Oksüdatiivne fosfüülumine

Oküdatiivne fosforüülimine on mitokondri sisemembraanil toimuv metaboolne rada, mille käigus sünteesivad ensüümid ADP-st ATP-d, kasutades koensüümide NADH ja FADH₂ oksüdeerimise käigus vabanevat energiat.

Oksüdatiivse fosforüülimise skeem. Mitokondri sisemembraanil asub elektronide transpordi ahel (ETA)

ATP on eluslooduses universaalne energia talletaja ja ülekandja, mille keemiliste sidemete energia võimaldab rakkudes metabolismi. Seepärast on vajalik pidev ATP taastootmine ADP-st. Oksüdatiivne fosforüülimine toimub peaaegu kõigis aeroobsetes organismides. Anaeroobsed organismid kasutavad näiteks käärimist.

ATP sünteesiks tuleb tööle panna ensüüm ATP süntaas. Vajaminev energia saadakse redoksreaktsioonidest, mis leiavad aset mitokondri sisemises membraanis asuvates või seda läbistavates ensüümkompleksides. Need kompleksid moodustavad kokku ahela, mida nimetatakse elektronide transpordi ahelaks (ETA). Neis ensüümides liiguvad vabad elektronid mitmetel redokskandjatel, kuni viimaks redutseeritakse hapnik veeks. Elektronide transpordi käigus viiakse läbi mitokondri sisemembraani maatriksist membraanidevahelisse alasse vabu prootoneid, mis põhjustab membraanil vesinikioonide erineva kontsentratsiooni.

Võrreldes substraadi tasemel fosforüülimisega, mille käigus ATP moodustub otse fosfaatiooni lisamisel ADP-le, on oksüdatiivse fosfolüürimise ATP saagis ühe lagundatava püruvaadi molekuli kohta pea 20 korda suurem.

Elektronide transpordi ahel (ETA)

Oksüdatiivne fosforüülimine toimub mitokondri sisemembraanis

Oksüdatiivse fosforüülimise tagamiseks on vaja elektronid viia üle redutseeritud koensüümidelt O₂-le. Eukarüootides koosneb see elektronide ülekandeahel neljast suurest valkkompleksist mitokondri sisemisel membraanil.

Kompleks I

Kompleksis I toimub kahe elektroni ülekanne koensüümilt NADH, mis pärineb sellistest biokeemilistest protsessidest nagu glükolüüs, Krebsi tsükkel ja beeta-oksüdatsioon, rasvlahustuvale koensüümile ubikinoonile (UQ-le). Reaktsiooni käigus viiakse 4 prootonit maatriksist membraanidevahelisse ruumi ja võib tekkida organismile kahjulik superoksiid.

NADH + 5H+(M) +UQ -> NAD+ + UQH2 + 4H+ (IMS)
(M)- (prootonid) maatriksis

(IMS)- (ingl k Intermembrane space) (prootonid) membraanidevahelises alas

Reaktsiooni vabaenergia muut: ΔGo’=-69,5kJ/mol

Kompleks II

Toimub elektronide ülekanne suktsinaadilt UQ-le. Kompleks II osaleb nii ETA-s kui ka Krebsi tsüklis.
Reaktsioonis ei toimu prootonite väljutamist membraanidevahelisse ruumi.

Suktsinaat + UQ -> fumaraat + UQH2

ΔGo’=-16,4kJ/mol

Kompleks III

Kompleks III teine nimetus on tsütokroom-c reduktaaskompleks. Elektronid liiguvad redutseeritud ubikinoonilt (UQH₂) heemproteiinile, tsütokroomile c (Cyt c), mis viib elektronid kompleksi IV. Kompleks III-s toimuvates protsessides osaleb ka reaktsioonide tsükkel, mida kutsutakseQ tsükliks. Selle käigus toimub UQH₂ oksüdeerimine ja UQ redutseerimine. Toimub nelja prootoni eraldumine maatriksisse, mis suurendab prootongradienti.

UQH2 + 2 Cyt c(Fe3+) 2 H+(M) -> UQ + 4 H+(IMS) + 2 Cyt c(Fe2+)

ΔGo’=-36,7/mol

Kompleks IV

Kompleks IV: Tsütokroom-c oksüdaaskompleks.

Kompleks IV on viimane kompleks elektronide transportahelas.

Kompleksis IV, mida nimetatakse ka tsütokroom-c oksüdaaskompleksiks võetakse vastu 4 elektroni 4-lt tsütokroom c molekulilt ja kantakse hapnikumolekulile. Lisandub 4 prootonit maatriksist ja moodustub kaks veemolekuli. Protsessi käigus viiakse membraanide vahelisse alasse ka 4 prootonit, suurendades sellega prootongradienti siemembraanil.

4 Cyt c (Fe2+) + 8H+(M) + O2 -> 4 cyt c (Fe3+) + 2 H2O + 4 H+(IMS)

ΔGo’=-112,5kJ/mol

ATP süntaas (kompleks V)

Ensüüm ATP süntaas. Ensüümi paneb tööle prootongradient. Roosast alast pildil, kus vesinikioone rohkem toimub nende liikumine läbi ATP süntaasi maatriksisse (pildil sinakas) ja selle abil luuakse ADP molekulidest ATP molekule.

Kompleks V ei kuulu elektronide transportahelasse, vaid tegeleb prootongradienti kasutades ADP molekulist ATP loomisega.

Prootonite gradient saab tekkida tänu sellele, et mitokondri sisemembraan ei lase ioone läbi. Seega pääsevad vesiniku ioonid, prootonid mitokondrisse tagasi vaid läbi ATP süntaasi. Tekkinud prootonite voog käivitab ensüümi, mis hakkab katalüüsima adenosiindifosfaadi(ADP) fosforüülimist ATP-ks:

ADP + Pi → ATP

Ühe ATP sünteesimiseks tuleb transportida membraanidevahelisest alast maatriksisse 3–4 prootonit.

Hapnik kui oksüdeerija ETA-s

Eukarüootsed organismid ei suuda hapnikuta elada, kuna seda on vaja oksüdatiivses fosforüülimises, kuid O₂ redutseerimine veeks võib endaga kaasa tuua selliste ohtlike anioonide tekke nagu peroksiid ja superoksiid. Seega on elutähtis oksüdatiivne fosforüülimine paradoksaalselt ka üheks potentsiaalseks vabade radikaalide tekkeallikaks organismis ning võib põhjustada oksüdatiivset stressi, mille tagajärgedeks on rakukahjustused ja haigused. Selle vastu võitlemiseks kasutab rakk näiteks selliseid antioksüdatiivseid vitamiine nagu C- ja E-vitamiin, ensüüme superoksiidi dismutaas, katalaas ja peroksüdaas.

Prokarüoodid

Erinevalt eukarüootidest asuvad eeltuumsetes elektronide ülekandevalgud tsütoplasmamembraanis. Teistsugused on ka oksüdatiivse fosforüülimise käigus kasutatavad elektronide aktseptorid ja ETA valgukompleksid: kui päristuumsetel on viis kindlat kompleksi, siis prokarüootidel on ETA komponentide varieeruvus suurem, võimaldades hargnenud hingamisahelaid. See lubab bakteritel ja arhedel kasvada erinevates keskkondades. Eeltuumsetel esineb näiteks metalli- ja nitraatne hingamine, mida eukarüootidel pole.

Inhibiitorid

On teada paljusid toksiine ja ravimeid, mis takistavad (inhibeerivad) oksüdatiivse fosforüülimise protsesse. Kuigi inhibiitorid peatavad vaid ühe valgu töö elektronide transpordi ahelas, piisab sellest, et seisata kogu metaboolne rada. Näiteks aktinomütseetide sünteesitud 

oligomütsiin takistab ATP süntaasi, prootonite tagasivool mitokondrisse peatub. Selle tulemusena peatub NADH oksüdatsioon ja tsitraaditsükkel e Krebsi tsükkel jääb seisma, sest NAD⁺ kontsentratsioon langeb liiga madalale.

Oksüdatiivse fosforüülimise protsesside inhibiitoriteks on näiteks ka veel tsüaniid ja vingugaas.

Ajalugu

1961. aastal kirjeldas Peter D. Mitchell oma kemiosmoosi teoorias oksüdatiivse- ja fosforüülimis reaktsioonide omavahelist seotust. Väljapakutud seletus oli esmalt teadlaste seas vaidlust tekitav, kuid hiljem siiski tunnustatud, ning aastal 1978 sai ta Nobeli auhinna.

Oksüdatiivse fosforüülimise selgitamise eest on Nobeli auhind antud ka hiljem. 1997. aasta Nobeli keemiaauhind jagati kolme mehe vahel: pool auhinnast jagati John Ernest Walkeri ja Paul D. Boyerile ATP sünteesi mehhanismide selgitamise eest ning teine pool Jens Christian Skoule ioonide transportensüümi avastamise eest.

Mitokondriaalne hingamisahel

Mitokondriaalne elektronide transpordi ahel ehk hingamisahel on eukarüootsete rakkude mitokondri sisemembraanis toimuv redoksprotsesside jada, mille käigus kanduvad elektrondoonorite elektronid üle elektronaktseptoritele. Aeroobsetes tingimustes toimiv hingamisahel järgneb tsitraaditsüklile ja on oksüdatiivse fosforüülimise protsessi osaks. Oksüdatiivne fosforüülimine on protsess, kus elektrontransportahelas korduva vesiniku oksüdeerimise tagajärjel saadavat energiat kasutades tekib ADP fosforüülimisel ATP.

Mitokondriaalse elektrontransportahela üldskeem

Hingamisahelas on elektronide doonoriteks NADH ja FADH₂ ning elektronide aktseptoriks on molekulaarne hapnik, mis vastuvõetud elektronide toimel veeks konverteeritakse. Taimedes toimib lisaks mitokondriaalsele hingamisahelale ka fotosünteetiline elektrontransportahel, mille töö tulemusena toodetakse hoopis vee molekulidest hapniku molekule. Erinevate elektronide doonorite ja aktseptoritega elektrontransportahelaid esineb looduses veel mitmeid ning neid leidub nii eukarüootsetes kui prokarüootsetes organismides. Kõikide elektrontransportahelate ühine omadus on, et nende töö tulemusena tekkiva prootongradiendi elektrokeemiline energia salvestatakse keemilise energiana ATP molekulidesse. ATP energiat saab kasutada erinevates metabolismiradades energeetiliselt mittesoodsate ehk toimumiseks täiendavat energiat vajavate reaktsioonide läbiviimiseks. Väike hulk ATPd on võimalik toota substraadi tasemel fosforüülimisega, mis toimub näiteks glükolüüsi rajas, ning osad organismid toodavad ATPd kääritusprotsesside käigus, kuid enamikus organismides on peamiseks keemilise energia tootmise viisiks elektrontransportahelad.

Hingamisahela termodünaamiliselt soodne kulgemine on garanteeritud sellega, et elektronid liiguvad negatiivsema redokspotentsiaaliga ühenditelt aina positiivsema redokspotentsiaaliga ühenditele, st iga järgmine elektronikandja on elektronide suhtes vastuvõtlikum (afiinsem) kui eelmine. Elektronikandjate oksüdeerumisel vabaneva energia toimel pumbatakse prootoneid mitokondri maatriksist membraanidevahelisse ruumi ning tekib prootongradient. ATP süntaas kasutab gradiendi energiat roteerumiseks (s.t gradiendi elektrokeemiline energia muundatakse ATP süntaasi poolt mehaaniliseks energiaks). ATP süntaasi vahendusel liiguvad prootonid tagasi mitokondri maatriksisse ning energia salvestub ATPsse keemilise energia kujul. NADH redokspotentsiaal on suurem (negatiivsem) kui FADH₂ oma, seega NADH redutseerimisel vabaneb rohkem energiat ja saab sünteesida rohkem ATPd.

Hingamisahela kompleksid

Mitokondriaalse elektronide transpordi ahela moodustavad neli suuremat mitokondri sisemembraanis asetsevat valgulist kompleksi koos liikuvate abistavate elektronkandjatega (ubikinoon, tsütokroomid-c). Prokarüootidel, kellel mitokondrid puuduvad, asuvad elektrontransportahelate kompleksid plasmamembraani koostises.

Mitokondriaalse elektronide transpordi ahela I kompleks

I kompleks ehk NADH-ubikinooni oksidoreduktaasi ehk NADH dehüdrogenaas

Kompleksi reaktsioon: NADH + Q + 5 H⁺ → NAD⁺ + QH₂ + 4 H⁺

See suur ensüüm koosneb umbes 46 polüpeptiidi ahelast, riboflaviin-5'-fosfaadist (FMN) ja raud-väävel (Fe-S) kobaratest. Peamiselt tsitraaditsüklist pärineva NADH elektronid sisenevad hingamisahelasse FMNi redutseerumisega ja liiguvad edasi läbi seitsme Fe-S kobara, liitudes lõpuks ubikinooniga. Elektronide ülekandumise tulemusena muutub I kompleksi struktuur ning avanevad prootonkanalid, läbi mille pumbatakse neli prootonit mitokondri maatriksist välja.

Ubikinooni ehk koensüüm Q (edaspidi ka Q) molekulid asetsevad oma hüdrofoobsuse tõttu mitokondri membraanis ning saavad seal suurte hingamisahela komplekside vahel liikuda. Kui ubikinoon liidab kaks elektroni, on tegemist ubikinooliga (edaspidi QH₂). Peale ubikinooni ja ubikinooli võib membraanist leida ka ubikinooni osaliselt redutseerunud versioone (semikinoone).^[1]

Mitokondriaalse elektronide transpordi ahela II kompleks

II kompleks ehk suktsinaadi-ubikinooni reduktaas

Suktsinaadi dehüdrogenaasi reaktsioon: suktsinaat + FAD → fumaraat + FADH₂

Kompleksi reaktsioon: FADH₂ + Q → FAD + QH₂

Tsitraaditsükli ensüüm suktsinaadi dehüdrogenaas on ka hingamisahela II kompleksi koostises. Suktsinaadi oksüdeerumise tulemusena tekivad tsitraaditsüklis edasi kasutatav fumaraat ning elektronikandja FADH₂. FADH₂ loovutab oma elektronid edasi II kompleksi raud-väävel kobaratele, kust elektronid jõuavad sarnaselt I kompleksiga liikuva ubikinooni molekulini ja sisenevad elektrontranspordi ahelasse. Selles kompleksis prootonite pumpamist ei toimu ja nii ei saagi FADH₂ ahelas toota sama palju ATPd kui NADH puhul.

Elektrontransportahela III kompleks. Cyt c(Fe³⁺) on Cyt c oksüdeerunud vorm, Cyt c(Fe²⁺) on redutseerunud vorm

III kompleks ehk ubikinooli-tsütokroom c oksidoreduktaas ehk tsütokroom bc₁

Kompleksi reaktsioon: 2 QH₂ + Q + 2 Cyt c(Fe³⁺) + 2 H⁺ → 2 Q + QH₂ + 2 Cyt c(Fe²⁺) + 4 H⁺

III kompleks koosneb 22 alaühikust ja sisaldab Rieske raud-väävel kobaraid (2Fe-2S) ning kahte erinevat tsütokroomi (tsütokroom b ja tsütokroom c₁). Mõlemad tsütokroomid sisaldavad heeme, mille keskmes on raua aatomid. Kompleksi vahendusel kanduvad elektronid ubikinoolilt tsütokroom c-le (Cyt c). Ubikinool kannab edasi kahte elektroni, kuid tsütokroom c raua aatom suudab vastu võtta ainult ühe. Selleks, et kõik elektronid edasi kanda, toimib koensüüm Q tsükkel, kus III kompleksi Q₀ seondumiskohale seondub järjest kaks QH₂ molekuli. Mõlema molekuli esimene elektron liigub Rieske kobarale ja sealt tsütokroom c₁-le (ja lõpuks kompleksiga seondunud liikuvale tsütokroom c-le), molekulide teine elektron liigub läbi tsütokroom b ja redutseerib kompleksi Q_i saiti seondunud Q molekuli. Kui Q on sidunud kaks elektroni, liidab ta endale maatriksist ka kaks prootonit, moodustades QH₂ ja tekitades prootongradiendi. Ühe tsükli ajal liigub kompleksist läbi kaks elektroni, neli prootonit pumbatakse intermembraansesse ruumi ning kaks maatriksi prootonit seotakse.

Hingamisahela IV kompleks. Cyt c(Fe2+) on tsütokroom c redutseerunud vorm, Cyt c(Fe3+) on oksüdeerunud vorm

IV kompleks ehk tsütokroom c oksüdaas

Kompleksi reaktsioon: 4 Cyt c(Fe²⁺) + 8 H⁺ + O₂ → 4 Cyt c(Fe³⁺) + 2 H₂O + 4 H⁺

IV kompleks sisaldab kahte vase ioonidega tsentrit (Cu_A ja Cu_B) ja kahte heemi gruppi (heem a ja heem a₃), kokku koosneb 13 alaühikust. O₂ täielikult veeks redutseerimiseks kulub neli elektroni. Kui kahe tsütokroom c elektronid on redutseerinud Cu_B ja heem a₃ tsentrid, kasutab hapniku molekul neid kahte elektroni tsentrite vahele peroksiidsilla moodustamiseks. Aktiivtsentriga liituvad veel kahe Cyt c molekuli elektronid ja kaks prootonit, mis viib peroksiidsilla katkemiseni. Veel kahe prootoni liitumisel vabaneb mõlemast tsentrist vee molekul. Lisaks neljale maatriksist vee molekulidesse jõudnud prootonile pumbatakse selle energeetiliselt soodsa reaktsiooniahela jooksul intermembraansesse ruumi veel neli prootonit. IV kompleksis toimuv hapniku redutseerumine on aeroobsete organismide hapnikutarbimise peamiseks põhjuseks.

ATP süntaas

Hingamisahelaga kaasnevat ATP sünteesi viib läbi ATP süntaas ehk mitokondriaalne ATPaas ehk F₁F₀ATPaas, mida vahel tuntakse ka hingamisahela V kompleksi nime all. ATP süntaas asetseb koos hingamisahela nelja põhikompleksiga mitokondri sisemembraanil ning koosneb kahest allüksusest: keerlev F₁ üksus ja paigalseisev F₀ üksus. F₀ üksuse koostises asub prootonkanal, mille kaudu hingamisahelas välja pumbatud prootonid liiguvad spontaanselt ehk iseeneslikult tagasi mitokondri maatriksisse. Prootonite liikumine paneb F₁ üksuse keerlema. ATP süntaasil on funktsionaalselt kolm aktiivset keskust, mis asuvad F₁ üksuse koostises ning vahetavad oma funktsioone F₁ keerlemise käigus. Aktiivkeskuste funktsioonideks on kordamööda ADP ja P_i (anorgaaniline fosfaatrühm) sidumine, ATP süntees ning ATP vabastamine.

Hingamisahel ja ATP süntaas on biokeemiliselt eraldiseisvad süsteemid, kuid nad on ühenduses mitokondri sisemembraanil tekkiva prootongradiendi kaudu. NADH ja FADH₂ redutseerimiseks on vajalik ATPaasi poolt vahendatav ATP süntees ja vastupidi. Protsesside koostoime tulemusena on ühe NADH molekuli kohta võimalik sünteesida 2,5 ATP molekuli, ühe FADH₂ molekuli kohta 1,5 ATP molekuli.

Teatud tingimustes toimivad osadel organismidel ka valgud (nt 2,4-dinitrofenool), mis suudavad hingamisahela ja ATP sünteesi protsessid üksteisest lahutada selleks, et toota soojust (kehatemperatuuri säilitamiseks).

Hapnik elektrontransportahela lõppaktseptorina

Kui hingamisahela elektronide lõppaktseptoriks on hapnik, on tegemist aeroobse hingamisega. Looduses esineb ka anaaeroobseid hingamisahelaid, kus hapniku asemel on mõni teine molekul. Hapniku redutseerumisel vabaneb rohkem energiat kui teiste elektronide lõppaktseptorite redutseerumisel, sest hapnik on neist elektronegatiivsem ja elektronide suhtes vastuvõtlikum. Seega on aeroobne hingamine energeetiliselt kasulikum kui anaeroobne hingamine.

Hingamisahelaga kaasnevad kõrvalefektid

Hapnikhingamise käigus esineb ohtlikke kõrvalefekte. Hapniku osalisel redutseerumisel tekivad ülimalt reaktiivsed hapnikuühendid (superoksiidioon, vesinikperoksiid, hüdroksüülradikaal), mis võivad reageerida peaaegu kõikide rakus leiduvate makromolekulidega, põhjustades oksüdatiivset stressi, mida seostatakse vananemise ja paljude haigustega. Selleks, et reaktiivsete hapnikuühendite tekitatavaid kahjustusi vältida, on rakkudes ensüümid, mis neid ühendeid neutraliseerivad. Olulisemad ja efektiivsemad ensüümid on superoksiidi dismutaas, mis viib läbi superoksiidioone siduvat reaktsiooni, ning katalaas, mis teostab vesinikperoksiidist vabastavat reaktsiooni.

Superoksiidi dismutaasi reaktsioon: 2 O₂^-· + 2 H⁺ ↔ O₂ + H₂O₂

Katalaasi reaktsioon: 2 H₂O₂ ↔ O₂ + 2 H₂O

Oksüdatiivsete kahjustuste eest kaitsevad ka näiteks antioksüdantsed vitamiinid C ja E ning ubikinool; viimased kaks on rasvlahustuvad ning kaitsevad eriti hästi membraane.

NADP (nikotiinamiidadeniindinukleotiidfosfaat )

NADP ehk nikotiinamiidadeniindinukleotiidfosfaat on koensüüm, mis osaleb ainevahetuse sünteesireaktsioonides (anabolism), nt lipiidide ja nukleiinhapete sünteesis, samuti fotosünteesis (niinimetatud pimereaktsioonides kloroplastide stroomas) olles redutseerunud vormina (NADPH-na) reaktsioonides redutseerija, elektronide ja ka prootonite loovutaja.

Üks positiivselt laetud NADP⁺ molekul seob korraga 2 vesiniku aatomit. NADP vananenud nimetus on trifosfopüridiinnukleotiid ehk lühendina TPN.

Erinevalt NAD-ist on NADP-l üks fosfaatrühm, fosforhappe jääk rohkem.

NADP avastasid 1931. aastal hobuse erütrotsüütides Otto Heinrich Warburg ja William Christian.

Mitokondrid

Mitokondrid (varasemas eesti keeles ka mitokondrion; ka kondriosoom; kreeka keelest μίτος mitos, 'niit' + χονδρίον chondrion, 'terake') on raku energiat tootvad organellid. Rakubioloogias nimetatakse mitokondriks suurt rakusisest organelli, mis on ümbritsetud kahe membraaniga. Mitokondrites viiakse lõpule glükoosi lagundamine ja sünteesitakse makroergilisi ühendeid (ATP). Nad on nähtavad valgusmikroskoobis. Mitokondrite olemasolu rakkudes selgus 19. sajandil, rakust eraldamine osutus võimalikuks 20. sajandil.

Mitokonder elektronmikroskoobis nähtuna

Mitokondrid on silindrikujulised organellid diameetriga 0,5–1 µm, sarnanedes bakteritega, ning on 1–10 µm pikad. Eukarüootses rakus võib mitokondrite arv suuresti varieeruda. Näiteks maksa ja lihasrakkudes võib neid olla üle 1000. Vere punalibledes aga mitokondreid pole. Mitokondrite arv rakus varieerub ka vastavalt organismile ja koele ning need organellid võtavad enda alla mahuka osa raku tsütoplasma ruumalast. Nad on väga liikuvad ja plastilised organellid. Liikudes tsütoplasmas, on nad tihti seondunud mikrotuubulitega. Mitokondrites viiakse suhkrute metabolism lõpuni, püruvaat imporditakse mitokondrisse ja oksüdeeritakse hapniku abil süsihappegaasiks ja veeks. See võimaldab rakul toota 15 korda rohkem ATP-d, kui võimaldaks vaid glükolüüs. Ilma mitokondrita peaks eukarüootse raku ATP süntees sõltuma ainult anaeroobsest glükolüüsist.

Kahe membraani tõttu on mitokondrites 2 erinevat ruumi: välismembraan ja sisemembraan loovad membraanidevahelise ruumi ja maatriksi. Mitokonder sisaldab oma mitokondriaalset DNA-d ning ribosoome. Arvatakse, et energiat tootvad organellid, nii mitokondrid kui ka kloroplastid, arenesid endosümbioosi teel. Endosümbioosi teooria väidab, et prokarüoot "neelas alla" algelise eukarüootse raku ning omavahel arendati sümbioosne suhe. See hüpotees seletab, kuidas on võimalik mitokondril sisaldada oma RNA-d (mis antakse edasi ainult ema-liini pidi) ja ribosoome.

Mitokondri struktuur

Mitokondri struktuur: 1-sisemembraan; 2-välismembraan; 3-krista, mis on üks osa membraanidevahelisest ruumist; 4-maatriks

Mitokondri mudel

Mitokonder koosneb kahest membraanist, mille vahele jääb membraanidevaheline ruum. Sisemembraaniga ümbritsetud piirkonda nimetatakse maatriksiks. Kõik need neli osa: välismembraan, sisemembraan, membraanidevaheline ruum ja maatriks sisaldavad ainulaadset valkude kogumikku. Kuigi mitokondrites on ka oma ringikujuline DNA, siiski kodeeritakse enamik neist valkudest rakutuumas ja imporditakse mitokondrisse läbi tsütoplasma spetsiaalsete translokaaside abil, milleks välismembraani jaoks kasutatakse TOM-i (eellasvalgu välismembraanis asuv translokaas) ja sisemembraani jaoks TIM-i (eellasvalgu sisemembraanis asuv translokaas).

Välismembraan

Mitokondri välismembraan koosneb lipiididest ja valkudest suhtes 1:1. Sisaldab mitu poriini molekuli, mis on multimeerne transpordivalk. Poriin moodustab veekanaleid läbi lipiidse kaksikkihi välismembraanis. Kanal moodustab sõela, mis on läbitav kõigile molekulidele suuruses 5000 daltonit või vähem. Sellest suuremad molekulid läbivad välismembraani ainult valgu N-terminaalses otsas paikneva signaaljärjestuse ja translokaasi seondumise abil.

Sisemembraan

Sisemembraani lipiidne kaksikkiht koosneb 20% lipiididest ja 80% valkudest. Sisaldab suures hulgas kardiolipiidi, mis teeb temast üsna läbimatu membraani, lisaks puuduvad selles poriinid. Sisemembraan sisaldab transportvalke, mis teevad selle valikuliselt läbitavaks väikestele molekulidele, mis metaboliseeritakse mitmete maatriksi, rakuhingamises osalevate ensüümide abil. Sisemembraani pinda suurendavad väljasopistused (või ka sissesopistused siseruumi maatriksi poole), mida nimetatakse kristadeks. Kristade membraanid sisaldavad valke, millel on kolm funktsiooni: oksüdatsioonireaktsioonide läbiviimine elektronide transpordi ahelas, ATP süntaasi olemasolu ning metaboliitide transport sisemembraani ja maatriksi vahel. Läbi ATP süntaasi liiguvad väljapumbatud prootonid tsütosoolist maatriksisse osalemaks mitokondriaalses elektronide transpordi ahelas. Prootonite elektrokeemiline gradient, mis paneb tööle ATP süntaasi, tekib sisemembraanil. Membraan on läbimatu ioonidele ja enamikule väikestele laetud molekulidele. Vaata ka artiklit oksüdatiivne fosforüülumine.

Membraanidevaheline ruum

Membraanidevaheline ruum on välis- ja sisemembraani vahel olev piirkond, sisaldades mitmeid ensüüme, mis kasutavad ATP-d. Erinevalt sisemembraanist on välismembraan läbitav ioonidele ja väikestele molekulidele, seega on selle ala ensüümide sisaldus sarnane tsütosooliga.

Mitokondri maatriks

Maatriks on ruum, mis on ümbritsetud mitokondri sisemembraaniga. Maatriksis toimub ATP süntees sisemembraanis lokaliseeruva ATP süntaasi abil. Maatriks sisaldab segu sadadest ensüümidest, kaasa arvatud need, mis on vajalikud püruvaadi ja rasvhapete oksüdatsiooniks ning tsitraaditsükliks. Maatriksis sisalduvad ka mitu identset koopiat mitokondriaalsest DNA genoomist, mitokondri ribosoomid, tRNAd ja mitmed ensüümid mitokondri geenide ekspressiooniks.

Mitokondri funktsioonid

Mitokondri kõige üldisemaks ja esmasemaks funktsiooniks on energia tootmine. Metabolismireaktsioonidest olulisemad on

1. mitokondri maatriksis toimuv püruvaadi ja rasvhapete oksüdatsioon süsihappegaasini, millega kaasneb NADH ja FADH₂ teke;
2. elektronide transport NADPH-lt ja FADH₂-lt hapnikule, mis toimub mitokondrite sisemembraanis ja millega kaasneb prootonite kontsentratsiooni erinevuse teke kahel pool mitokondri sisemembraani (prootonite arv suureneb välis- ja sisemembraani vahelises alas, tekitades gradiendi matriksis olevate vesinikioonidega);
3. ATP süntees, mis toimub mitokondrite sisemembraanis paikneva ATP süntaasi vahendusel prootonite kontsentratsiooni gradiendi ärakasutamisel. Ka püruvaadi dehüdrogenaasi kompleks asub mitokondri maatriksis. Lisaks energia tootmisele säilitavad mitokondrid kaltsiumi, osalevad rakkudevahelises signalisatsioonis, toodavad soojust, osalevad raku kasvamises, kuid samas ka raku kärbumise, nekroosi ja loomuliku, programmeeritud surma apoptoosi vallandamises.

Püruvaadi dehüdrogenaasikompleks ja tsitraaditsükkel

Mitokonder saab kasutada kütusena nii püruvaati kui rasvhappeid. Mitokondrisse transporditud püruvaat võib kasutada ensüümidena nii püruvaadi karboksülaasi (glükogeoneetilises rajas) kui ka püruvaadi dehüdrogenaasi (esimene ensüüm püruvaadi dehüdrogenaasi kompleksist). Püruvaat või rasvhapped teisendatakse atsetüül-CoA-ks, mis on väga oluline vaheühend metabolismis ning tsitraaditsükli substaat. Järgnevalt oksüdeeritakse atsetüülirühmad maatriksis tsitraaditsükli abil, mis teisendab süsinikuaatomid süsihappegaasiks. Süsihappegaas seejärel eraldub. Oksüdatsioon genereerib elektrone, mis saavad edasi kantud NADH ja FADH₂ abil. Need elektronid transporditakse mitokondri sisemembraani, kus nad sisenevad mitokondriaalsesse elektronide transpordi ahelasse. Tekkinud redutseeritud koensüümid NADH ja FADH₂ kasutatakse ATP sünteesiks oksüdatiivse fosforüleerimise protsessis.

Rasvhapete oksüdatsioon

Rasvhapete oksüdatsiooni põhirada on β-oksüdatsioon. Nimetus tuleneb substraadiks kasutatava rasvhappe aktiivvormi β-süsiniku kasutamisest selles protsessis. Kuna rasvhappe aktiivvorm (atsüül-CoA) ei läbi mitokondri sisemembraani iseseisvalt, transporditakse atsüülijääk karnitiini osalusel mitokondritesse. Tekib ühend rasvhappeatsüül-CoA. See oksüdeerub astmeliselt. Iga astmega eraldub rasvhappe ahelast kahesüsinikuline aktiivne atsetüülijääk, st ühe astmega lüheneb rasvhappeahel kahe süsiniku võrra. Samuti tekivad iga astme läbimisel koensüümid NADH ja FADH₂. Iga β-oksüdatsiooniring toodab kuni 15 ATP molekuli koostöös hingamisahelaga. Reaktsioon toimub seni, kuni kogu rasvhappeatsüül-CoA on lagunenud atsetüül-CoA molekulideks. Atsetüül-CoA molekulid lülituvad tsitraaditsüklisse ja oksüdeeruvad süsihappegaasini. Tekkivad NADH ja FADH₂ oksüdeeruvad mitokondriaalses elektronide transpordi ahelas. Iga NADH oksüdeerumine annab kümme prootonit ja iga FADH₂ oksüdeerumine kuus prootonit maatriksist kahe membraani vahelisse piirkonda. Rasvhapete oksüdatsioon on maksarakkude põhiline ATP allikas. Enamikus teistes rakkudes toimub see ilma ATP sünteesita peroksüsoomides.

Mitokondriaalne elektronide transpordi ahel ehk hingamisahel

 Mitokondriaalse elektronide transpordi ahela e hingamisahela peamine funktsioon on ATP tootmine. Hingamisahelate hulk organismides ja erinevates rakkudes võib erineda, nii võib maksaraku ühes mitokondris olla toimida üheaegselt palju hingamisahelaid. Püruvaadi dehüdrogenaasi kompleksis ning tsitraaditsüklis moodustunud NADH ja FADH₂ annavad prootonid ja elektronid ära hingamisahelale. Ülekanne toimub redokspaaride (elektronide aktseptor/elektronide doonor ehk iga ülekandja on vaheldumisi oksüdeerunud ja redutseerunud vormis) vahel, mida saab iseloomustada redokspotentsiaali abil. Elektronid liiguvad negatiivsema redokspotentsiaaliga ühendilt positiivsema redokspotentsiaaliga ühendile. NADH ja FADH₂ on kõrge negatiivse redokspotentsiaaliga, elektronid liiguvad nendelt positiivsena redokspotentsiaaliga ühenditele. Hingamisahel algab oksüdeeritavalt ühendilt vesinikuaatomite äravõtmisega ning lõpeb elektronide ja prootonite astmelise ülekandega õhuhapnikule, kokkuvõttes tekib vesi. Lisaks koensüümidele NADH ja FADH₂ on hingamisahelas olulised ka koensüüm Q ning raud-väävel tsentrid. Mitokondri sisemembraani kristades asuvad kindlas järjestuses funktsionaalsed hingamisahela kompleksid, mida nimetatakse kompleks I, II, III ja IV. Elektronide pumpamine maatriksist membraanidevahelisse ruumi toimub kõigis kompleksides välja arvatud kompleks II, kuna tema redokspotentsiaali muut pole piisav ATP sünteesiks. Iga kahe NADH elektroni ülekandega hapnikule sünteesitakse kuni kolm ATP, FADH₂ võimaldab vastavalt toota kaks ATP-d. Elektronide transport hingamisahelas on eksergooniline protsess, kuna NADH ja FADH₂ on väga head elektronide doonorid ning hapnik on väga hea elektronide aktseptor. Tekkiva vaba energia suur muut teisendatakse ATP sünteesimiseks läbi protsessi, mida nimetatakse oksüdatiivseks fosforüleerimiseks. Nimelt põhjustab prootonite transport mitokondri maatriksist membraanidevahelisse ruumi sisemembraani välispinna positiivse laadumise, maatriksipoolne pind laadub aga negatiivselt. Selle tõttu tekib prootonite elektrokeemiline gradient mitokondri sisemembraanil. Gradient on jõuks, mis võimaldab ATP süntaasil toota ATP-d.

Mitokondri valgud ja genoom

Inimese mtDNA

 Tuumas asuv DNA kodeerib suure osa mitokondri geene. Nendest kodeeritud valgud sünteesitakse tsütosoolsetel ribosoomidel ja transporditakse mitokondrisse. Mitokondri enda kodeeritud vähesed valgud asuvad põhiliselt mitokondrite sisemembraanil. Valkude transpordil mitokondrisse kasutatakse lisaks ATP lagundamise energiale ka elektrokeemilise gradiendi energiat. Mitokondri maatriksisse liikumise signaal on valkude N-terminaalse otsa 15–30 aminohappe pikkune signaaljärjestus. Valgu liikumine läbi kahe membraani vajab multimeerseid valgukomplekse TIM ja TOM. Mitokondriaalne DNA on endosümbioosi tõttu sarnane prokarüootidega, struktuur on rõngasjas. Ühes mitokondris võib esineda kuni 15 mtDNA koopiat. Mitokondrite genoom pärandub emaliini pidi, muteerub umbes kümme korda kiiremini kui rakutuumas paiknev DNA ning mitokondrile on omane rekombinatsiooni puudumine. Need omadused koostöös mtDNA mutatsioonidega võimaldavad koostada fülogeneetilisi puid ning analüüsida inimpopulatsioonide rännet ja ajalugu. Inimese mitokondriaalne DNA on üks väiksemaid, pikkusega 16 569 aluspaari, kodeerib kahte rRNA ja 22 tRNA tüüpi . Mitokondritel on unikaalne genoom, mis inimese puhul kodeerib 37 geeniprodukti.

Atsetüülkoeensüüm A

Atsetüülkoensüüm A ehk atsetüül-CoA on paljudes organismi biokeemilistes reaktsioonides (eriti ainevahetuses) osalev molekul. Atsetüül-CoA peamine ülesanne on süsinikuaatomite toomine atsetüül-grupina (CH₃CO-) tsitraaditsüklisse, kus seda energia saamiseks oksüdeeritakse.

Atsetüül-CoA mängib olulist rolli ka rasvhapete ja kolesterooli sünteesis ning lõhustamises.

Atsetüülkoensüüm

Atsetüül-CoA

Transkriptsioon (geneetika)

Transkriptsioon on matriitssüntees, mille käigus sünteesitakse DNA molekuli ühe ahela nukleotiidse järjestusega komplementaarne RNA molekul.

Protsess toimub rakutuumas interfaasi ajal. Seda viib läbi ensüüm RNA-polümeraas, mis peab transkriptsiooni alustamiseks seostuma vastava geeni algusosaga. DNA nukleotiidset järjestust, millega ensüüm peab sünteesi alustamiseks ühinema, nimetatakse promootoriks. Transkriptsiooni käigus keeratakse DNA biheeliks järk-järgult lahti ning sünteesitakse ühe ahela teatava lõiguga komplementaarne RNA molekul. RNA süntees lõpeb, kui polümeraas jõuab DNA piirkonnani, mida nimetatakse terminaatoriks (geeni lõpp). Seal eraldub ensüüm DNA molekulist, mille järgselt taastub DNA endine kaksikspiraalne kuju ning sünteesitud RNA liigub läbi tuumamembraani pooride tsütoplasmasse. Transkriptsiooni produktiks on RNA ahel, milles tümiini (T) nukleotiidid on asendatud uratsiiliga (U). Kuna RNA koostises on lämmastikalus tümiin asendunud uratsiiliga, rakendub transkriptsioonil alljärgnev komplementaarsus.

DNA monomeer	RNA monomeer
adenosiinfosfaat A	uridiinfosfaat U
tümidiinfosfaat T	adenosiinfosfaat A
tsütidiinfosfaat C	guaniinfosfaat G
guaniinfosfaat G	tsütidiinfosfaat C

Transkriptsiooni võib käsitleda 4 või 5 etapina.

1. Helikaasse aktiivsusega piirkonda sisaldav RNA polümeraas harutab lahti DNA, lõhkudes komplementaarsete nukleotiidide vahel olevad vesiniksidemed;
2. RNA nukleotiidid paarduvad komplementaarsete DNA aluspaaridega;
3. RNA polümeraasi abiga tekib RNA suhkur-fosfaatkarkass;
4. Lahtiharutatud RNA+DNA heeliksite vahel olevad vesiniksidemed katkevad, vabastades uue sünteesitud RNA ahela;
5. Kui rakul on tuum, töödeldakse RNA-d veel edasi (3' otsa lisatakse polü-A saba ja 5' otsa lisatakse cap-struktuur), misjärel väljub RNA läbi tuumapooride kompleksi tsütoplasmasse.

Transkriptsioon on esimene etapp, mis on geenide avaldumise peamiseks regulatsiooni tasemeks. DNA osa, mida transkribeeritakse RNA molekuliks, nimetatakse transkriptsiooni ühikuks ja see kodeerib vähemalt ühte geeni. Kui geen, mida transkribeeritakse, kodeerib valku, on transkriptsiooni tulemuseks informatsiooni-RNA (inglise k messenger RNA) ehk mRNA, mida kasutatakse seejärel valgu sünteesiks, tuntud ka translatsiooni nime all. Alternatiivselt võib transkribeeritud geen kodeerida ribosomaalset RNA-d (rRNA) või transpordi RNA-d (tRNA), mis on mõlemad vastavalt valgu kokkupanekuprotsessi või teiste ribosoomide osadeks.

DNA transkriptsiooni ühik, mis kodeerib valku, sisaldab peale otse valku transleeritava järjestuse (kodeeriva järjestuse) ka regulatoorseid järjestusi, mis juhivad ja reguleerivad seda valgusünteesi. Transkripti 5'-poolsed järjestused on ülesvoolu (ingl. k upstream) ja 3'-poolsed järjestused allavoolu (ingl. k downstream) RNA järjestused. Enne kodeerivat järjestust (upstream) asuvat regulatoorset järjestust nimetatakse viis prim mittetransleeritavaks regiooniks (5'UTR) ja järjestust, mis järgneb kodeerivale osale (downstream), nimetatakse kolm prim mittetransleeritavaks regiooniks (3'UTR) (inglise k untranslated region).

Transkriptsioonil on ka mõned korrektuuri (inglise keeles proofreading) mehhanismid, aga neid on vähem ja need on väiksema efektiivsusega kui DNA replikatsiooni proofreading-mehhanismid; seega on transkriptsioon ebatäpsem kui DNA replikatsioon.

Nagu DNA replikatsioonil, loetakse ka transkriptsioonil DNA-d 3'→5' suunas. Samaaegselt luuakse komplementaarset RNA-d 5'→3' suunas. See tähendab, et 5' ots sünteesitakse esimesena. Olgugi et DNA on topeltheeliks, milles on kaks antiparalleelset ahelat, kasutatakse transkriptsiooniks ainult ühte kahest ahelast. Kasutatavat ahelat nimetatakse ka matriitsahelaks. Ainult ühe ahela kasutamine on põhjustatud sellest, et RNA on vastupidi DNA-le enamikus organismides üheahelaline. DNA ahelat, mida transkriptsioonil ei kasutata, nimetatakse kodeerivaks ahelaks, sest selle järjestus on identne äsja sünteesitud RNA transkriptiga (välja arvatud uratsiili ja tümiini asendus). Kasutades ainult 3'→5' ahelat, eemaldatakse vajadus Okazaki fragmentide järele, mis tekivad DNA replikatsioonil.

Transkriptsioon on jagatud viieks etapiks: eelinitsiatsioon (pre-initsiatsioon), initsiatsioon, promootori vabastamine, elongatsioon ja terminatsioon.

Põhilised etapid

Pre-initsiatsioon

Eukarüootides vajab RNA polümeraas ja tänu sellele ka transkriptsiooni initsiatsioon DNA promootori järjestuse olemasolu. Promootorid on DNA regioonid, alguskohad, tänu millele algab transkriptsioon ja mis asuvad eukarüootides 30, 75 ja 90 aluspaari enne transkriptsiooni alguskohta. Promootoris olevad järjestused on transkriptsiooni initsiatsiooni jaoks hädavajalikud. Enne kui süntees algab, peab RNA polümeraas seonduma DNA kindla piirkonnaga, mida kutsutakse geeni promootoriks. Seondumine toimub kindlate transkriptsioonifaktorite juuresolekul. Lisafaktorid, mis aitavad RNA polümeraasil seonduda, ei osale hilisemal ahela pikendamisel (elongatsioonil).

Kõige rohkem iseloomustatud promootori tüüp on eukarüootides lühike DNA järjestus, mida nimetatakse TATA järjestuseks, mis asub 25–30 aluspaari enne transkriptsiooni alguskohta (upstream). TATA järjestus on TATA-seonduvale valgule (inglise k TATA-binding protein (TBP)) seondumiskohaks. TBP on ise alaühikuks teisele transkriptsioonifaktorile, Transkriptsioonifaktor II D'le (TFIID). Pärast TFIID seondumist TATA järjestusele, läbi TBP, ühinevad TATA järjestuse ümber veel viis transkriptsioonifaktorit ja RNA polümeraas. Tekkivat kompleksi nimetatakse preinitsiatsiooni kompleksiks. Ühel transkriptsiooni faktoril, DNA helikaasil, on helikaasne aktiivsus ning on seetõttu seotud kaheahelalise DNA ahelate eraldamisega, tagamaks ligipääsu üheahelalisele matriits DNA-le. Teised valgud, aktivaatorid ja repressorid vastutavad koos erinevate seotud koaktivaatorite või korepressoritega transkriptsiooni moduleerimise taseme eest.

Seega sisaldab preinitsiatsiooni kompleks

• peamist promootori järjestust,
• transkriptsiooni faktoreid,
• DNA helikaasi,
• RNA polümeraasi,
• aktivaatoreid ja repressoreid.

Arhede transkriptsiooni preinitsiatsiooni põhiolemus sarnaneb eukarüootide omaga, ent pole nii keeruline. Arhede preinitsiatsiooni kompleks seostub TATA järjestuse seondumissaidiga; ometi koosneb arhede kompleks ainult RNA polümeraasist II, TBPst ja TFB (homoloog eukarüootide transkriptsioonifaktor II B'le(TFIIB)).

Initsiatsioon

Lihtne joonis transkriptsiooni initsiatsioonist

Bakterites algab transkriptsioon RNA polümeraasi seondumisega DNA promootorile. RNA polümeraas on tuumikensüüm (tuumikensüüm koosneb ensüümi allüksustest, mida on vaja katalüütiliseks aktiivsuseks), mis koosneb viiest alaühikust: 2 α alaühikut, 1 β alaühik, 1 β' alaühik ja 1 ω alaühik. Initsiatsiooni alguses on tuumikensüüm ühendatud sigma faktoriga, mis aitab leida õiged −35 ja −10 aluspaarid allpool (downstream) promootorjärjestust.

Eukarüootides on transkriptsiooni initsiatsioon keerulisem. Eukarüootne RNA polümeraas ei tunne otseselt tuumikpromootorjärjestust ära. Selle asemel vahendavad transkriptsioonifaktorid RNA polümeraasi seondumist ja transkriptsiooni initsiatsiooni. Alles pärast kindla transkriptsioonifaktori ühendumist promootorjärjestusele seondub RNA polümeraas sellele. Täielik kogum, mis seondub promootorile, moodustades transkriptsiooni initsiatsiooni kompleksi, koosneb transkriptsioonifaktoritest ja RNA polümeraasist. Arhede transkriptsiooni domeen sarnaneb eukarüootide omaga.

Promootori vabastamine

Pärast esimese sideme sünteesimist peab RNA polümeraas promootori vabastama. Selle aja jooksul moodustatakse lühikesi, 2–8-ribonukleotiidilisi ahelaid, mis vabanevad. Seda protsessi nimetatakse abortiivseks initsiatsiooniks ja on tavaline nii eukarüootides kui ka prokarüootides. Nurjunud initsiatsioon ilmneb senikaua, kuni σ-faktor paigutub ümber, mille tulemuseks on transkriptsiooni elongatsiooni kompleks (see annab 35 aluspaari suuruse liikuva jälje). σ-faktor vabastatakse enne, kui mRNA-st on 80 nukleotiidi sünteesitud. Kui transkriptist on sünteesitud umbes 23 nukleotiidi, ei libise see enam ja elongatsioon võib alata. See, nagu ka paljud teised transkriptsiooni osad, on energiat tarbiv protsess, kasutades energiaks adenosiintrifosfaadi (ATP) hüdrolüüsil vabanevat energiat.

Promootori vabastamine prokarüootides langeb kokku eukarüootide RNA polümeraasi karboksüülterminaalse (C-terminaalse) otsa 5. seriini fosforüülimisega, mida viib läbi TFIIH.

Elongatsioon

Lihtne joonis transkriptsiooni elongatsioonist

Ühte DNA ahelat, matriitsahelat, kasutatakse RNA sünteesi "šablooniks". Samal ajal kui transkriptsioon jätkub, kasutab RNA polümeraas aluspaaride komplementaarsust DNA matriitsahelaga, et luua RNA koopia. RNA polümeraas sünteesib uut RNA ahelat 5'→3' suunas, mille tulemusel tekib täpne koopia kodeeritud ahelast. Ainuke vahe seisneb selles, et tümiinid on asendunud uratsiilidega ja nukleotiidid koosnevad riboosidest (5-süsinikku), samal ajal kui DNA nukleotiididel on desoksüriboosid (võrreldes riboosiga puudub 2' hüdroksüülrühm).

Erinevalt DNA replikatsioonist, võib mRNA transkriptsioonil osaleda mitu RNA polümeraasi ühel DNA ahelal ja toimuda võib mitu transkriptsiooni korraga, seega on võimalik ühelt geenikoopialt toota kiiresti mitu mRNA molekuli.

Elongatsioon sisaldab ka proofreading-mehhanismi, mis vahetab välja valesti paardunud nukleotiidid. Eukarüootides võib see tähendada pause transkriptsiooni ajal, mis lubavad kohastel RNA-d redigeerivatel faktoritel seonduda. Need pausid võivad olla ka RNA polümeraasi kromatiini struktuurist tulenevate erinevuste pärast loomulikud.

Terminatsioon

Lihtne joonis transkriptsiooni terminatsioonist

Elongatsiooni lõppemiseks on vajalik terminatsiooni signaal, mille tulemusel transkriptsiooni kompleks dissotsieerub. Prokarüoodid kasutavad transkriptsiooni terminatsioonil kahte strateegiat: Rho-sõltuv või Rho-sõltumatu terminatsioon. Rho-sõltumatu terminatsiooni puhul lõpeb RNA transkriptsioon siis, kui värskelt sünteesitud RNA molekul moodustab G-C-rikka juuksenõelstruktuuri, millele järgneb uratsiili jääkide rida. Kui juuksenõelstruktuur moodustub, lõhutakse mehaanilise surve tõttu nõrgad U-A sidemed, mis moodustuvad DNA-RNA hübriidi vahel. See aga tõmbab polü-U transkripti RNA polümeraasi aktiivsaidist välja, põhjustades transkriptsiooni termineerimise. Rho-sõltuvatute terminatsiooni tüübil destabiliseerivad Rho-valgud matriits-DNA ja mRNA-vahelist vastastikust mõju, mis vabastab värskelt sünteesitud mRNA elongatsiooni kompleksilt.

Eukarüootides on transkriptsiooni terminatsioonist vähem teada, aga see sisaldab uuele transkriptile polü A-de lisamist RNA uude 3' otsa ja cap struktuuri lisamist 5' otsa. Kui transkriptsi esineb introneid, siis lõigatakse need pre-mRNA-st välja.

Ajalugu

Hüpoteesi molekulist, mis lubab geneetilist materjali vaadelda valguna, püstitasid esimesena Francois Jacob ja Jacques Monod. RNA polümeraasi poolt läbiviidav RNA süntees tuvastas in vitro mitu laborit 1965. aastaks; kuigi nende ensüümide sünteesitud RNA-l olid omadused, mis vihjasid lisafaktorile, mida oleks transkriptsiooni terminatsiooni õigeks lõpetamiseks vaja.

1972. aastal tõestas Walter Fiers esimest korda terminaalse ensüümi olemasolu.

Roger D. Kornberg sai oma "molekulaarsel tasandil eukarüootse transkriptsiooni uuringute" eest 2006. aastal Nobeli auhinna keemias.

Pöördtranskriptsioon

Pöördtranskriptsiooni selgitav joonis

Mõnedel viirustel (nt HIV, mis põhjustab AIDS-i) on võime transkribeerida RNA DNA-ks. HIV-l on genoomiks üheahelaline RNA, mis duplitseeritakse DNA-ks. Protsessi viib läbi RNA-sõltuv DNA polümeraas ehk Revertaas. Selle tulemusel võib DNA ühineda peremeesraku DNA genoomiga. Peamist ensüümi, mis vastutab DNA sünteesi eest, nimetatakse pöördtranskriptaasiks. HIV puhul vastutab pöördtranskriptaas viiruse RNA genoomilt komplementaarse DNA ahela (cDNA) sünteesi eest. Abiensüüm ribonukleaas H loeb RNA ahelat ja pöördtranskriptaas sünteesib komplementaarse DNA ahela, mis võtab topeltheeliksi struktuuri. See cDNA integreerub peremeesraku genoomi integraasi abiga. Integreerumise tagajärjel hakkab peremeesrakk tootma viiruse valke, mis on vajalikud uute viiruspartiklite moodustamiseks.

Mõned eukarüootsed rakud sisaldavad ensüüme, millel on pöördtranskriptaasne aktiivsus. Nendeks ensüümideks on telomeraasid, mis pikendavad lineaarseid kromosoome. DNA pikenenud otsad on olulised, sest iga kord, kui kromosoomi kahekordistatakse, lüheneb kromosoomi pikkus paari nukleotiidi võrra. Lühenemine toimub kromosoomi otstes, kus on telomeraasi sünteesitud DNA järjestus. Sellelt järjestuselt ei kodeerita ühtegi geeni ja seda on vaja ainult ülejäänud kromosoomi kaitsmiseks. Telomeraas on tihti aktiveeritud vähirakkudes, et need rakud saaksid oma genoome lõputult duplitseerida, ilma et kaotaksid vajalikke valke kodeerivaid DNA järjestusi. Telomeraasi aktiveerimine võib muuta vähirakud surematuteks. Sellegipoolest pole telomeraasi tõeline olulisus in vivo veel empiiriliselt tõestatud.

Valgusüntees

Valgusüntees ehk valgu biosüntees on valkude moodustamise protsess rakkudes, milles osalevad RNA-d ja ribosoomid.

Sageli nimetatakse valgusünteesi ka translatsiooniks või viidatakse mõiste kasutamisel vaid translatsiooni mehhanismile, kuid valgusünteesis on laiem mõiste. Tegemist on mitmeastmelise protsessiga, mis algab aminohappe sünteesist ja tuumast pärineva DNA transkriptsioonist mRNA-ks (sõnumi-RNA ehk messenger-RNA), mis on hiljem translatsiooni alginformatsiooniks. Seega on valgusüntees protsessi, milles rakud loovad ja taastoodavad valke.

Valk on oma primaarstruktuurilt polümeer, mille monomeerideks on 20 (21) aminohapet. Aminohapped on polümeeri ahelates ühendatud peptiidsidemete abil. Valgusünteesis toimub mRNA translatsioon polüpeptiidiks.

Geneetilist informatsiooni kantakse üle nukleiinhapetes, DNA-s ja RNA-s. Seda väljendatakse neljatähelise "tähestiku" abil, millega moodustatakse kolmetähelised "sõnad". Viimased transleeritakse omakorda valkudeks, mille "tähestik" on palju mahukam.

RNA-d transkribeeritakse rakutuumas. Protsessi lõpetamisel transporditakse mRNA tsütoplasmasse ja transleeritakse

Tsistroonset DNA-d kasutatakse mitme RNA vaheühendi sünteesiks. Tsistroonne DNA on selline DNA lõik, mis kodeerib ühte ainsat polüpeptiidi ja on seega päriliku informatsiooni ühikuks. Lõppvarianti kasutatakse polüpeptiidse ahela sünteesiks. Tihti sünteesitakse valke mRNA transleerimisel. Kui mõnda valku on vaja suurtes kogustes või lühikese aja jooksul, sünteesitakse ka valgu prekursor. Eelproteiin (või proproteiin) on töövõimetu valk, mis sisaldab ühte või enam inhibitoorset peptiidi, mis aktiveeritakse posttranslatsioonilise modifikatsiooni käigus, kui eemaldatakse mitteaktiivsed järjestused. Preproteiin on valguvorm, kus esineb signaaljärjestus (N-terminaalse otsa signaaljärjestus), mis määrab selle sisenemise viisi läbi membraanide. Preproteiinid sisaldavad nii inhibitoorseid kui ka signaaljärjestusi.

Valgusünteesi käigus tuuakse tRNA molekulid, mis sisaldavad sobivaid aminohappeid, lähestikku mRNA ahelaga ning aluspaarid paarduvad omavahel, sobivad mRNA koodonid paarduvad sobivate tRNA antikoodonitega. Aminohapped liidetakse kokku peptiidsidemete abil ning vabad tRNA-d vabastatakse protsessist. Kogu protsessi viivad läbi ribosoomid, mis koosnevad kahest põhilisest RNA ahelast – rRNA-st (ribosoomi RNA) ja enam kui 50 liiki valgust. Ribosoom kinnitub mRNA otsale ning liigub piki ahelat, püüdes aminohapetega tRNA-sid, ühendades aminohappeid ja luues uusi valguahelaid.

Prokarüootide ja eukarüootide valgusüntees on erinev. Prokarüootides toimub translatsioon tsütoplasmas ning eukarüootide puhul endoplasmaatilises retiikulumis.

Transkriptsioon

 Transkriptsiooni mehhanismi avastajateks olid Watson ja Crick 1953. aastal.

Transkriptsiooni käigus luuakse mRNA ahel, mille aluseks on kaksikahelalise DNA üks ahelatest. See on mRNA malliks. Transkriptsiooni võiks üldiselt jagada kolme ossa – initsiatsioon ehk algatamine, elongatsioon ehk pikendamine ja terminatsioon ehk lõpetamine. Transkriptsiooni faktorid ja kofaktivaatorid reguleerivad kõiki kolme etappi. Kuna sünteesida on vaja õige ahel, on kontroll väga tähtis. RNA polümeraas interakteerub transkriptsiooni faktoritega ning viib läbi mRNA ahela sünteesi.

DNA ahelat loetakse 3’ otsast 5’ otsa ning mRNA-d sünteesitakse 5’ otsast 3’ otsa. Protsessi viib läbi RNA polümeraas. Transkriptsioon leiab aset rakutuumas, kus säilitatakse ka raku DNA-d. Raku DNA ahel koosneb kaksikheeliksist, mis sisaldab suhkrujääke ja fosfaate. Seda kõike hoiavad koos lämmastikalused. Suhkrujääke ja fosfaate ühendavad vesiniksidemed. Ensüüm helikaas "lukustab lahti" DNA ahelad, üks ahelatest jääb šablooniks mRNA sünteesil. RNA polümeraas loeb DNA ahelat 3’ suunast 5’ suunda. Samal ajal sünteesib ta mRNA ahelat 5’–3’ suunas. Positiivne RNA ahel luuakse negatiivse DNA ahela alusel. Üldiselt DNA ja RNA ahelad sarnanevad struktuuri poolest, kuid DNA lämmastikalus tümiin on RNA ahelas asendatud uratsiiliga. Üheahelaline mRNA lahkub tuumast tuumapooride kaudu ja migreerub tsütoplasmasse. Osa geene transkribeeritakse tihedamini kui teised. Samuti transkribeeritakse mõnda geeni vaid lühikest aega raku eluea jooksul, teisi toodetakse juurde pidevalt.

Eukarüootides toimub transkriptsioon tuumas ning transkript transporditakse tsütoplasmasse translatsiooni läbiviimiseks. Transkriptsioon ja translatsioon on võimalik ka kloroplastides ja mitokondrites. Mitokondrite ja kloroplastide membraanides on hulgaliselt valgulisi kanaleid, seepärast vajavad need organellid eraldi valgusünteesi. Mõned valgud kodeeritakse otse tuumas DNA alusel, sünteesitakse tsütoplasmas ning lõpuks transporditakse organellidesse.

Bakterite ja arhede puhul toimub kogu protsess tsütoplasmas. Bakteriaalne mRNA võib olla polütsistroonne (kodeerida mitmeid polüpeptiide) ning mRNA võib sisaldada informatsiooni enam kui ühelt geenilt. Eeltuumsete puhul toimub translatsioon esmaselt transkriptilt. Päristuumsete puhul allub pre-mRNA protsessingule.

Transkriptsioonijärgsed protsessid päristuumsetes organismides

Pre-mRNA-d modifitseeritakse kolmel viisil. Kõik protsessid toimuvad rakutuumas. Esimese etapina lisatakse pre-mRNA 5' otsa 7-metüülguanosiin. Protsess vajab ensüüme fosfataasi ja guanosüül transferaasi. Protsess kannab nimetust capping ning selline pre-mRNA modifitseerimine kaitseb RNA transkripti ribonukleaaside eest, mis seonduvad just 3'5' fosfodiestersidemetele. Polüadenülatsiooni faasis lisatakse pre-mRNA 3' otsa umbes 250 adeniini ning seda kutsutakse polü(A) sabaks. Prekursormolekulina kasutatakse ATPd. Sünteesijärgselt seob polü(A) saba endaga mitmeid valke, mis kaitsevad 3' otsa ribonukleaaside eest. Viimast modifikatsiooni etappi nimetatakse splaissimiseks. Selle protsessi tulemusena lõigatakse pre-mRNA-st välja intronid, mis ei kodeeri valke, ja ühendatakse eksonid üheks molekuliks. Reaktsiooni viib läbi suur valguline kompleks splaissosoom. Paljusid pre-mRNA-sid, ka neid, mis kodeerivad antikehi, võib splaissida mitmel viisil, et toota erinevaid mRNA-sid, mis kodeerivad erisuguseid valke. Viimast protsessi tuntakse alternatiivse splaissingu nime all. See lubab toota küllaltki suurt hulka valke piiratud DNA kogusest. Protsessingu tulemusena moodustub küps mRNA, mis on valmis translatsiooniks tsütoplasmas.

Translatsioon

Valkude sünteesi nimetatakse eri allikates translatsiooniks. Tegelikult on translatsioon üldise valgu biosünteesi kolmas etapp. Ribosoom kodeerib transkriptsiooni käigus loodud mRNA aminohappeks või polüpeptiidiks, mis hiljem voltub aktiivseks valguks. Translatsioon toimub tsütoplasmas, kus paiknevad ribosoomid. Ribosoomid koosnevad kahest alaühikust – suurest ja väikesest, mis ümbritsevad translatsiooni protsessi ajal mRNA-d. mRNA seondub ribosoomi spetsiifilise stardisignaaliga, mis asub P-saidis. Stardikoodoni tunneb ära initsiaator-tRNA. Pärast seda, kui initsiaator-tRNA ja mRNA on seondunud ribosoomi väikesele alaühikule, seondub sellele ka suur alaühik. mRNA kodeeritakse tootma erilist polüpeptiidi, mis vastab geneetilise koodi reeglitele. Selle reegli kohaselt kasutatakse mRNA-d mallina tootmaks aminohappelist ahelat, millest hiljem moodustub valk. Translatsioon koosneb neljast etapist: aktivatsioon ehk ergastamine, initsiatsioon ehk algatamine, elongatsioon ehk pikendamine ja terminatsioon ehk lõpetamine. Kõik neli kirjeldavad kasvavat aminohappelist ahelat.

Aktivatsiooni etapis seotakse vastavate süntetaaside abil õige aminohape talle sobiva tRNA-ga. Kuigi seda ei loeta translatsiooni tehniliseks etapiks, on see staadium, kust alates võib translatsioon edasi minna. Aminohape seob end tRNA-ga oma karboksüülrühma abil, tRNA-l on selleks olemas 3’ hüdroksüülrühm, moodustub esterside. tRNA on nüüd laetud olekus. Initsiatsiooni etapp hõlmab ribosoomi väikese alaühiku seondumist mRNA 5’ otsale. Sellel etapil on abiks initsiatsioonifaktor. Ka teised valgud võivad selles etapis abiks olla. Elongatsiooni faas jõuab kätte, kui järgmine aminoatsüül-tRNA ehk laetud tRNA seondub ribosoomiga, koos GTP ja elongatsioonifaktoriga. Tähtsal kohal on sõnumi õigesti kodeerimine, seepärast on olemas ka lisakontrolli protsess, mida nimetatakse täppislugemiseks (proofreading).

Elongatsioonifaktoritel on kaks põhilist ülesannet – aminoatsüül-tRNA seondumine A-saiti ja peptidüül-tRNA translokatsioon A-saidist P-saiti. Samas, elongatsiooni tähtsaim protsess – peptidüülrühma ülekandmine on spontaanne protsess ning ei vaja lisafaktoreid.

Terminatsioonietapp jõuab kätte siis, kui ribosoomi A-sait tunneb ära stoppkoodoni (kas UAA, UAG või UGA). tRNA ei tunne sellist järjestust, kuid vabastusfaktor (releasing factor) tuvastab "veidrad järjestused" ning põhjustab aminohappelise ahela vabastamist.

Võimet peatada või inhibeerida valgusünteesi kasutavad mitmed antibiootikumid, nagu näiteks anisomütsiin, tsükloheksimiid, klooramfenikool, tetratsükliin, streptomütsiin ja teised.

Posttranslatsioonilised protsessid

 Pärast valgusünteesi toimub valgu keemiline modifikatsioon, mida nimetatakse posttranslatsiooniliseks modifikatsiooniks ja valgu voltumine. Posttranslatsioonilised modifikatsioonid on valgu biosünteesi hilisem staadium, seega on nad geeniekspressioonil tähtsad. Posttranslatsioonilised modifikatsioonid laiendavad valkude funktsioone. Tavaliselt rünnatakse valkude funktsionaalseid gruppe, näiteks atsetaate, fosfaate, erinevaid lipiide ja karbohüdraate. Sageli muudetakse aminohapete keemilist iseloomu (näiteks arginiini muutmine tsitrulliiniks) ja keemilist struktuuri (disulfiidsildade moodustamine).

Ensüümid võivad eemaldada aminohappeid valkude N-terminaalsest otsast ja lõigata peptiidahelat keskelt. Näiteks hormooni insuliin lõigatakse kaks korda pärast disulfiidsildade moodustumist – keskelt eemaldatakse propeptiid ja lõplik valk koosneb kahest polüpeptiidiahelast, mis on ühendatud disulfiidsildadega. Esimeseks aminohappeks valguahelas on tavaliselt metioniin, mis eemaldatakse sageli posttranslatsioonilisel modifikatsioonil.

Fosforüleerimist kasutatakse kontrollimaks valgu käitumist, viimase aktiveerimisel ja inaktiveerimisel.

Posttranslatsioonilist modifikatsiooni jälgitakse massispektromeetria ja Eastern bloti abil.

Valkude voltumiseks nimetatakse valkude omadust võtta erilist kuju. Oletatakse, et enne ja pärast valgusünteesi moodustavad valgud sekundaarseid ja tertsiaarseid struktuure.