IX. TRANSKRIPTSIOON JA RNA PROTSESSING
Elusorganismide geneetilise informatsiooni säilitamiseks ja realiseerimiseks on informatsioonikandja märkimiseks vaja vaid nelja tähte (A, T, G, C). On seda palju või vähe?
Võrdluseks, nüüdisaegsetes arvutites on kasutusel vaid 2 arvsümbolit (0, 1), seevastu inglise keeles on 26 tähte, eesti keeles 27 eesti tähestiku tähte ja 5 võõrtähte (c, q, w, x, y)
e. 32 tähte.
1. TRANSKRIPTSIOON
1.1. Transkriptsiooni üldpõhimõtted
1.1.1. Molekulaarbioloogia põhipostulaat
Molekulaarbioloogia põhipostulaadi (ingl. central dogma of molecular biology) e. Cricki
postulaadi kohaselt on geneetilisel informatsioonil kaks põhiomadust (jn. 9.1).
1. Geneetiline informatsioon säilib, kandudes põlvkonnast põlvkonda edasi
nukleiinhappelt nukleiinhappele (DNA-lt DNA-le; RNA viirustel, kel genoomiks
on RNA, toimub ülekanne RNA-lt RNA-le).
2. Geneetiline informatsioon kandub edasi organismi geenide avaldumisel (fenotüübilisel ekspressioonil) DNA-lt valkudesse, s.t. DNA nukleotiidse järjestuse
informatsioon kodeeritakse ümber valkude aminohappeliseks järjestuseks.
Geneetilise informatsiooni ülekanne valkudesse on kaheetapiline.
1. Transkriptsioon (ingl. transcription), kus geneetiline informatsioon kandub üle
DNA-lt RNA-le.
2. Translatsioon (ingl. translation), kus geneetiline informatsioon kandub üle
RNA-lt valku.
Geneetilise informatsiooni ülekanne DNA-lt RNA-le on põhimõt eliselt pöörduv protsess. Näiteks, kui transkriptsioonil toimub DNA-sõltuva RNA polümeraasi toimel
informatsiooni ülekanne DNA-lt RNA-le, siis vastupidisel protsessil, pöördtranskriptsioonil (ingl. reverse transkription) toimub RNA-sõltuva DNA polümeraasi e. revertaasi
toimel geneetilise informatsiooni ülekanne RNA-lt DNA-le. Seevastu geneetilise informatsiooni ülekanne RNA-lt valku on alati pöördumatu (ühesuunaline) protsess.
Transkriptsioon ja RNA protsessing
263
Molekulaarbioloogia põhipostulaat ütleb, et geneetiline informatsioon kandub nukleiinhappelt nukleiinhappele ja nukleiinhappelt valku, mit e valgult nukleiinhappele. See
tähendab aga ka seda, et keskkonna toimel organismi eluajal omandatud fenotüübilised
tunnused ei saa suguliselt sigivatel organismidel järglastele päranduda: ei pärandata tunnuseid, vaid geneetilist informatsiooni, mis tagab iseloomulike tunnuste tekke.
1.1.2. RNA tüübid
Transkriptsioonil kasutatakse üht DNA-ahelat matriitsina (ingl. template) komplementaarse RNA-ahela sünteesil. Sünteesitud RNA-ahelat nimetatakse transkriptiks (ingl.
transcript). Kuivõrd RNA-s on tümiini asemel uratsiil, siis näiteks juhul, kui matriitsahela
DNA-molekulis on nukleotiidne järjestus AAA, vastab sellele RNA transkriptis UUU.
Translatsiooni käigus muudetakse („tõlgitakse”) RNA nukleotiidne järjestus valkude
aminohappeliseks järjestuseks. Nagu igasuguse info ülekandel ühest märgisüsteemist
teise vajatakse selleks koodi, geneetilise info ülekandel geneetilist koodi (ingl. genetic
code). Geneetilise koodiga määratakse valkude aminohapped RNA nukleotiidsete tripletite (ingl. triplets) poolt, mida nimetatakse koodoniteks (ingl. codons). Ülalesitatud
näites määrab UUU triplet RNA-s valgu polüpeptiidahelasse (geeni produkti) aminohappe fenüülalaniini lülitumise.
Translatsioon toimub ribosoomides (ingl. ribosomes), mis koosnevad 3–5 RNAmolekulist, 50–90 erinevast valgust ja reast muudest regulatoorsetest makromolekulidest.
Ribosoomides transleeritavaid RNA-molekule nimetatakse informatsiooni-RNA-deks
e. mRNA-deks (ingl. messenger RNAs, mRNAs). Prokarüootidel on geeni poolt määratav esmane transkript (ingl. primary transcript) võrdne mRNA-ga ning ta on ka kohe
transleeritav (jn. 9.2). Eukarüootides toimub aga esmalt eellas- e. pre-mRNA (ingl. premRNA) süntees, misjärel toimub nn. eellas-mRNA potsessing (ingl. processing) küpseks
GENEETILISE INFORMATSIOONI VOOL PÕLVKONNAST PÕLVKONDA
RNA
DNA
RNA
DNA
Replikatsioon
RNA-sõltuv RNA polümeraas
DNA-sõltuv DNA polümeraas
mRNA
Polüpeptiid (valk)
RNA-sõltuv DNA polümeraas
DNA-sõltuv
RNA polümeraas
Pöördtranskriptsioon
Transkriptsioon
FENOTÜÜBI KONTROLL (GEENI AVALDUMINE)
Translatsioon
Joonis 9.1. Molekulaarbioloogia keskne dogma
(Cricki postulaat). Cricki
post u laat: geneet i l i ne
informatsioon kandub
eda si nu k lei i n happelt
nukleiinhappele ja nukl e i i n h a p p e l t v a l g u l e ,
mitte aga valgult nukleiinhappele.
264Transkriptsioon ja RNA protsessing
mRNA-molekuliks. Protsessimise käigus toimub enne translatsiooni pre-mRNA-st spetsiif lise järjestuse kõrvaldamine ning transkripti mõlema otsa modif katsioon. Enamikus
eukarüootsetes geenides on mit ekodeerivad järjestused e. intronid (ingl. introns), mis
lõigatakse RNA protsessingul RNA-st välja, ühendades sellega RNA-s geeni kodeerivad järjestused e. eksonid (ingl. exons). Intronite väljalõikamise protsessi nimetatakse
geeni splaissinguks (ingl. gene splicing). Enne splaissingut lisatakse pre-mRNA 5´-otsa
7-metüülguanosiinmüts (ingl. cap) ja 3´-otsa transkriptsioonijärgselt pärast splaissingut 20–200 nukleotiidi pikkune polü-(A)-järjestus e. polü-(A)-saba (ingl. poly-A tail).
Splaissingreaktsiooni läbiviimiseks moodustub makromolekulaarne struktuur, mida
nimetatakse splaissosoomiks (ingl. spliceosomes). Kõik nimetatud protsessid toimuvad
tuumas. Protsessitud mRNA transporditakse tsütoplasmasse, kus ta transleeritakse. Järelikult on transkriptsioon ja translatsioon eukarüootidel ajaliselt ja ruumiliselt lahutatud.
Seevastu prokarüootsetes rakkudes toimuvad transkriptsioon ja translatsioon järjestikku:
sünteesitud mRNA osaleb kohe ka translatsioonil.
Tegelikult transkribeeritakse geenide ekspressioonil koguni viit erinevat tüüpi
RNA-sid: mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, miRNA. Neist transleeritakse aga vaid ühte,
ülalnimetatutest mRNA-d. Ülejäänud neli RNA tüüpi on lõpp-produktid. TransportRNA-d e. tRNA-d (ingl. transfer RNAs, tRNAs) on madalmolekulaarsed RNA-d, mis
funktsioneerivad translatsioonil kui adapterid aminohapete ja mRNA koodonite vahel.
Ekson Intron Ekson
Geen
Geen
mRNA
Pre-mRNA
MG- -(A)n
-(A) MG-müts- n
Valk
Valk
Transkriptsioon DNA
DNA
Transkriptsioon
Translatsioon
Translatsioon
Transport
Protsessing Splaissing
Tuum
A Prokarüoot B Eukarüoot
Rakk Rakk
Ekson Intron Ekson
mRNA
Joonis 9.2. Pro- (A) ja eukarüootide (B) valgusünteesi kaks etappi: transkriptsioon ja translatsioon. Eukarüootide tuumas toimub (sageli) pre-mRNA-st intronite kõrvaldamine (geeni splaissing). Eukarüootide
tuumas toimub mRNA modif katsioon (protsessing): 5´-otsa 7-metüülguanosiin-(MG)-mütsi ja 3´-otsa
polü(A)-saba lisamine. Eukarüootide mRNA transporditakse tuumast tsütoplasmasse. Prokarüootidel toimub nii transkriptsioon kui ka translatsioon järjestikuliselt – need pole ajas ja ruumis lahutatud protsessid.
Transkriptsioon ja RNA protsessing
265
Ribosoomi-RNA-d e. rRNA-d (ingl. ribosomal RNAs, rRNAs) on ribosoomide struktuurseteks ja katalüütilisteks komponentideks. Väikesed tuuma-RNA-d e. snRNA-d
(ingl. small nuclear RNAs, snRNAs) on splaissosoomide struktuurikomponentideks.
Mikro-RNA-d e. miRNA-d (ingl. micro RNAs, miRNAs) on 20–25 nukleotiidi pikkused
üksikahelalised RNA-molekulid, mis lõigatakse välja väikestest juuksenõelastruktuuriga
RNA prekursoritest (eellasmolekulidest) ning neil on võime blokeerida nendega komplementaarse või osaliselt komplementaarse mRNA avaldumist, põhjustades viimase
degradatsiooni või pidurdades translatsiooni.
Kõik ülalnimetatud eri tüüpi R NA-d sünteesitakse eukarüootide tuumades.
Neist vaid üks, snRNA toimib tuumas, ülejäänud neli (mRNA, tRNA, rRNA ja premiRNA) transporditakse tuumast tsütoplasmasse, kus toimub translatsioon (jn. 9.3).
RNA-d protsessitakse tuumas. Erandina transporditakse tsütoplasmasse miRNA eellane pre-miRNA, mis protsessitakse alles tsütoplasmas aktiivseks miRNA-ks. Tuumas
sünteesitud pre-miRNA sekundaarsed kaksikahelalised alad lõigatakse tuumas katki
Drosha-ensüümiga (ingl. Drosha enzyme), pre-miRNA väljub tuumast tsütoplasmasse,
kus toimub kaksikahelalise RNA järkamine (ingl. dice) ning trimmimine (ingl. RNA
trimming) teise ensüümiga – Diceri-nukleaasiga miRNA-ks. Viimane seostub valkudega
miRICS-kompleksiks. miRICS-i koosseisus olev üksikahelaline miRNA seondub oma
märklaudjärjestusele mRNA-s ning blokeerib sellega mRNA translatsiooni. Siinjuures
Joonis 9.3. Valgusünteesi komponendid eukarüoodil. Transkriptsioonilised RNA-d: mRNA, miRNA, rRNA,
snRNA, tRNA. snRNA splaissingu funktsioon splaissosoomis. mRNA, rRNA, tRNA ribosoomide ja aminohapete osalus translatsioonil tsütoplasmas. miRNA regulatiivne funktsioon: Drosha on ensüüm, mis lõikab
tuumas pre-miRNA-st välja kaksikahelalised RNA osad; Dicer on nukleaas, mis trimmib pre-miRNA-st
miRNA; RICS on RNA indutseeritud translatsiooni vaigistav kompleks.
U5
U1
DNA
Transkriptsioon
RNA protsessing
snRNA
rRNA
tRNA
mRNA
Pre-miRNA
U6
U4
U2
Splaissosoom
RNA transkript
Pre-miRNA
mRNA
tRNA
rRNA
Dicer-nukleaas
Ribosoomivalgud
mRNA mRNA degradatsioon Translatsiooni repressioon
Aminohapped
Translatsioon
Polüpeptiid
Transkriptsioon
Tsütoplasma Tuum RICS
Ribosoom
Drosha-nukleaas miRNA
266Transkriptsioon ja RNA protsessing
aga blokeeritud mRNA-d ei degradeerita ning neid saab edaspidi kasutada. Seega miRNA
vaid moduleerib valgusünteesi toimumist rakus. miRNA on peale eukarüootide ka eukarüootsetes viirustes. Näiteks herpesviiruses kodeeritakse 140 erisugust miRNA-d.
1.1.3. RNA süntees ja lagundamine
RNA süntees on põhimõt eliselt sarnane DNA sünteesiga. Erinevused on vaid järgmised.
1. Eellasmolekulid (prekursorid) on ribonukleotiidtrifosfaadid (mit e desoksüribonukleotiid-trifosfaadid).
2. Komplementaarse RNA-ahela sünteesil kasutatakse matriitsina vaid üht DNAahelat.
3. RNA-ahela sünteesi saab initsieerida de novo, ilma praimerahela (ja selle vaba
3´-OH otsa) olemasoluta.
Moodustuv RNA-ahel on komplementaarne DNA matriitsahelaga (ingl. template
strand) (jn. 9.4), selle erinevusega, et T asemel on U. Teist DNA-ahelat nimetatakse
mit e matriitsahelaks (ingl. nontemplate strand). mRNA-molekulid on RNA kodeerivateks ahelateks e. mõt elisteks e. senss-ahelateks (ingl. sens strands), sest nende info
kandub edasi polüpeptiidahela aminohappelisse järjestusse. mRNA-ga komplementaarsed RNA-molekulid on vastasmõt elised e. antisenss-RNA-d (ingl. antisense RNAs).
Teoreetiliselt on antisenss-RNA geeni (DNA) mit ematriitsahelalt sünteesitud mRNA-le
komplementaarne RNA. Tegelikkuses on genoomis kindlad nn. vastasgeenid, millelt
CGTATGCTAGTCCGATTGCG
GCATACGATCAGGCTAACGC
GCAUACGAUCAGGCUAACGC
CGTATGCTAGTCCGATTGCG
Matriitsahel
Mittematriitsahel
DNA 3´
5´ 3´
5´
RNA süntees
mRNA
3´
5´ 3´
5´ Matriitsahel
RNA
DNA
Senss-RNA ahel
RNA süntees
Antisenss-RNA 3´ 5´ RNA
DNA 5´ GCATACGATCAGGCTAACGC 3´ Mittematriitsahel
Antisenss-RNA ahel
CGUAUGCUAGUCCGAUUGCG
Joonis 9.4. RNA süntees toimub vaid ühel DNA-ahelal. mRNA sünteesitakse DNA matriitsahelal. RNA
sünteesil loetakse geneetilist informatsiooni 3´→ 5´ ahelalt, süntees toimub suunas 5´→ 3´. Sünteesitud 5´→ 3´
RNA-ahel on komplementaarne DNA 5´→ 3´ mit ematriitsahelaga (T asemel on vaid U). Antisenss-RNA on
kui DNA mit ematriitsahelal sünteesitud RNA.
Transkriptsioon ja RNA protsessing
267
moodustatakse antisenss-RNA-d, mis võivad paarduda mitmete mRNA-de märklaudjärjestustega ning blokeerida sellega mRNA translatsiooni. Tüüpiliselt on antisenss-RNA-d
ca 100 nukleotiidi pikad ning nende seondumisjärjestus on ca 30 nukleotiidi pikkune. Antisenss-R NA-de kui väikeste regulatoorsete R NA-de seondumine mR NA
äratundmisjärjestustele sõltub väikesest spetsiif lisest Hfg-valgust, mida nimetatakse
RNA-tšaperoniks (ingl. RNA chaperon), sest see valk aitab väikestel RNA-molekulidel
hoida oma korrektset struktuuri. Hfg-valk moodustab mRNA ja antisenss-RNA paardumisel nende ümber moodustuvate tasapindade heksameerse struktuuri ning selle
kompleksiga seondub veel ribonukleaas E, mis alustab mRNA degradeerimist.
RNA-ahela süntees toimub nagu DNA puhulgi suunas 5´ → 3´, kus ribonukleotiide
lisatakse ahela lõppu, 3´-hüdroksüülgrupi (3´-OH) külge. Analoogselt DNA-sünteesiga
toimub selles reaktsioonis 3´-OH nukleof ilne rünnak eellasmolekuli, ribonukleotiidtrifosfaadi kolme fosfaadi sisemisele (nukleotidüül)fosforiaatomile ning sellega kaasneb
pürofosfaadi vabanemine (jn. 9.5). RNA-sse lülituv nukleotiid on komplementaarne vastasoleva DNA matriitsahela nukleotiidiga.
O CH2
H
H
H
H
O P O
O
O
O CH2
H
H
H
H
O P O
O
O
O CH2
H
H
H
H
O P O
O
O
O CH2
H
H
H
H
O
O P O
O
O
CH2
O P O
O
O
CH2 O
H
H
OH
H
H
O
H
OH
H
OH
H
H
O P O
O
O P CH2
O
O
O P
O
O
O
H
OH
H
OH
H
H
O
Uue sideme
moodustumine
Tsütosiin Guaniin
Guaniin Tsütosiin
Uratsiil Adeniin
Tümiin
H
H
H
H
O
3´
5´
3´
5´
Saabuv ribonukleotiidtrifosfaat
Ahela
pikenemine
RNA DNA
Joonis 9.5. RNA-ahela elongatsioon suunas 5´→ 3´ RNA polümeraasi toimel.
268Transkriptsioon ja RNA protsessing
RNA sünteesi teostab ensüüm RNA polümeraas (ingl. RNA polymerase). Summaarset
reaktsiooni väljendatakse järgmiselt:
DNA matriits
n(RTP) → → → → (RMP)n + n(PP),
RNA polümeraas
kus n on kasutatud ribonukleotiidtrifosfaatide (RTP), RNA-sse lülitunud ribonukleotiidmonofosfaatide (RMP) ja vabanenud pürofosfaatide (PP) hulk. RNA polümeraas seondub
ja alustab transkriptsiooni DNA spetsiif listelt järjestustelt, mida nimetatakse promootoriks (ingl. promoter). Pro- ja eukarüootsetel geenidel on promootorjärjestused erinevad.
Transkriptsiooni initsiatsiooni promootoritelt reguleeritakse transkriptsioonifaktorite
(ingl. transcription factors) seondumisega promootoriga. Transkriptsioonifaktorid on nii
positiivsed kui ka negatiivsed regulaatorvalgud, kusjuures positiivsed regulaatorvalgud soodustavad ja negatiivsed pidurdavad transkriptsiooni alustamist. Transkriptsioon
toimub RNA polümeraasi toimel lokaalselt lahtikeerdunud DNA-lõigul, mida nimetatakse ka transkriptsioonisilmaks või transkriptsioonimulliks (ingl. transcription
bubble) (jn. 9.6). Prokarüootidel on üks RNA polümeraas, eukarüootsetes rakkudes aga
kolm erinevat RNA polümeraasi, kuivõrd viimasel juhul katalüüsivad erinevad polümeraasid eri tüüpi RNA-molekulide sünteesi.
C A U G U A A A U U U U C A G A U
U A G G T A C A T T T A
A A A G T C T A A T C G C
T T A
C A T G T A A A T
T T T C A G A T T A G C G
A A T
RNA
DNA matriitsahel
Lokaalselt lahtikeerdunud
DNA-fragment
RNA polümeraas
5´
5´
5´ 3´
3´
3´
RNA/DNA hübriid
DNA mittematriitsahel
Joonis 9.6. RNA süntees lokaalselt lahtikeerdunud DNA piirkonnas e. transkriptsioonisilmas.
Transkriptsioonisilmas on näha,
et vaid mõned ük sikud DNA
matriitsahela nuk leotiidid on
aluspaardunud kasvava RNAahela lõpus (R NA/DNA hübriid). DNA-molekuli lahtikeerdumist enne ja tagasi kinnikeerdumist pärast replikatsioonisilma katalüüsitakse RNA polümeraasi poolt.
Meeldejätmiseks
• Molekulaarbioloogia põhipostulaat ütleb, et geneetiline informatsioon kandub nukleiinhappelt nukleiinhappele ja nukleiinhappelt valku, mitte valgult nukleiinhappele.
• Transkriptsioonil sünteesitakse RNA transkript, mis on komplementaarne geeni DNA ühe ahelaga.
• Transkribeeritakse viit erinevat tüüpi RNA-molekule (mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, miRNA), milledest
transleeritakse vaid mRNA-d.
• Translatsioonil konverteeritakse RNA nukleotiidses järjestuses sisalduv geneetiline informatsioon valkude polüpeptiidide aminohappeliseks järjestuseks (geeni produktiks) geneetilise koodi abil.
Transkriptsioon ja RNA protsessing
269
• Eukarüootsed geenid asuvad tuumas, polüpeptiidid sünteesitakse aga tsütoplasmas.
• Transkriptsioonil moodustuvad RNA-d protsessitakse valdavalt tuumas ja transporditakse tsütoplasmasse, v.a. miRNA.
• Geneetilise informatsiooni ülekande vaheühendiks on mRNA, millega kantakse informatsioon DNA-lt
ribosoomidesse, kus toimub valgusüntees.
• RNA polümeraasi poolt katalüüsitav RNA-süntees on väga sarnane DNA-sünteesiga.
• RNA-süntees toimub lokaalselt lahtikeerdunud DNA-lõigul, mis algab promootorist ning kus RNA-sünteesi matriitsina kasutatakse vaid üht DNA-ahelat.
1.2. Transkriptsioon prokarüootidel
Transkriptsiooni põhietapid on pro- ja eukarüootidel samased, kuid on ka olulisi erinevusi, näiteks juba nimetatud promootorite nukleotiidsed järjestused. Lisaks on RNA
polümeraasid pro- ja eukarüootidel, eriti arhedel, erisuguse ehitusega.
DNA segment, mis transkribeeritakse üheks R NA-molekuliks, kannab nime -
tust „transkriptsiooniüksus” (ingl. transcription unit). Eukarüootidel on transkriptsiooniüksus sageli ekvivalentne individuaalse geeniga. Prokarüootidel on
transkriptsiooniüksuseks aga mitu geeni, mis on osa operonist (ingl. operon). Operoni
koosseisu kuuluvad veel operoni geene reguleerivad DNA-järjestused. Operonilt sünteesitud RNA-molekuli nimetatakse polütsistroonseks RNA-ks (ingl. polycistronic RNA).
Transkriptsioonil eristatakse kolme staadiumi (jn. 9.7).
1. Uue RNA-ahela alustamine e. initsiatsioon (ingl. initiation).
2. Ahela pikenemine e. elongatsioon (ingl. elongation).
3. Transkriptsiooni lõpetamine e. terminatsioon (ingl. termination) ja valmis RNAmolekuli vabanemine.
Transkriptsiooni kirjeldamisel kasutatakse termineid „ülesvoolujärjestused” (ingl.
upstream sequences) ja „allavoolujärjestused” (ingl. downstream sequences) tähistamaks
DNA piirkondi, mis jäävad transkribeeritavast alast kodeerivas DNA-ahelas vastavalt
5´- ja 3´-otsa suundadesse. Selline eristus põhineb faktil, et RNA süntees toimub alati
suunas 5´ → 3´. Geeni üles- ja allavoolujärjestused kirjeldavad seega geeni 5´ ja 3´ DNAjärjestusi, mis jäävad transkriptsiooni alguspunktist vastavalt vasakule või paremale.
Prokarüootidel algab translatsioon ja mRNA-molekulide degradatsioon sageli enne,
kui nende süntees (transkriptsioon) veel lõpebki. Selline samaaegne toime on võimalik,
sest mRNA-molekulid sünteesitakse, transleeritakse ja degradeeritakse samaselt, suunas
5´ → 3´. Lisaks pole prokarüootidel peptiidide sünteesi masinavärk (valgu süntees) ruumiliselt mRNA sünteesist eraldatud – neil pole tuumamembraaniga piiritletud tuuma nagu
ka teisi membraaniga ühendatud organelle.
1.2.1. RNA polümeraas
Prokarüootide RNA polümeraas on multimeerne valk molekulmassiga ca 480 000 daltonit. RNA polümeraas koosneb viiest alaüksusest e. alaühikust. Kompleksse RNA
polümeraasi molekuli e. holoensüümi (ingl. holoenzyme) koostis on α2
ββ´σ ning selline
270Transkriptsioon ja RNA protsessing
kompleks on vajalik transkriptsiooni initsieerimiseks (alustamiseks). Elongatsiooni viib
läbi RNA polümeraasi põhiensüüm e. apoensüüm (ingl. apoenzyme), mis on tetrameerne
valk koostisega α2
ββ´.
α-subühikud osalevad RNA polümeraasi apoensüümi assambleerimisel (kokkupakkimisel), β-subühik sisaldab ribonukleosiidtrifosfaadi seondumissaiti ja β´-subühik
DNA matriitsahelaga seondumise piirkonda. Sigmafaktor (ingl. sigma (σ) factor) on
vajalik vaid transkriptsiooni initsiatsiooniks. Pärast transkriptsiooni alustamist ta vabaneb ning RNA-ahela edasist pikenemist (elongatsiooni) viib läbi juba RNA polümeraasi
apoensüüm. Sigmafaktori funktsiooniks on ära tunda ja seondada RNA polümeraas
DNA-promootorsaiti. Bakteritel on mitmed erinevad ning spetsiif lised sigmafaktorid,
mis võimaldavad RNA polümeraasil seonduda erinevate promootorjärjestustega. Neist
põhiline on σ70. RNA polümeraasi holoensüüm (σ esineb) on võimeline alustama RNAahela sünteesi ka in vitro, kuid üksnes samadest saitidest kui in vivo. Seevastu R NA
polümeraasi apoensüüm (σ puudub) on võimeline läbi viima RNA sünteesi in vitro ainult
ebaspetsiif liselt. Sel puhul toimub RNA sünteesi alustamine (initsiatsioon) juhuslikult
jaotuvatest punktidest ning mõlemalt DNA-ahelalt.
1.2.2. RNA-ahela initsiatsioon
Transkriptsiooni initsiatsioon jaotatakse kolmeks etapiks.
1. RNA polümeraasi holoensüümi seondumine DNA promootorpiirkonda.
2. RNA polümeraasi toimel DNA kaksikahela lokaalne lahtikeerdumine, millega
matriitsahel muutub vabaks, et võimaldada paardumist saabuvate ribonukleotiididega.
DNA
DNA
DNA
RNA polümeraas
RNA 5´-ots
Kasvav RNA-ahel
Valmis RNA-molekul
RNA-ahela initsiatsioon
RNA-ahela elongatsioon
RNA-ahela terminatsioon
1
2
3
Joonis 9.7. Prokarüootse transkriptsiooni kolm etappi: initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon.
Transkriptsioon ja RNA protsessing
271
3. Fosfodiestersideme moodustumine, kus kasvavasse RNA-ahelasse lülitatakse esimesed ribonukleotiidid.
RNA polümeraasi holoensüüm jääb promootoriga seotuks (ilma et RNA polümeraas
liiguks mööda DNA-ahelat edasi) esimese 8–9 fosfodiestersideme moodustumisel. Transkriptsiooni initsiatsioonil sünteesitakse seega lühikesi RNA-lõike (2–9 nukleotiidi). Kui
need vabanevad, siis sellega transkriptsioon ka lõpeb ning tegemist on abortiivse transkriptsiooniga (ingl. abortive transcription). Abortiivne transkriptsioon lõpeb juhul, kui
on sünteesitud juba 10 või rohkem ribonukleotiidi. Sel juhul vabaneb sigmafaktor ning
RNA polümeraasi põhiensüüm (apoensüüm) liigub edasi mööda DNA-ahelat promootorist allavoolu ning jätkab RNA-ahela elongatsiooni (pikendamist).
Kokkuleppeliselt nummerdatakse transkriptsiooni initsiatsiooni piirkonnas
nukleotiide, lähtudes transkriptsiooni initsiatsioonisaidist. Esimene nukleotiidipaar
(märgitakse +1) vastab RNA transkripti esimesele (5´) nukleotiidile. Initsiatsioonisaidile
eelnevaid nukleotiidipaare tähistatakse miinusmärgiga, initsiatsioonisaidile järgnevaid
plussmärgiga. Nimetatud järjestusi nimetatakse ka vastavalt üles- ja allavoolu esinevateks nukleotiidijärjestusteks.
Prokarüootsed promootorid erinevad üksteisest oluliselt. Selleks, et sigmafaktor saaks spetsiif liselt ära tunda promootoripiirkonna, on vajalikud konserveerunud
nukleotiidijärjestusega piirkonnad. Kahe konserveerunud piirkonna keskpunktid
asuvad 10 ja 35 nukleotiidipaari kaugusel transkriptsiooni initsiatsioonisaidist ülesvoolu
ning neid järjestusi nimetatakse seepärast vastavalt –10- ja –35-järjestusteks (ingl.
–10 and –35 sequences) (jn. 9.8). Kuivõrd need järjestused on erinevatel liikidel pea
ühesugused, nimetatakse neid konsensusjärjestusteks (ingl. consensus sequences). Tavaliselt on need järjestused heksameersed: –10-järjestus mit ematriitsahelal on TATAAT
ja –35-järjestus TTGAGC. Kuna sigmafaktor tunneb kõigepealt ära –35-järjestuse ja
seondub sellega, siis nimetatakse seda järjestust ka äratundmisjärjestuseks (ingl.
recognition sequence). AT-rikas –10-järjestus võimaldab DNA-s esmast kaksikahelate
lahtikeerdumist, andes eelduse, et RNA süntees saaks üldse alata. Üldiselt on –10- ja
–35-järjestuste vahemaa tugevasti konserveerunud: mit e kunagi pole see väiksem kui
15 ja suurem kui 20 nukleotiidipaari. Transkriptsioooni alguspunkt jääb –10-järjestusest
5–9 nukleotiidi allavoolu. Geeni RNA-transkripti esimeseks 5´-aluseks on E. coli´l üle
90%-l juhtudest puriin.
1.2.3. RNA-ahela elongatsioon
R NA-ahela elongatsiooni katalüüsib R NA polümeraasi põhiensüüm, millest on
vabanenud sigma faktor. RNA-ahelate kovalentsete sidemetega (ribonukleotiidide lisandumisega) pikenemine toimub transkriptsioonisilmas lokaalselt lahtikeerdunud DNA
alal. RNA polümeraasil on nii DNA-d lahtikeerav kui ka tagasi kokkukeerav aktiivsus:
RNA polümeraas katalüüsib pidevalt DNA-ahelate lahtikeerdumist enne polümerisatsioonisaiti ning põhjustab komplementaarsete ahelate kokkukeerdumist pärast
polümerisatsioonisaiti, liikudes samal ajal piki DNA kaksikheeliksit edasi (jn. 9.9).
E. coli´l on transkriptsioonisilma keskmine pikkus 18 nukleotiidipaari ning sekundis lülitatakse kasvavasse RNA-ahelasse ca 40 ribonukleotiidi. Tekkiv R NA-ahel
vabaneb DNA matriitsahelalt RNA polümeraasi edasiliikumisel mööda DNA-d. Tegelik
272Transkriptsioon ja RNA protsessing
T T A
A A T
A A C T G T
T T G A C A
A
T
A
T
A
T
T
või
C
A
või
G
16–19 bp
5 – 9 bp Äratundmisjärjestus e.
–35-järjestus
-10-järjestus Transkriptsioon
Matriitsahel
Mittematriitsahel
5´
5´ 3´
3´
Transkriptsioonisilm
Ülesvoolusuund Allavoolusuund
Joonis 9.8. E. coli tüüpiline promootor. RNA polümeraas seostub promootori –35-järjestusega ja initsieerib
DNA-ahelate lahtikeerdumise A-T-rikkas –10-piirkonnas. Transkriptsioon algab transkriptsioonisilma saidis, mis on –10-järjestusest 5–9 bp allavoolu.
DNA kaksikheeliks
RNA polümeraas
Lühike DNA/RNA
kaksikheeliks
DNA
Lahtikeerdumissait
Kinnikeerdumissait
Lahtikeerdumissait
Kinnikeerdumissait
Ribonukleotiidide
sisenemise sait
Kasvav RNAahel
DNA kaksikheeliks
Kasvav RNAahel
Transkriptsioonikompleks
A
B
RNA polümeraasi liikumissuund
DNA
RNA polümeraas
5´
5´
3´
3´
Transkriptsioonisilm
Joonis 9.9. RNA polümeraasi poolt katalüüsitav RNA-ahela pikenemine (elongatsioon) E. coli´s. A. RNA
polümeraas seondub DNA-ga ja pikendab kovalentselt RNA-ahelat. B. RNA polümeraas liigub allavoolu
koos RNA-ahela pikenemisega.
Transkriptsioon ja RNA protsessing
273
paardumisala DNA matriitsahela ja kasvava RNA-ahela vahel on lühikene – pikkus kuni
kolm nukleotiidipaari. Seetõt u saavutatakse transkriptsioonikompleksi stabiilsus tänu
DNA-ahela ja kasvava RNA-ahela seondumisele RNA polümeraasiga.
1.2.4. RNA-ahela terminatsioon
RNA-ahela süntees lõpetatakse (termineeritakse) siis, kui RNA polümeraas kohtab
terminatsioonisignaali (ingl. termination signal). Terminatsioonisignaal põhjustab
transkriptsioonikompleksi dissotsieerumist ning moodustunud RNA-molekuli vabanemist. E. coli´l tuleb et e kaht tüüpi transkriptsiooni terminatsiooni:
1) Rho-sõltuv terminatsioon (ingl. rho-dependent termination), kus Rho-valgu olemasolu on hädavajalik;
2) Rho-sõltumatu terminatsioon (ingl. rho-independent termination), kuis Rhovalgu olemasolu pole vajalik.
Transkriptsiooni terminatsioonijärjestust, mis tunneb ära Rho(ρ)-valgu, nimetatakse
Rho-sõltuvaks terminaatoriks, Rho-valku mit etundvaid terminatsioonijärjestusi aga
Rho-sõltumatuteks terminaatoriteks.
Rho-sõltumatud terminaatorid sisaldavad DNA-s GC-rikast piirkonda, millele järgneb 6 või rohkem AT-aluspaari, kus N-alus A asub matriitsahelas (jn. 9.10). GC-rikas
piirkond asub DNA-s selliselt, et üksikahelalises RNA-s saab vastav piirkond moodustada sekundaarseid kaksikahelalisi RNA piirkondi (juuksenõelasarnaseid struktuure).
Juuksenõelastruktuurid (ingl. hairpin structures) moodustuvad kohe pärast vastavate
RNA piirkondade sünteesi. Sellega aeglustatakse RNA polümeraasi liikumist mööda
DNA-d (põhjustab pause ahela pikenemisel). Kuna järgnev AU-aluspaardumine nõuab
CCCACTGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTTTCTTTCTTTAATGA
GGGTGACGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAAAAGAAAGAAATTACT
Voltunud RNA-ahel soodustab RNAahela transkriptsiooni terminatsiooni
Inverteeritud järjestuste
transkriptsioon
CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUUUU -OH
5´
3´
3´
5´
5´ 3´
5´
C C C A C
G C
A U
C G
C G
G C
C G
C G
G C
T A
U U U U U U -OH
U C C
3´
Matriitsahel
RNA kiire voltumine RNA transkript
RNA juuksenõelastruktuur
DNA
Inverteeritud järjestused
U G
J o o n i s 9.10 . R h o - s õ l t u m a t u
transk riptsiooni terminatsioon
prokarüootidel. R ho-sõltumatu
terminatsioonijärjestus on G-Crikas inverteeritud järjestustega
piirkond, millele järgneb minimaalselt 6 A-T-aluspaari. G-C-rikas
piirkond moodustab RNA transk riptis juuksenõelastr uktuuri
(ahelasisese R NA kaksikahela),
millega takistatakse RNA polümeraasi liikumist piki DNAm o l e k u l i j a p õ h j u s t a t a k s e
transk riptsiooni terminatsioon
külgnevas A-T-rikkas piirkonnas.
274Transkriptsioon ja RNA protsessing
ahelate lahknemiseks vähem energiat (kaks H-sidet), siis RNA transkripti U-piirkonna
süntees soodustab uuestisünteesitud RNA-ahela lahtitulekut (dissotsieerumist) DNA
matriitsilt juhul, kui eelnevalt oli moodustunud GC-juuksenõelastruktuur ja RNA polümeraasi liikuvus oli seetõt u aeglustunud.
Rho-sõltuvad terminaatorid (nt. rRNA sünteesi puhul) on samuti GC-rikkad piirkonnad, kus RNA transkriptis on valdavalt C-nukleotiidid. Rho-valk seondub kasvava
RNA-ahelaga ja liigub transkriptsioonikompleksi järel mööda RNA-d suunas 5´→ 3´ ning
kui RNA polümeraas aeglustab oma liikumist või peatub Rho-sõltuva terminatsioonijärjestuse juures, siis jõuab Rho-valk RNA polümeraasile järele ja tõukab sünteesitud
RNA-ahela transkriptsioonikompleksist (transkriptsioonisilmast) välja.
Meeldejätmiseks
• RNA sünteesil on kolm etappi: initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon.
• Transkriptsiooni katalüüsivad RNA polümeraasid on komplekssed multimeersed ensüümid.
• RNA-ahela kovalentne pikenemine toimub DNA lokaalselt lahtikeerdunud ahelate piirkonnas.
• RNA-ahela pikenemine katkeb, kui RNA polümeraas kohtab transkriptsiooni terminatsiooni signaali.
• Prokarüootidel toimub mRNA-molekulide transkriptsioon, translatsioon ja degradatsioon sageli samal ajal.
1.3. Transkriptsioon ja RNA protsessing eukarüootidel
Eukarüootidel transkribeeritakse korraga valdavalt vaid üht geeni, kuid siiski on multigeensete transkriptide osa eukarüootidel väga suur. Näiteks varbussi (Caenorhabditis
elegans) transkriptidest on üks neljandik multigeensed. Kuigi eukarüootidel on kolme
tüüpi RNA polümeraase, läbivad eukarüootsed transkriptid ikkagi sarnased protsessingud. Eukarüootsete transkriptide modif katsioon toimub enne transkriptide transporti
tuumast tsütoplasmasse. Põhilisi modif katsioonitüüpe on kolm (jn. 9.11).
1. mRNA esmase (primaarse) transkripti 5´-otsa lisatakse vastupidises suunas
5´-5´-fosfaatsidemega 7-metüülguanosiin-5´-müts (ingl. 5´cap).
2. Transkriptide 3´-otsa lisatakse polü(A)-polümeraasi (ingl. poly(A) polymerase)
abil 20– 200 nukleotiidi pikad polü(A)-sabad (ingl. poly(A) tails).
3. Intronid splaissitakse transkriptidest välja.
Eukarüootide tuumas olevaid primaarseid transkripte nimetatakse heterogeenseks
tuuma-RNA-ks e. hnRNA-ks (ingl. heterogenous nuclear RNA, hnRNA), sest see koosneb väga erineva suurusega RNA-molekulidest. Suurem osa hnRNA-st on mit ekodeeriv
ning sisaldab intronite järjestusi. Pärast tuumas toimuvat RNA-protsessingut (ingl.
RNA processing) kaetakse transkriptid RNA-seoseliste valkudega (ingl. RNA-binding
proteins). Need valgud kaitsevad RNA-d teda lagundavate ensüümide e. ribonukleaaside
(ingl. ribonucleases) toime eest (transkriptide transportimisel tuumast tsütoplasmasse).
Selline transkriptide valguline kaitse on vajalik, sest eukarüootsete geenide transkriptide
poolestusaeg on oluliselt pikem kui prokarüootidel (ca 5 tundi, võrreldes E. coli transkriptide vähem kui 5 minutiga).
Transkriptsioon ja RNA protsessing
275
O P O
O
CH2 O P
O
O
O P
O
O
O H
H O
CH2
OH
H
OH
O P O
O
O
O
O
H
H H
H
CH3
CH3
N
+
N N
N
OH
N H2
5´
3´
5´
2´
N-alus
Riboos 7-metüülguanosiin
DNA
Pre-mRNA
5´-müts
5´-müts
5´-müts
5´-müts
3´-polü(A)-saba
3´-polü(A)-saba
3´-polü(A)-saba
-AAAAA(A)~190AAAA-OH
3´
Intron
Transkriptsioon
1
2
3
7-MG-mütsi lisamine
5´-otsa
Polü(A)-saba lisamine
3´-otsa
Introni kõrvaldamine
splaissingul
mRNA
Intron
Intron
Endonukleaasse
katke sait
Joonis 9.11. Eukarüootsete geenide kolm transkriptsioonijärgset RNA protsessingu sündmust. 1 – 7-metüülguanosiin-(MG)-mütsi lisamine pre-mRNA 5´-otsa 5´-5´-fosfaatsidemega. 2 – polü(A)-saba lisamine 3´-otsa. 3 – intronite kõrvaldamine geeni splaissingul.
276Transkriptsioon ja RNA protsessing
1.3.1. Kolm RNA polümeraasi
Kõikides eukarüootides (k.a. näiteks üherakulised pärmseened) on kolm tüüpi RNA
polümeraase: RNA polümeraas I, II ja III (ingl. RNA polymerases I, II and III) (jn. 9.12).
Kõik need polümeraasid on palju komplekssemad kui prokarüootide RNA polümeraas.
Nad sisaldavad 10 või rohkem alaüksust. Erinevalt prokarüootide RNA polümeraasidest
on kõigi eukarüootsete polümeraaside töötamise eeltingimuseks transkriptsiooni initsiatsioonil transkriptsioonifaktorite olemasolu.
Resistentne
Tundlik Osaliselt tundlik
tRNA, 5S rRNA,
snRNA Pre-mRNA 5,8S rRNA, 18S rRNA,
23S rRNA
RNA
polümeraas I
RNA
polümeraas III
RNA
polümeraas II
Tuumake Tuum
Tundlikkus Į-amanitiini suhtes
siRNA,
siRNA antisenssjärjestused
RNA
polümeraas V
Taimeraku tuum
siRNA
RNA
polümeraas IV
Kromatiini ümbermodelleerimine
Joonis 9.12. Eukarüootide kolme eri tüübi RNA polümeraasi üldiseloomustus. RNA polümeraas I on tuumakeses, RNA polümeraasid II ja III tuumas ning RNA polümeraasid IV ja V esinevad vaid taimerakkudes
kromatiini ümbermodelleerimise teostamisel siRNA või siRNA märklaudjärjestuste antisenssjärjestuste
moodustamisel.
Eukarüootide RNA polümeraas I paikneb tuumakeses, kus sünteesitakse rRNA ning mis
seostatakse ribosoomivalkudega juba tsütoplasmas. RNA polümeraas I katalüüsib kõigi
rRNA-de sünteesi, v.a. 5S rRNA. Vaid RNA polümeraas II transkribeerib valke kodeerivaid tuuma geene, s.t. sünteesib pre-mRNA-d, aga ka miRNA-d. RNA polümeraas
III katalüüsib tRNA-, 5S rRNA- ja snRNA-molekulide sünteesi. Erinevatel eukarüootsetel RNA polümeraasidel on erisugune tundlikkus α-amanitiini suhtes: polümeraas
I pole tundlik, polümeraas II aktiivsus inhibeeritakse täielikult juba mürgi madalatel
kontsentratsioonidel ja polümeraas III on vahepealse tundlikkusega. α-amanitiin on
metabolismimürk, mida sisaldab kärbseseen (Amanita phalloides).
1.3.2. RNA-ahela initsiatsioon
Eukarüootsed RNA polümeraasid pole, erinevalt prokarüootsest RNA polümeraasist,
võimelised initsieerima ise transkriptsiooni. Eukarüootsete RNA polümeraaside seondumiseks DNA-ga on eelnevalt vajalik põhiliste transkriptsioonifaktorite (ingl. basal
transcription factors) seondumine promootorijärjestustega. Seejuures on promootorid ja
transkriptsioonifaktorid erisuguste geenide puhul väga erinevad.
Kõikide RNA polümeraaside puhul toimub DNA kaksikahelate lokaalne teineteisest eraldumine ning vaba matriitsahela moodustumine. Transkriptsiooniüksuse
Transkriptsioon ja RNA protsessing
277
promootoriga interakteeruvad seejuures mitmed erinevad transkriptsioonifaktorid. RNA
polümeraas II poolt äratuntavad promootorid sisaldavad konserveerunud järjestuselemente e. mooduleid, mis asuvad transkriptsiooni algussaidist ülesvoolu. Joonisel 9.13
on esitatud hiire tümidiinkinaasi geeni promootori konsensusjärjestused. Teised RNA
polümeraas II poolt äratuntavad promootorid sisaldavad neist komponentidest vaid osa.
Tran skriptsiooni algussaidile (+1) lähim konsensusjärjestus on TATA-järjestus (ingl.
TATA box) konsensusjärjestusega TATA A A A (lugedes mittematriitsahelal suunas
5´→ 3´), mis paikneb keskmisest nukleotiidist ca –30 nukleotiidi kaugusel. TATA-järjestusel on üks tähtsamaid rolle transkriptsiooni algussaidi positsioneerimisel. Siiski ei ole
pea pooltel geenidel TATA-järjestusi või neil on sarnane järjestus võrrelduna TATA-ga.
Teist konserveerunud järjestust nimetatakse CAAT-järjestuseks (ingl. CAAT box) ning
see asub keskmise nukleotiidi suhtes tavaliselt positsioonis –80 ning tal on konsensusjärjestus GGCCAATCT. Kolmandaks konsensusjärjestuseks on GC-järjestus (ingl. GC
box) konsensusjärjestusega GGGCGG ja neljandaks oktameerne järjestus (ingl. octamer box) konsensusjärjestusega AT TGCAT. Viimatinimetatud kaht konserveerunud
järjestust ei ole kõigil RNA polümeraasi II poolt äratuntavatel promootoritel. Nende olemasolu tõstab aga promootorite transkriptsiooni initsiatsiooni efektiivsust.
Nagu juba nimetasime, on RNA polümeraas II seondumiseks DNA-ga vajalik promootori eelnev seondumine rea põhiliste transkriptsioonifaktoritega. Lisaks seonduvad
ja interakteeruvad promootoriga veel mitmed transkriptsioonifaktorid, mida nimetatakse
tugevdajateks e. enhanseriteks (ingl. enhancers) ja nõrgestajateks e. vaigistajateks
(ingl. silencers).
Põhiliste transkriptsioonifaktorite seondumine peab toimuma kindlas järjekorras
ja viisil. RNA polümeraas II puhul tähistatakse basaalseid transkriptsioonifaktoreid
sümboliga TFIIX, kus X tähistab individuaalset transkriptsioonifaktorit. Promootori
põhilise transkriptsiooni initsiatsioonikompleksi moodustumine algab interaktsioonil
TFIID promootoriga (jn. 9.14). TFIID sisaldab TATA-seoselist valku, mis seondub
TATA-järjestusega. Järgmisena ühineb TFIIA ja seejärel järjestatult teised transkriptsioonifaktorid. Transkriptsioonifaktor TFIIF seondub aga esmalt RNA polümeraasiga
-140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0
+1
Transkriptsiooni
alguspunkt
ATTTGCAT
konsensus
GGCCAATCT
konsensus
TATAAAA
konsensus
GGGCGG
konsensus
GGGCGG
konsensus
Oktameerne
järjestus
GCjärjestus
CAATjärjestus
TATAjärjestus
GCjärjestus
Joonis. 9.13. RNA polümeraasi II äratundva promootori struktuur. TATA- ja CA AT-järjestused asuvad pea
samades kohtades enamiku eukarüootide promootorites. GC- ja oktameersed järjestused võivad esineda või
ka puududa: kui nad esinevad, asuvad nad väga erinevates kohtades ja neil on väga erinev koopiaarv.
278Transkriptsioon ja RNA protsessing
5´
3´
3´
5´
-50
5´
3´
3´
5´
ATATTTT
TATAAAA
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
5´
A
A
ATATTTT
TATAAAA
B
ATATTTT
TATAAAA
5´
3´
3´
5´
A
B
ATATTTT
TATAAAA
F
5´
3´
3´
5´
A
B
ATATTTT
TATAAAA
F
E
-30 -10 +10 +30
+1 Transkriptsiooni
alguspunkt
+1
+1
+1
+1
+1
RNA polümeraas II
Transkriptsioonifaktor
TFIID seondub
TATA-järjestusega
1
2
3
Transkriptsioonifaktor
TFIIA seondub
initsiatsioonikompleksiga
Transkriptsioonifaktor
TFIIB seondub
initsiatsioonikompleksiga
Transkriptsioonifaktor
TFIIF (lahtikeerav
aktiivsus) ja RNA
polümeraas II seonduvad
initsiatsioonikompleksiga
Transkriptsioonifaktor
TFIIE seondub
initsiatsioonikompleksiga
4
5
D
D
Joonis 9.14. Eukarüootse transkriptsiooni initsiatsioon RNA polümeraas II-ga. Esmalt seondub DNA-ga transkriptsioonifaktor TFIID (1), seejärel järjestikuliselt TFIIA (2),
TFIIB (3), TFIIF (millel DNA-d lahtikeerav aktiivsus) koos RNA polümeraas II-ga (4) ja initsiatsioonikompleksi moodustamise lõpetab TFIIE (5).
Transkriptsioon ja RNA protsessing
279
II ning nende kompleks ühineb edaspidi juba transkriptsiooni initsiatsiooni kompleksiga. TFIIF koosneb kahest alaüksusest, millest ühel on DNA-d lokaalselt lahtikeerav
aktiivsus. Lõpuks seondub initsiatsioonikompleksiga transkriptsioonifaktor TFIIE,
mis seondub DNA-ga transkriptsiooni alguspunktist allavoolu (transkriptsioonikompleksi et e). Lisaks tuleb nimetada transkriptsioonifaktorit TFIIH, mis seondub pärast
TFIIE-d. TFIIH-l on helikaalne aktiivsus ning ta liigub elongatsiooniprotsessis koos RNA
polümeraas II-ga mööda DNA-d, keerates DNA-ahelaid transkriptsioonisilmas lahti.
R NA polümeraaside I ja III promootorid on märgatavalt erineva nukleotiidse
järjestusega, ehkki nad võivad sisaldada RNA polümeraas II promootoritega samu cis-toimelisi elemente (ingl. cis-acting elements). RNA polümeraas I promootorid on kahetised,
kus põhijärjestused lokaliseeruvad piirkonnas –45 kuni +20 ning lisaks seonduvad kontrollelementidega ülesvoolu piirkonnas –180 kuni –105. Neil kahel piirkonnal on sarnased
nukleotiidsed järjestused ning nad on GC-rikkad alad. Transkriptsiooni initsiatsiooniks
piisab põhijärjestusest, kuid transkriptsiooni initsiatsiooni efektiivsust tõstab tugevalt
ülesvoolu esinev kontrollelement (enhanser). Erinevalt RNA polümeraasidest I ja II asub
enamus RNA polümeraas III promootorjärjestustest hoopis transkriptsiooni initsiatsioonisaidist allavoolu.
1.3.3. RNA-ahela elongatsioon ja 5´-metüülguanosiinmütsi lisamine
Pärast seda kui RNA polümeraas vabaneb promootori initsiatsioonikompleksi põhilistest
transkriptsioonifaktoritest, järgneb RNA-ahela pikenemine (elongatsioon) sama mehhanismi alusel, nagu seda teeb prokarüootide RNA polümeraas.
Paralleelselt elongatsiooniga, kui kasvav RNA-ahel on vaid ca 30 nukleotiidi pikkune, toimub pre-mRNA 5´-otsa modifitseerimine (jn. 9.15). Pärast transkriptsiooni
GTP
2´-O-metüültransferaas
Transkriptsiooniüksus
RNA polümeraas II
Lühike DNA/RNA
kaksikheeliks
Lahtikeerdumissait
Kinnikeerdumissait
Ribonukleotiidide
sisenemise sait
Pre-mRNA
DNA
5´ 7-MG
5´
3´
CH3-GpppNpNp
CH3
CH3-GpppNpNp
GpppNpNp
pppNpNp
Guaniin-7-metüültransferaas
Guanüültransferaas PPi + Pi
5´-müts
Joonis 9.15. 7-metüülguanosiinmütsi lisamine biosünteesiahelale.
7-me t ü ü l g u a no s i i n - (7- MG -)
müts lisatakse pre-mR M A 5´-otsa
(5`-5`-trifosfaat: ebaharilik side)
pea kohe pä ra st elongatsioon i
algust.
280Transkriptsioon ja RNA protsessing
lisatakse raku biosünteetilise ahela toimel 7-metüülguanosiin-(7-MG)-müts. 7-MG
lisatakse 5`-otsa tagurpidi ebahariliku 5´- 5´-trifosfaatse sidemega ning ta sisaldab kaht
või rohkemat metüülgruppi. 7-MG-mütsi tunnevad ära valgulised faktorid, mis toimivad
translatsiooni initsiatsioonil. 7-MG-müts aitab ka oluliselt kaitsta kasvavat RNA-ahelat
nukleaaside de gradatsiooni eest.
Kuivõrd eukarüootne DNA on seotud nukleosoomsesse struktuuri, peavad transkriptsioonil nukleosoomid kas lagunema või võimaldama neis seotud DNA-ahela
transkriptsiooni muul viisil. Selgus, et R NA polümeraas II on võimeline mööduma
nukleosoomidest kromatiini transkriptsiooni soodustava valgulise FACT-kompleksi
(ingl. facilitates chromatin transcription) olemasolul. FACT-kompleks kõrvaldab nukleosoomist histoonide H2A/H2B dimeerid, jät es sellega nukleosoomid heksameerseteks.
Pärast polümeraas II möödumist nukleosoomikohast restaureeritakse algsed nukleosoomid (taaslülituvad H2A/H2B dimeerid) FACT-kompleksiga kaasnevate muude valkude
koostoimel. Samas, sõltuvalt olukorrast, võivad nukleosoomid vabaneda ka täies ulatuses
ja asendatakse uutega (s.t. et toimub de novo nukleosoomse struktuuri taastamine) juba
pärast transkriptsiooni.
1.3.4. RNA-ahela terminatsioon ja 3´-polü(A)-saba lisamine
RNA polümeraas II ei tunne ära spetsiifilisi terminatsioonisignaale. Seetõttu moodustuvad transkripti 3´-lõpud endonukleaasse lõikamise tulemusena. Tavaliselt
termineerub transkriptsioon paljudes erinevates punktides ning piisava varuga, tüüpiliselt 1000–2000 nukleotiidi allavoolu hilisemast küpsenud (valminud) transkripti
3´-otsast. Transkripti 3´-ots täpsustatakse endonukleaasi toimel. Tavaliselt moodustub
Transkriptsiooniüksus
RNA polümeraas II
AAUAAA GC-rikas järjestus
Polü(A)-saba
Lõikamine endonukleaasiga
-müts
5´ 7-MG
5´
3´
Endonukleaasne katke
AAUAAA
5´ 3´
-müts
AAUAAA
5´ AAAAA(A)195 3´
Polü(A)-saba lisamine
polü(A)-polümeraasi abil
Joonis 9.16. Polü(A)-saba lisamine
eu ka r üood i tra nsk r ipt i 3´-otsa
ensüümiga polü(A)-polümeraas.
Polü(A)-polümeraasile vajalik vaba
3´-OH ots moodustub pre-mRNA
transkriptil polüadenülatsioonisignaalist allavoolu ja enne GC-rikast
järjestust endonukleaasse katkemisega. Polüadenülatsioonisaidis on
konsensusjärjestus A AUA A A.
Transkriptsioon ja RNA protsessing
281
lõikamisel 3´-ots 11–30 nukleotiidi kaugusel allavoolu RNA transkriptis olevast konsensusjärjestusest AAUAAA ning ülesvoolu DNA transkriptsiooniüksuse lõpu lähedal
paiknevast GC-rikkast piirkonnast (jn. 9.16). Pärast endonukleaasset lõikamist lisab
ensüüm polü(A)-polümeraas transkripti 3´-otsa polü(A)-saba, mis koosneb kuni 200
ühesugusest nukleotiidist – adenosiinmonofosfaadist. Seda protsessi nimetatakse polüadenülatsiooniks (ingl. polyadenylation). Järelikult on polü(A)-saba moodustamiseks
vaja transkripti spetsiif list 3´-otsa, mis moodustub AAUAAA-järjestust äratundva komponendi, GC-rikka järjestust stimuleeriva faktori, endonukleaasi ja polü(A)-polümeraasi
toimel. Eukarüootide mRNA polü(A)-saba suurendab oluliselt transkripti stabiilsust ja
tal on tähtis rolll mRNA transportimisel tuumast tsütoplasmasse.
RNA polümeraasid I ja III tunnevad aga ära kindlaid terminatsioonisignaale. RNA
polümeraas I termineerib transkriptsiooni 18 nukleotiidi pikkusega järjestusel, kuhu on
eelnevalt seondunud terminatsioonivalk. RNA polümeraas III reageerib terminatsioonisignaalile analoogselt E. coli´s toimuva Rho-sõltumatu terminatsiooniga.
1.3.5. RNA korrektuur
Molekulaarbioloogia põhidogma kohaselt ei muutu geneetilise informatsiooni ülekande
vaheetappidel (DNA-st mRNA-ks) geneetiline informatsioon. Erandjuhtudel võib see
aga siiski toimuda. Üheks RNA muutumise mehhanismiks on RNA korrektuur e. RNA
redigeerimine (ingl. RNA editing), kus mRNA-s olevat geneetilist informatsiooni muudetakse juba sünteesitud mRNA-molekulis. RNA editeerimisel muudetakse vastava geeni
geneetilist informatsiooni kahel viisil:
1) üksikute N-aluste struktuuri muutmisega;
2) uridiinmonofosfaadi jääkide (U) lisamise või kõrvaldamisega.
1.3.5.1. Lämmastikaluste muutmine mRNA-s
RNA editeerimisel muudetakse mRNA-molekulis lämmastikaluste struktuuri. Seda
protsessi tuleb harva et e, vaid üksikutel spetsiif listel juhtudel. Näiteks toimub C → U
konversioon, kus järjestikuspetsiifiline RNA-ga seonduv valk kõrvaldab tsütosiinist
aminogrupi. Nimetatud protsess toimub näiteks CAA- (glutamiini-) koodonis, mis
muudetakse tsütosiini desamiinimisel transkriptsiooni terminatsioonikoodoniks UAA.
Järelikult kõrvaldatakse siin geeni avaldumine mRNA editeerimise tasemel, sest stoppkoodoni moodustumisel ei saa tekkida enam terviklikku polüpeptiidi – vastava geeni
produkti. Järelikult on mRNA editeerimisel geeni avaldumisele regulatiivne toime.
Käsitletavat tüüpi R NA editeerimine avastati roti ja inimese apolipoproteiin-B
(apo-B) geenide mRNA-de puhul (jn. 9.17). Apolipoproteiinid on veres olevad valgud,
mis transpordivad erinevat tüüpi rasvamolekule. Maksas kodeerib apolipoproteiini
apo-B-mRNA terviklikku 4563-aminohappelist polüpeptiidi, seedetraktis aga lühikest
2153-aminohappelist polüpeptiidi, sest C → U konversiooniga moodustus siin transkriptsiooni terminaatorkoodon UA A. Sama tüüpi N-aluste konversiooni on näidatud ka
rot ide ajurakkudes glutamaadi retseptorvalgu puhul. Taimede mõnedes mitokondriaalse
DNA määratud transkriptides muudetakse aga lausa enamik C-sid U-deks.
282Transkriptsioon ja RNA protsessing
1.3.5.2. Uridiinmonofosfaatide lisamine ja kõrvaldamine mRNA-s
U-nukleotiidide lisamine või kõrvaldamine mR NA-molekulidest on kompleksne
protsess, mida teostavad teatud mitokondriaalsete geenide poolt moodustatavad madalmolekulaarsed giid-RNA-d (ingl. guide RNAs, gRNA). Giid-RNA-d sisaldavad järjestusi,
mis on vaid osaliselt homoloogsed korrigeeritava pre-mRNA-järjestustega. Giid-RNA
ja korrigeeritava pre-mRNA paardumine põhjustab mRNA-s tühikute ja giid-RNA-s
mittepaardunud A-nukleotiidide moodustumist. R NA korrigeerimisel kasutatakse
gRNA-d matriitsina A-aluste vastu U-lämmastikaluste lisamisel mRNA tühikutesse.
Saame informatsiooniliselt muudetud e. editeeritud mRNA. Nimetatud protsessi on kirjeldatud näiteks alglooma Leishmania tarentolae mitokondrites (jn. 9.18). See viburloom
põhjustab inimesel aafrika unitõbe. Ehkki seda tüüpi RNA korrigeerimise geneetiline
tagapõhi on veel ebaselge, on selgunud, et nimetatud nähtusel on nii trüpanosoomide kui
ka taimede mitokondriaalsete geenide avaldumisel põhiroll.
3´
5´
C A A
3´
5´
COOH
CAA
GTT
CAA
5´
3´
5´
3´
5´
C A A U 3´
H2N
COOH H2N
DNA
maksas seedetraktis
Redigeerimata
mRNA
Redigeeritud
mRNA
Transkriptsioon
ja
intronite splaissing RNA-seoseline
desaminaas
RNA redigeerimine:
tsütosiini oksüdatiivne
desamiinimine
Translatsioon
Apolipoproteiin:
4563 aminohapet
Apolipoproteiin:
2153 aminohapet
Joonis 9.17. Apolipoproteiin A mRNA editeerimine loomade seedetraktis. CA A-koodonis tsütosiini oksüdatiivsel desamiinimisel moodustub tsütosiinist uratsiil ja koodon muutub stoppkoodoniks UA A. RNA
redigeerimise tulemusel moodustub üle kahe korra lühem valguline produkt.
Transkriptsioon ja RNA protsessing
283
Meeldejätmiseks
• Eukarüootidel on kolm erinevat RNA polümeraasi, mis on spetsialiseerunud eri tüüpi geenide transkriptsiooniks.
• Eukarüootsete geenide transkriptidel toimub valdavalt kolm erinevat tüüpi RNA protsessingut e.
modif tseerimist: 1. 7-metüülguanosiinmütsi lisamine 5´-otsa; 2. polü(A)-saba lisamine 3´-otsa; 3. mittekodeerivate intronjärjestuste kõrvaldamine (geeni splaissing).
• RNA redigeerimisega toimub eukarüootsete geenitranskriptide informatsiooni muutmine, sest enne
translatsiooni leiavad aset muudatused nende geenide mRNA-de nukleotiidses koostises ja järjestuses.
TTTCGCCTCTCTTTTCTTTTCCGAAATTGAAGTCCAACAAATAATGCTCATATACC
Transkriptsioon
5´
3´
3´
5´
3´ 5´
DNA matriitsahel
Pre-mRNA
AAAGCGGAGAGAAAAGAAAAGGCUUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG
5´ 3´ AAAGCGGAGAGAAAAGAAA A G G C UUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG
UUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAGU
AUAUUCAAUAAUAAAU UCAGUAUACACUAUAAUAAUAAU
3´ 5´
5´ 3´ AAAGCGGAGAGAAAAGAAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG
UUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAGU
AUAUUCAAUAAUAAAU UCAGUAUACACUAUAAUAAUAAU
5´ 3´ AAAGCGGAGAGAAAAGAAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG
Paardumine osaliselt
komplementaarse giid-RNA-ga
Uridiinmonofosfaatide insertsioon
Giid-RNA vabanemine mRNA-st
Redigeeritud mRNA
Giid-RNA
Giid-RNA
Pre-mRNA
Pre-mRNA
Joonis 9.18. Mitokondriaalse tsütokroom b pre-mRNA redigeerimine trüpanosoomil Leishmania tarentolae.
Pre-mRNA paardub osalise komplementaarsusega giid-RNA-ga. Giid-RNA paardunud lõigus on kaheksa
A-d, mis pre-mR NA-s puuduvad: paardumisel täidetakse need kaheksa tühikut uridiinmonofosfaatide
lisamisega. RNA redigeerimisel muudetakse mRNA-s olevat geneetilist informatsiooni ning saadakse muutunud redigeeritud mRNA ja translatsioonil täiesti muutunud polüpeptiid.
284Transkriptsioon ja RNA protsessing
2. GEENIDE INFORMATSIOONILINE KATKENDLIKKUS
Enamik prokarüootseid geene on pidevad, s.t. et nende nukleotiidid on järjestunud pidevalt määramaks aminohapete järjestust polüpeptiidides (geeni produktides). Seevastu
eukarüootsetes geenides paiknevad enamasti geeni kodeerivate alade vahel mit ekodeerivad alad. Seega on need geenid katkendlikud, sisaldades vahejärjestusi (ingl. intervening
sequences) e. introneid. Neid geenijärjestusi, mis jäävad mRNA koosseisu ka pärast intronite
RNA-st kõrvaldamist e. geeni splaissingut (ingl. gene splicing), nimetatakse ekspresseeruvateks järjestusteks (ingl. expressed sequences) e. eksoniteks (ingl. exons).
2.1. Eukarüootsed katkelised geenid
Ehkki intronid on enamikul loomade ja taimede geenidel, pole nad hädavajalikud, sest
osas geenides pole introneid. Esmalt näidati introniteta geenide leidumist merisiiliku
histoonigeenides ja Drosophila kuumašokigeenides. Praegu on teada aga juba väga palju
selliseid geene.
2.1.1. Eksonid ja intronid
Intronite olemasolu tõestati esmakordselt imetajate β-globiini geenil. Näidati, et hiire
β-globiini geeni mRNA, mis oli tsütoplasmast eraldatud, hübriidus selle geeni DNA-ga
vaid nendes piirkondades, kus moodustus RNA-DNA dupleks (kaksikahel). Mit ehübriidunud piirkondades oli aga DNA-ahel nähtav väljaulatuva linguna. RNA-DNA hübriidis
mit epaardunud üksikahelalisi linge hakati nimetama R-lingudeks (ingl. R-loops). Seevastu tuumast eraldatud β-globiini geeni pre-mRNA hübriidus β-globiini geeni DNA-ga
pea täies ulatuses, ilma R-linge moodustamata. Siit järeldus üheselt, et algsest mRNA-st
lõigatakse kindlad segmendid välja ja protsessitud RNA transporditakse seejärel tsütoplasmasse.
Intronitega geenid võivad olla väga komplekssed, sisaldades hulgaliselt introneid.
Kui β-globiini geenis on vaid kaks intronit (ja kolm eksonit), siis näiteks kannuskonna
(Xenopus laevis) vitelliini A2-geenis (määrab muna rebuvalgu) on 33 intronit ja tibude
1α2 kollageeni geenis 50 intronit. Kollageenigeen on 37 000 nukleotiidipaari pikkune,
kuid valminud introniteta mRNA on vaid 4600-nukleotiidiline. Senikirjeldatutest on
suurimaks geeniks inimese Duchenne’i lihasdüstroof a geen DMD, mille mutantne vorm
põhjustab selle raske päriliku haiguse teket. Nimetatud geeni pikkuseks on 2,5 miljonit nukleotiidipaari ning ta sisaldab 78 intronit. Teisalt, osas geenides, mis sisaldavad
suhteliselt vähe introneid, võib olla üksikuid väga pikki introneid. Näiteks Drosophila
Ultrabithorax’i (Ubx) geen sisaldab intronit, mis on 70 000 nukleotiidipaari pikkune.
Intronite bioloogilise tähtsuse kohta pole veel kõik teada. Osa introneid sisaldab
regulatoorseid alasid, mis mõjutavad geenide avaldumist. Tähtsaim on aga alternatiivse
splaissingu tagajärjel intronite ja eksonite väljalõikamisel saadav geenifragmentide kombinatoorika ja seetõt u erinevate geenivariantide poolt erinevate valkude moodustamine,
näiteks immuunvastusena antikehade moodustamine B-lümfotsüütidest. Ilmselt puudub osal intronitel siiski bioloogiline funktsioon. Ka arvatakse, et intronid võivad olla
nukleotiidseks varumaterjaliks uute geenide tekkel ja organismide evolutsiooniliseks
geneetiliseks reserviks.
Transkriptsioon ja RNA protsessing
285
2.1.2. RNA splaissing
Valku kodeerivate geenide pre-mRNA splaissing peab toimuma väga täpselt, et mRNA
saaks kodeerida funktsionaalset valku. Eksonite ühinemisel moodustub kahe eksoni
vahele koodon, mis on vajalik funktsionaalse valgu moodustumiseks (jn. 9.19). Intronite
täpne väljalõikamine peab toimuma nukleotiidi täpsusega. Rakutuumas asuvate valke
moodustavate geenide intronite otstes asuvad 100%-liselt konserveerunult dinukleotiidid: nimelt GT-nukleotiidid intronist 5´-suunda jääva eksoni kõrval ja AG-nukleotiidid
intronist 3´-suunda jääva eksoni kõrval. Introni otstest sissepoole jäävad vähemkonserveerunud alad. Eksoni-introni ühildumise alad on tRNA-geenide ja mitokondrite ning
kloroplastide struktuurgeenide puhul siiski erinevad ning seal esinevad seepärast ka teistsugused splaissingumehhanismid.
Lisaks esineb üks lühike konserveerunud järjestus, TACTA AC-järjestus, mille
kuuendas positsioonis asuv A on 100%-liselt konserveerunud. Pärmseente geenides on
kogu TACTAAC-järjestus konserveerunud. TACTAAC-järjestus asub tuumageenides
introni 3´-splaissingusaidist 30 nukleotiidi ülesvoolu.
Tänapäeval tuntakse RNA transkriptidest kolmesugust intronite väljalõikamise mehhanismi.
1. tRNA eellasmolekulides toimub intronite täpne endonukleaasidega väljalõikamine ning eksoneid sisaldavate RNA-segmentide ühendamiseks toimuvat
ligeerimisreaktsiooni katalüüsib spetsiif line splaissingu endonukleaas, vajalik
on ka splaissingu ligaasi aktiivsus.
2. Mõnede rRNA eellasmolekulide intronid kõrvaldatakse autokatalüütiliselt, unikaalse keemilise reaktsiooniga (splaissinguga), mida teostavad RNA-molekulid
ise (RNA kui ensüüm).
5´ 3´
Ekson 1
DNA
Intron A Intron B Ekson 2 Ekson 3
Geen
Ekson 1 Ekson 2 Ekson 3 Intron A Intron B
Koodon n Koodon n+1
Primaarne
transkript
RNA
protsessing
Transkriptsioon
Translatsioon
mRNA
Polüpeptiid
Koodon n n+1
Ekson 1 Ekson 2 Ekson 3
n n+1
Joonis 9.19. Intronite vä lja lõikamine
primaarsetest transkriptidest RNAsplaissing ul. Splaissing u mehhanism
garanteerib intronite nukleotiidilise täpsusega väljalõikamise. Ülesvoolu eksoni
koodon ühineb järgneva allavoolu asuva
eksoniga nii, et valgulises produktis saavutatakse õigete aminohapete lülitumine
polüpeptiidahelasse.
286Transkriptsioon ja RNA protsessing
3. Tuuma pre-mRNA e. heterogeenne tuuma mR NA (hnR NA) (ingl. heterogenous nuclear mRNA, hnRNA) transkriptidest lõigatakse intronid välja
kaheetapilise splaissingureaktsiooniga, mida teostab kompleksne riboproteiinne
partikkel – splaissosoom.
2.1.2.1. tRNA eellaste splaissing
tRNA eellaste splaissingul teeb katked RNA-ahelasse spetsiifiline splaissingu endonukleaas ja RNA segmentide eksonid ühendatakse splaissingu ligaasi abil. tR NA
splaissingureaktsioone on põhjalikumalt uuritud pagaripärmil (Saccharomyces cerevisiae).
Pärmseente tRNA eellasmolekulidest kõrvaldatakse intronid kaheetapiliselt (jn. 9.20).
1. Etapis I põhjustab tuumamembraaniga seondunud splaissingu endonukleaas
(ingl. splicing endonuclease) intronite otstesse kahe katke tekke.
2. Etapis II ühendab splaissingu ligaas (ingl. splicing ligase) tRNA kaks poolt, moodustades valmis tRNA.
3´ 5´
P
3´
OH
3´
OH
5´
P
3´
OH
HO
3´
OH
5´
P
5´
P
5´
P
P
OH
OH
P
Intron
tRNA eellane
Splaissingu
endonukleaas
Splaissingu
ligaas
Introni
järjestus
Küps tRNA
I etapp II etapp
Joonis 9.20. tRNA eellasmolekulist introni väljalõikamise kaheastmeline protsess. I etapp. Introni mõlemas
lõpus teostatakse splaissingu endonukleaasi toimel katkemised. II etapp. Uuesti moodustunud eksonite
lõpud ühendatakse splaissingu ligaasiga. Ligeerimisel toimub splaissingu ligaasi toimel kolm protsessi: splaissingu ligaasil on fosfodiesteraasi, kinaasi ja ligaasi aktiivsus.
Need ensüümid tunnevad ära eelkõige tRNA prekursorjärjestuse kõrgema järgu struktuure, mit e aga kindlaid nukleotiidijärjestusi per se.
2.1.2.2. Autokatalüütiline splaissing
Osade rRNA prekursorite puhul, eriti alamatel eukarüootidel (nt. Tetrahymena thermophila) ning mitokondrite ja kloroplastide rRNA-s, tRNA-s ja mRNA-s kõrvaldatakse
intronid autokatalüütiliselt RNA-molekuli enda poolt. Seda nimetatakse RNA iseeneslikuks splaissinguks e. autokatalüütiliseks aktiivsuseks (ingl. RNA self-splicing or
autocatalytic activity). RNA ensümaatilise aktiivsuse avastasid 1982. a. T omas R. Cech
Transkriptsioon ja RNA protsessing
287
(snd. 1947) ja kaastöötajad. 1989. a. said T. R. Cech ja Sidney Altman (snd. 1939) nimetatud avastuse eest Nobeli preemia.
Autokatalüütilise splaissingu mehhanism on sarnane sellega, mis toimub pre-mRNA
puhul splaissosoomide abil, kuid siin pole vaja ei välist energiaallikat ega spetsiif liste valkude aktiivsust. Selle asemel toimub rida fosfodiestersidemete ülekandeid, ilma et neid
sidemeid kaotataks või uusi loodaks. Reaktsioonil on kofaktorina vajalikud vaba 3´-OH-ga
guanosiinnukleosiidid või -nukleotiidid (GTP, GDP, GMP) ning monovalentne ja divalentne katioon. Absoluutselt vajalik on G(guanosiin)-3´-OH olemasolu. Splaissing on
etapiviisiline (jn. 9.21). Kõigepealt toimub fosfodiestersideme ülekanne eksoni-introni
ühendusalalt G(guanosiin)-3´-OH-le, mille tõttu selles punktis RNA-ahel ka katkeb.
Seejärel katkeb fosfodiesterside järgmise eksoni ja introni 3´-otsa vahel ning vastavate
eksonite vahel moodustub fosfodiesterside. Väljalõigatud intron muutub ringjaks molekuliks veel ühe fosfodiestersideme ülekandega. Järelikult ei esine siin mitte mingit
trans-katalüütilist aktiivsust (ensüümide toimel), vaid cis-katalüütiline aktiivsus, mis
on määratud RNA-molekuli struktuuri endaga.
-OH 3´
5´P5´P5´P- -OH 3´
-OH 3´
OH
U-O-P
G-OH
U-O-P
O-PUpA
UpA
U-O
G-PEkson 1
Ekson 1
Ekson 1 Ekson 2
Ekson 2
Ekson 2
Väljalõigatud
intron
Splaissitud rRNA
Intron
Intron
Introni
fragment
Rõngasjas
intron
rRNA eellane
Ribosüümne aktiivsus
Eksoni splaissing
+
Joonis 9.21. Autokatalüütilise splaissingu mehhanism Tetrahymena thermophila rR NA eellasmolekulis.
Autokatalüütiliseks splaissinguks on vaja vaba guaniinnukleosiidi või -nukleotiidi 3´-OH otsa. Fosfodiestersidemete ülekandega lõigatakse intron välja ja vabanenud intron võib tsirkulariseeruda.
2
Transkriptsioon ja RNA protsessing
289
fosfodiesterside (jn. 9.22). Protsessis osaleb kogu splaissosoom, kuid enne katke teket on
vajalik, et splaissingusaidiga seostuks esmalt U1 snRNP. Introni 5´-katkesaidi äratundmiseks on vajalik aluspaaride paardumine konsensusjärjestuse ja snRNA 5´-terminuse
lähedal oleva komplementaarse järjestusega. Teiseks snRNP-ks, mis ühineb splaissingukompleksiga, on U2 snRNP, seostudes A-jääki sisaldava konsensusjärjestusega, nn.
harusaidiga. Edasises protsessis osaleb juba kogu splaissosoom. Järgnevalt ühinebki introni 5´-ots harusaidi A-ga, moodustades nn. lariantstruktuuri ning U1 ja U4 vabanevad.
Edasi tekib katke introni 3´-splaissingusaidis, millega vabaneb eksoni 2 5´-ots. Protsessi
lõpetamisel ühineb 3´-otsa ekson 2 eksoniga 1 (fosfodiestersideme moodustumine). Vabaneb lariantstruktuur koos snRNP-dega U2, U5 ja U6.
Süsteemse erütomatoosluupuse (ingl. systemic lupus erythematosus, SLE) patsientidel on autoantikehad, millega saab snRNP-sid hõlpsasti välja sadestada. Nimetatud
autoimmuunhaiguse puhul moodustuvad organismis antikehad, mis reageerivad organismis paljudele rakulistele komponentidele, k.a. snRNP valkudele. Neid antikehasid
nimetatakse autoantikehadeks (ingl. autoantibodies). Autoantikehad põhjustavad patsientidel pikaajalist kudede närbumist ja organite kärbumist, millega võib kaasneda ka
organismi hukkumine südame-, maksa- ja neerufunktsiooni häirete tõttu.
