahelaga ja, vastupidi, mit emutantne ahel saab partneriks

mutantse ahela (jn. 13.10). Protsessi tulemusel tekivad DNA-molekulid, kus kahes komp-

lementaarses DNA-ahelas on erisugused alleelid. Selliseid heterogeenseid DNA-molekule

nimetatakse heterodupleksiteks (ingl. heteroduplexes). Mit epaardunud nukleotiidide

väljalõikel kõrvaldatakse DNA reparatsiooniensüümide poolt mutantne m-ahela osa,

tühik täidetakse täiendaval DNA sünteesil, kasutades matriitsina metsiktüüpi DNA-

ahelat m+

. Niimoodi muudetaksegi mõlemad DNA-ahelad m+-ahelateks ja tetraadis

saadaksegi m+ : msuhteks 3 : 1. Juhul kui repareeritakse vaid üks kahest mit epaardunud

nukleotiidist, siis tänu DNA replikatsiooni poolkonservatiivsele iseloomule saadakse

askuses askospooride m+

:m markerite lahknemissuhteks 5 m+ : 3 m.

Hetero-

dupleks

A B

a b

A B

a b

A B

a b

A B

a b M

Valepaardumine Reparatsiooniline

DNA süntees

Geenikonversioon

M : m = 3 : 1 (e. 6 : 2)

DNA-ahelate vahetus ja

heterodupleksite teke

Joonis 13.10. Geeni konversioon ehk geeni ümbermuutmine.

Geeni konversioon assotsieerub retsiprookse rekombinatsiooni tulemustega 50%-l

juhtudest, sest Holliday mudeli kohaselt võib toimuda hii-struktuuride katkemine

võrdtõenäosuslikult nii horisontaalselt kui ka vertikaalselt. Vertikaalsed katkemised

põhjustavad askuste teket, kus esinevad nii geeni konversioon kui ka retsiprooksne rekom-

binatsioon. Horisontaalsel katkemisel ilmneb aga ainult geeni konversioon (jn. 13.11).

Reparatsioon ja rekombinatsioon

407

b A

Endonukleaas

B M

b A a B

Endonukleaas

DNA ligaas DNA ligaas DNA ligaas DNA ligaas

Kõrvalasetsevate markerite suhtes rekombinantne Kõrvalasetsevate markerite suhtes vanemtüüpi

Reparatsiooniline süntees Reparatsiooniline süntees

M M

M M M

M M

geenikonversioon geenikonversioon

Joonis 13.11. Geenikonversioonil (M/M-DNA-ahelad) moodustuvad rekombinantsed (all vasakul) ja vanemtüüpi (all paremal) f ankeeruvate markerite kombinatsioonid.

Üksikahelaliste sildade endonukleaasiga vertikaalsuunas katkilõikamine (vasakul) põhjustab rekombinantse kombinatsiooni (Ab ja aB) ja horisontaalsuunas (paremal)

vanemtüüpi (AB ja ab) kombinatsiooni esinemist.

Reparatsioon ja rekombinatsioon

407

b A

Endonukleaas

B M

b A a B

Endonukleaas

DNA ligaas DNA ligaas DNA ligaas DNA ligaas

Kõrvalasetsevate markerite suhtes rekombinantne Kõrvalasetsevate markerite suhtes vanemtüüpi

Reparatsiooniline süntees Reparatsiooniline süntees

M M

M M M

M M

geenikonversioon geenikonversioon

Joonis 13.11. Geenikonversioonil (M/M-DNA-ahelad) moodustuvad rekombinantsed (all vasakul) ja vanemtüüpi (all paremal) f ankeeruvate markerite kombinatsioonid.

Üksikahelaliste sildade endonukleaasiga vertikaalsuunas katkilõikamine (vasakul) põhjustab rekombinantse kombinatsiooni (Ab ja aB) ja horisontaalsuunas (paremal)

vanemtüüpi (AB ja ab) kombinatsiooni esinemist.

Reparatsioon ja rekombinatsioon

409

2.1.3.2. Integronid

Integronid (ingl. integrons) on geneetiliste elementide klass, mis esineb sageli plasmiidi-

des, transposoonide koostises või nende läheduses ja teistes insertsioonilistes elementides

(nt. bakteriofaagid). Integronid sisaldavad integraasigeeni (ingl. integrase gene) ja külg-

nevat rekombinatsioonisaiti at I (ingl. recombination site at I). Integron on võimeline

haarama endasse näiteks antibiootikumiresistentsuse geenikasset e (ingl. antibiotic-

resistance gene casset es). Rõngasjas geenikasset viiakse lineaarseks integraasi vahendatud

rekombinatsioonil at I-saidi ja at C-saidi (nimetatakse ka 59 bp elemendiks, mis asub

kassetis antibiootikumiresistentsuse-geeni kõrval) vahele (jn. 13.13). Enne integratsiooni

pole antibiootikumiresistentsuse-geenil promootorit ning ta ei avaldu. Integratsiooni järel

saab aga antibiootikumiresistentsuse-geen avalduda saidis at I. Integraasigeeni trans-

kribeeritakse promootorilt Pint ning integreerunud antibiootikumiresistentsuse-geeni

(geene) transkribeeritakse sama piirkonna DNA vastasahelal moodustatud tugeva vas-

tassuunalise promootori Pout

poolt.

Kuigi integronid on iseloomulikud antibiootikumiresistentsuse-geenidele, on neid kir-

jeldatud ka metaboolsete ja virulentsusgeenide ümberpaiknemise puhul. Integronid on ka

kohaks, kuhu võivad liituda paljud muud geenikassetid, mõnedel juhtudel isegi rohkem kui

100 kasset i. Selliseid integrone nimetatakse superintegronideks (ingl. super-integrons).

P h1 hixR P hin hixL h2 rh1

h1 hixL hin P hixR h2 rh1

Hin katalüüsib

saitspetsiifilist

rekombinatsiooni, millega

inverteeritakse promootorit

sisaldav DNA-segment

h2-rh1-operoni transkriptsioon

pidurdatud

h2-rh1-mRNA

H1-repressor

h1-mRNA

H2-flagelliini

alaüksuste valgud

H1-flagelliini

alaüksuste valgud

Faas I orientatsioon

Faas II orientatsioon

DNA

h1-operoni transkriptsioon

pidurdatud

Faas I Faas II

H1-repressor

Joonis 13.12. Salmonella typhimurium´i viburite faasivahetus saitspetsiifilise rekombinatsiooniga. H1- ja

H2-f agelliini alaüksuste valkude süntees on alternatiivne: H1 sünteesitakse h1-repressori puudumisel; H2-

(ja H1-repressor) sünteesitakse insertsioonilise elemendi promootori operonisuunalisel orientatsioonil.

Valk Hin määrab insertsioonilise elemendi mõlemasuunalist inversiooni. Faasis I olevad rakud toodavad

H1-vibur antigeene, faasis II olevad rakud aga H2-viburantigeene (f agelliine).