T-rakkude retseptorid

T-rakkude retseptorid (ingl T-cell receptors, TCR, ka TcR) on lümfoid(-immuun)süsteemiga loomadel T-rakkude membraanil paiknevad valkude kompleksid ja immuunretseptorid, mille ülesandeks on antigeenide äratundmine üksnes läbi organismiomaste MHC-molekulide ja immuunvastuse regulatsioon.

T-raku retseptori kompleksi illustratsioon - koos TCR-α ja TCR-β ahelaga, CD3 ja ζ-ahela molekuliga

T-rakkude koolitamine MHC-molekulide tunnistamiseks toimub tüümuses.

Nii näiteks tunnevad T-rakkude retseptorid ehk TCR-molekulid ära kehavõõraste antigeenide olemasolu viirusega nakatatud rakumembraanil koos raku enda peamise koesobivuskompleksi (inimestel HLA) antigeenidega.

TCR-molekulid aktiveeritakse biokeemiliste sündmuste toimel, mille vahendajateks on ensüümid, koretseptorid, spetsiaalsed molekulid ja aktiveeritud või vabastatud transkriptsioonifaktorid.

TCR-molekulide aktiveerimise tulemina võidakse suunata T-rakkude diferentseerumist T-abistajarakkudeks või tsütotoksilisteks T-rakkudeks ja paljunemist ning geeniekspressiooni muutmist.

T-rakkude retseptorid koosnevad kahest erinevast valguahelast kas α ja β või γ/δ ahelatest, mida kodeerivad vastavad geenid, mõlemad αβ ja γδ T-rakud on võimelised tsütokiine sünteesima ja mikroorganismidele ning vähirakkudele toksilisi aineid eritama.

Lisaks TCR pinnaretseptoritele espresseerivad tümotsüüdid ka mitmeid teisi antigeene, näiteks CD-sid.

T-rakkude retseptorid erinevad immunoglobuliinidest.

T-rakkude kurnatus

• T-rakkude kurnatus ehk T-rakkude jõuetus (T-cell exhaustion) on toimivate T-rakkudega selgroogsetel loomadel esineda võiv kehasisene seisund, mida iseloomustab T-rakkude talitluse järkjärguline ja pidev kadumine, nende võimetus vastata signaalidele ja ka nende rakkude füüsiline hävimine.
  

T-rakkude kurnatust on täheldatud kroonilise lümfotsüütkoriomeningiidi korral ja seisund tekib antikehade resistentsuse seisundi (antigen-persistence) tõttu, mida aga esineb mitmete krooniliste nakkustekitatajate leviku korral inimkehas, nagu B-hepatiidi viirus, C-hepatiidi viirus, HI-viiruse ja ka kasvajate 'väljakasvul' (teiste elundite hõivel).

T-rakkude kurnatus oleneb paljudest teguritest, nende hulgas antigeense aktivatsiooni kestvus ja ulatus, CD4 T-rakkude abi, stimuleerivate ja supresseerivate tsütokiinide olemasolu ja ka aktiveerivate ja inhibeerivate retseptorite olemasolu.

Võimetus vastata ja toimida ei piirdu ainult CD8 T-rakkude vastustega ka CD4 T-rakkudel esineb mitmete infektsioonide korral talitlushäireid. Kurnatud rakkude vastuseid on dokumenteeritud nakatumiste korral järgmiste allikatega: polyomaviruses, lümfotsüütkoriomeningiit, adenoviirused, Friend leukaemia virus, hiire hepatiidi viirus, HI-viirus, B- ja C-hepatiidi viirus.

Talitlushäirega seostatakse nende rakkude võimetust eritada IL-2, TNFα ja IFNγ.

T-rakkude hääbumisel on oma roll IL-10 tootmisel.

Malaariauuringutes on uuritud PD-1 mehhanismi osalust (valk, mis reguleerib T-rakkude aktivatsiooni (immunoloogiline sünaps) ja võimalik, et toodud valk osaleb T-rakkude "vaigistamisel" – uuringud näitasid CD4+ T-rakkude (tüümusest küpsenud T_h rakud) jõuetust ja suremist ning CD8+ T-rakkude arvukuse vähenemist ja raku programmeeritud surma esilekutsumist.

Antigeen

Antigeen (ladina antigenes; lüh Ag) on selgroogse organismi tunginud võõraine (enamasti valk), mis seotakse spetsiifiliselt antikehaga või T-rakkude retseptoriga. Antigeenidena võivad toimida praktiliselt kõik bioloogilised makromolekulid: polüpeptiidid, polüsahhariidid, nukleiinhapped jt.

Antigeen on aine, mis stimuleerib antikehade teket; antigeeni, mis kutsub esile immuunvastuse, nimetatakse immunogeeniks.

Antigeen on üldiselt potentsiaalselt organismi kahjustav kehavõõras aine, mille sissepääs organismi põhjustab spetsiifiliste, nende vastu suunatud antikehade tekke, samuti lümfotsüütide aktiivseks muutumise.

Antigeenidena võivad toimida ka maomürgis sisalduvad molekulid, kui need kutsuvad maohammustuse järgselt nii madudel endil (maolt maole) kui ka teistel hammustada saanud loomadel esile antikehade tekke.

Antigeenid võivad organismi tungida naha, limaskestade, hingamis- ja seedetrakti kaudu.

Antigeenide loend (osaline)

• A-antigeen - erütrotsüütide (jt rakkude) pinnal olev A-vererühma antigeen
• Austraalia antigeen - B-hepatiidi pinnaantigeen;
• B-antigeen - erütrotsüütide (jt rakkude) pinnal olev B-vererühma antigeen;
• HL-antigeen (lüh HLA) - rakkude pinnal olev valk, mille alusel T-rakud tunnistavad oma organismi rakke

Lümfijuha

Lümfijuhadeks nimetatakse paljude selgroogsete loomade lümfisüsteemi (lümfoid(-immuun)süsteemi) kuuluvaid teatud jämedaimaid lümfisooni, mis moodustuvad väiksemate lümfisoonte liitumisel, milles liigub lümf ja mis suubuvad venoossesse vereringesse.

Lümfijuhade areng, anatoomia, morfoloogia, histoloogia ja patoloogia võivad erineda nii liigiti kui ka indiviiditi.

Imetajatel

Inimestel

Inimestel koonduvad lümfisooned kahte suurde lümfijuhasse:

• parem lümfijuha (ductus lymphaticus dexter),
• rinnajuha (ductus thoracicus).

Alzheimeri tõbi

Alzheimeri tõbi on terminaalne neurodegeneratiivne haigus, mida 1906. aastal kirjeldas esimesena Alois Alzheimer, kelle järgi haigus on ka nimetuse saanud.

Pildil on vasakul normaalse eaka inimese aju ja paremal Alzheimeri haige aju. Eristustunnused on välja toodud.

Alzheimeri tõbe klassifitseeritakse RHK-10 järgi koodiga G30.

Alzheimeri tõbe on liigitatud ka III tüüpi suhkurtõveks.

Alzheimeri tõbi on peaaegu poolte dementsuse juhtude põhjuseks. Dementsust, mis kujuneb välja Alzheimeri tõve tõttu, käsitletakse orgaaniliste psüühikahäirete rubriiki kuuluva haigusena (dementsus Alzheimeri tõvest).

Esinemine

Enamasti diagnoositakse Alzheimeri tõbi üle 65-aastastel, kuigi haruldasem varajane Alzheimeri tõbi võib esineda palju nooremas eas. 2006. aastal põdes Alzheimeri tõbe maailmas 26,6 miljonit inimest. Prognoositakse, et 2050. aastaks põeb maailmas iga 85. inimene Alzheimeri tõbe.

Põhjus

Alzheimeri tõve põhjus ei ole selge. On näidatud haiguse seost seniilnaastude ehk amüloidnaastude ehk amüloidiladestusega naaste ja neurofibrillaarsete tänkudega peaajus.

Sümptomid ja haiguse kulg

Kuigi Alzheimeri tõbi on igal inimesel erineva iseloomuga, on sel haigusel palju ühiseid sümptomeid. Esimesi sümptomeid peetakse sageli ekslikult eaga kaasnevateks vaevusteks või stressi ilminguteks. Kõige tunnustatum varajane sümptom on meeldejätmisvõimetus (näiteks on raske meenutada hiljuti nähtut). Kui tekib Alzheimeri tõve kahtlus, siis diagnoosi kinnitatakse tavaliselt käitumishinnangutega ja kognitiivsete testidega; sageli järgneb võimaluse korral ajuskaneering.

Haiguse süvenedes tekivad muu hulgas orienteerumatus, ärrituvus ja agressiivsus, meeleolu kõikumised, keelevõime halvenemine, pikaajalise mälu kaotus ning meelte nõrgenemine, mis tingib patsiendi enesessetõmbumise. Keha funktsioonid nõrgenevad, mis põhjustab lõpuks surma. Konkreetse patsiendi prognoos on keeruline, sest haiguse kestus varieerub. Alzheimeri tõbi kulgeb määramata aja latentselt ning võib aastaid progresseeruda, ilma et seda diagnoosimataks. Pärast diagnoosimist on patsiendil jäänud elada keskmiselt umbes seitse aastat. Alla 3% haigetest elab pärast diagnoosi panemist üle 14 aasta.

Haiguse kulg jaguneb neljaks staadiumiks, mille jooksul kognitiivsed ja funktsionaalsed häired süvenevad.

Eeldementsus

 Esimesed sümptomid pannakse sageli ekslikult vananemise või stressi 

arvele. 

Põhjalikul neuropsühholoogilisel testimisel on võimalik leida kergeid kognitiivseid raskusi kuni kaheksa aastat enne, kui on võimalik kliiniliselt diagnoosida Alzheimeri tõve. Need varajased sümptomid võivad häirida keerukamaid igapäevatoiminguid. 

Märkimisväärseim vaevus on mälukaotus, mis ilmneb raskuses meenutada hiljuti teada saadud asju ja võimetuses omandada uut infot.

Alzheimeri tõve varajases staadiumis võib olla kergeid raskusi ka tähelepanu, planeerimise, paindlikkuse ja abstraktse mõtlemisega ning semantilise mälu (tähenduste ning mõistetevaheliste suhete mälu) halvenemist. Võib esineda apaatia, mis jääbki haiguse kogu kulu jooksul kõige püsivamaks neuropsühhiaatriliseks sümptomiks. Haiguse eelkliinilist staadiumi on nimetatud ka kergeks kognitiivseks häireks, kuid puudub üksmeel selles, kas tegu peaks olema eraldi diagnoosiga või lihtsalt Alzheimeri tõve esimese astmega.

Kerge staadium

Õppimisvõime ja mälu halvenedes pannakse Alzheimeri haigetele lõpuks lõplik diagnoos. Väikesel osal neist on mäluhäiretest suuremaks vaevuseks keelevõime, tähelepanu, planeerimise, taju (agnoosia) või liigutuste tegemise võime (apraksia) halvenemine. Alzheimeri tõbi ei kahjusta kõiki mäluvõimeid võrdselt. Pikaajaline mälu varasema elu kohta (episoodiline mälu) ja õpitud faktide kohta (semantiline mälu) ning implitsiitne mälu (keha mälu, näiteks kuidas noa ja kahvliga süüa) kahjustuvad vähem kui uute faktide meeldejätmise ja meenutamise võime.

Probleemid keelega ilmnevad enamasti sõnavara vähenemises ja sõnade väiksemas käepärasuses, mis toob kaasa suulise ja kirjaliku kõne üldise vaesustumise. Sel staadiumil on haige tavaliselt võimeline lihtsamaid mõtteid korralikult edasi andma. Peenmotoorsete tegevuste (näiteks kirjutamine, joonistamine, riietumine) võib esineda koordinatsiooni- ja planeerimisraskusi (apraksia), kuid tavaliselt jäävad need märkamatuks. Haiguse süvenedes teevad haiged tavaliselt paljusid asju endiselt iseseisvalt, kuid nad võivad vajada abi kognitiivselt nõudlike tegevuste juures.

Keskmise raskusastmega staadium

Haiguse süvenedes kaob lõpuks haigete iseseisvus, nii et nad pole võimelised sooritama kõige tavalisemaidki igapäevatoiminguid. Võimetuse tõttu sõnu meenutada tekivad sagedased ebaõiged sõnaasendused (parafraasiad). Ka kirjutamis- ja lugemisoskus aina halvenevad. Haiguse süvenedes halveneb keerukate tegevuste koordinatsioon, näiteks suureneb kukkumisoht. Mälu halveneb veelgi ja haige ei pruugi oma lähedasi sugulasi ära tunda. Halveneb ka pikaajaline mälu, mis varasemates staadiumides säilis.

Rohkem hakkavad ilmnema käitumuslikud ja neuropsühhiaatrilised muutused. Tavalised ilmingud on uitamine, ärrituvus ja emotsionaalne labiilsus, mis ilmneb nutus, ettekavatsemata agressiivsushoogudes ja vastupanus hooldamisele.

Ravi ja ennetamine

Praegu kasutatavatel ravivõtetel on väike sümptomaatiline efekt. Pole olemas haiguse progresseerumist peatavat ega aeglustavat ravi. 2008. aastaks oli tehtud üle 500 kliinilise katse Alzheimeri tõve ravi leidmiseks, kuid polnud teada, kas mõni neist invasiivsetest võtetest annab lootust.

Alzheimeri tõve profülaktikaks on pakutud hulk eluviisiharjumusi, kuid pole tõendeid, et need degeneratsiooni pärsiksid. Haiguse ärahoidmiseks ja sellega paremaks toimetulemiseks soovitatakse ajutreeningut, kehalisi harjutusi ja tervislikku toitumist.

Et Alzheimeri tõbi ei ole ravitav ja on degeneratiivne, siis on väga suur tähtsus patsientide hooldamisel. Peamiseks hooldajaks on sageli abikaasa või lähedane sugulane. Alzheimeri tõbi asetab hooldaja õlule suure koorma (vaata Nõdrameelse hooldamine). Sellel võivad olla hooldaja elule rasked sotsiaalsed, psühholoogilised, füüsilised ja majanduslikud tagajärjed. Arenenud riikides on Alzheimeri tõbi ühiskonnale üks kulukamaid haigusi.

Haploidsus

Haploidsus (kr. keelest haplos üksik ja eidos kuju; inglise haploidy) indiviidi (raku) kromosoomistiku poolkordsus, liigi haplofaasile omase (gameetse) kromosoomistiku olemasolu. Haploidsust tähistatakse tavaliselt sümboliga "n".

Suguliselt sigivatel organismidel vahelduvad elutsüklis haploidne ja diploidne faas. Inimese haploidsetes rakkudes, sugurakkudes (gameet) on 23 kromosoomi.

Gameet

Gameet on organismi sugurakk. Eristatakse kahte tüüpi gameete: munarakud ja seemnerakud. Gameetide ühinemisel saab tekkida sügoot, viljastatud munarakk, millest areneb soodsate tingimuste korral uus hulkrakne organism. Gameedid on mitmeski mõttes eripärased rakud. Nad erinevad keharakkudest, somaatilistest diploidsetest rakkudest kromosoomi arvu poolest. Sugurakud on haploidsed (kahekordselt vähenenud kromosoomistikuga) rakud. Samuti ei kuulu gameedid ühegi organismi koe koosseisu. Lisaks sellele on sugurakud nii öelda kehavõõrad - väljaspool suguelundeid või muid selleks ette nähtud kohti kutsuks nad esile keha kaitsereaktsiooni, immuunvastuse. Rakutuum on spermi mõõtmetega võrreldes suhteliselt suur, munaraku mõõtmetega võrreldes aga väike. Arengubioloogias väljendatakse seda tuuma-tsütoplasma suhtena. Spermis on nende mahuline vahekord umbes 1:1 (50%/50%), munarakus 1:1000, tavalises keharakus 1:100. Sugurakud tekivad täiskasvanud organismis mitoosi teel. Sugurakkude arengut nimetatakse gametogeneesiks. 

Sõna gameet etümoloogia on tulnud vanakreeka keelest. Gametes γαμέτης "abielumees" / gamete γαμετή "abielunaine".

Diploidsus

Diploidsus on liigiomase kromosoomikomplekti kahekordsus indiviidi (raku) kromosoomistikus.

Enamikul taimedel ja loomadel on valdavas osas elutsüklist keharakud diploidsed.

Transformatsioon (geneetika)

Transformatsioon on muutus raku genoomis, mis juhtub vaba, valkude poolt sidumata eksogeense DNA sattumisest väliskeskkonnast läbi rakumembraani rakku, kus see raku enda geneetilise materjaliga liidetakse ja võõrgeeni ekspresseeritakse. Transformatsiooni esineb osal bakteriliikidest looduslikult, kuid seda kasutatakse ka laboratoorselt erinevate molekulaarsete tehnikate käigus. Transformatsioon on üks kolmest protsessist, mille abil bakterirakud geneetilist materjali vahetavad. Teisteks võimalusteks on konjugatsioon, mis esineb kahe bakteri otsesel kokkupuutel, ja transduktsioon, kus eksogeenne materjal viiakse bakterirakku bakteriofaagi abil. Baktereid, kes on võimelised transformeeruma, nimetatakse kompetentideks. Ka teisi rakke peale bakterite on võimalik transformeerida, näiteks taime- ja loomarakke, kuid eelistatum mõiste kirjeldamaks võõra DNA viimist eukarüootsesse rakku on transfektsioon. Loomarakkude puhul välditakse selle protsessi puhul transformatsiooni mõiste kasutamist, sest maliigse transformatsiooni all mõistetakse ka normaalsete rakkude muutumist pahaloomulisteks kasvajarakkudeks, millel pole seost rakuvälise geneetilise materjali sattumisega rakku.

Ajalugu

Esmakordselt demonstreeris transformatsiooni aastal 1928 briti bakterioloog Frederick Griffith, kes uuris kaht Streptococcus pneumoniae tüve. Kui Griffith süstis hiiri ohutu tüve (II-R) bakterite või kuumusega tapetud haigust tekitava tüve (III-S) bakteritega, jäid hiired ellu, kuid nende kahe kombinatsioon osutus hiirtele surmavaks. Surnud hiirte verest õnnestus tal isoleerida mõlema tüve elusaid rakke ning järeldas sellest, et mingi seaduspära järgi on võimalik ühe bakteritüve muundumine teiseks. Tema mõtet arendasid edasi Oswald Avery, Colin MacLeod ja Maclyn McCarty, kes tõestasid aastal 1944, et tegu on geneetilise materjali ülekandega. Kasutades samu tüvesid, isoleerisid nad virulentse tüve DNA ja näitasid, et selle viimisest II-R tüvesse piisab, et kahjutu tüvi samuti virulentseks muutuks, kummutades sellega tol ajal laialt levinud arusaama, et valgud on pärilikkust kandvaks materjaliks. DNA haaramist väliskeskkonnast rakku ja selle arvamist raku enese DNA hulka hakkasid nad nimetama transformatsiooniks. Algul suhtuti nende avastusse küll umbusuga, kuid geneetiliste markerite kasutuselevõtt Joshua Lederbergi avastused teiste geneetilise materjali ülekandeviiside osas (konjugatsioon 1947. ja transduktsioon 1953. aastal) veensid teaduskogukonda Avery tulemusi tunnustama.

Siiski oldi üsna veendunud, et Escherichia coli ei ole transformatsioonialdis. Alles aastal 1970 näitasid Morton Mandel ja Akiko Higa, et kaltsiumkloriidi lahusega töötlemise tagajärjel on E. coli võimeline väliskeskkonnast ilma faagi abita bakteriofaagi DNA-d inkorporeerima. Paar aastat hiljem tõestasid Stanley Cohen, Annie Chang ja Leslie Hsu, et sarnane meetod on efektiivne ka plasmiidse DNA puhul. Mandeli ja Higa meetodit arendas hiljem edasi Douglas Hanahan. Kunstlikult tekitatud kompetentsus E. coli kui laialdaselt kasutatava mudelorganismi puhul pani aluse mugava ja efektiivse metoodika arendamisele bakterite transformeerimiseks, mis võimaldab biotehnoloogias ja teadustöös kasutada varasemast oluliselt lihtsamaid molekulaarse kloonimise võtteid. Praeguseks on transformatsiooni näol tegu igapäevase laboriprotseduuriga.

Transformatsioon elektroporatsiooni teel arendati välja 1980. aastate lõpul, parandades in vitro transformatsiooni efektiivsust ja tekitades võimalusi enamate bakteritüvede transformatsiooniks. Uuriti ka taime- ja loomarakkude transformeerimise võimalusi, mis päädis esimese transgeense hiire loomisega aastal 1982, süstides hiire embrüosse geeni roti kasvuhormooni jaoks. 1970. aastate alguses avastati, et Ti-plasmiid Agrobacterium tumefaciens′i rakkudes on põhjuseks, miks bakter taimedele kasvajaid tekitab. Ti-plasmiid integreerub taime genoomi, kutsudes esile tuumorite teket. Asendades Ti-plasmiidis kasvajat tekitava geeni mõne muu geeniga, on võimalik A. tumefaciens’iga taimi nakatades viia kaheiduleheliste taimede genoomi valitud DNA. Üheiduleheliste ja mõningate teiste A. tumefaciens’i suhtes resistentsete taimede transformatsiooniks kasutatakse elektroporeerimist ning mikroinjektsiooni. Biolistilise meetodi ehk raku pommitamise geneetilise materjaliga kaetud metalliioonidega võttis 1990. aastal kasutusele John Stanford.

Mehhanismid

Bakterid

Bakterite puhul mõistetakse transformatsiooni all püsivat muutust raku genoomis, mida on toonud kaasa vaba DNA haaramine väliskeskkonnast rakku ja kompetentsuse all peetakse silmas võimet vaba DNA-d rakuvälisest keskkonnast rakku võtta. Kompetentsus võib esineda nii looduslikult kui tekkida kunstlikult.

Looduslik kompetentsus

Umbes 1% bakteriliikidest on loomulikult kompetentsed, olles võimelised laborikeskkonnas ilma lisatöötluseta vaba DNA-d oma rakku võtma. On alust arvata, et looduslikus keskkonnas on see protsent suurem. DNA kandumist ühelt bakterilt teisele nimetatakse horisontaalseks geeniülekandeks ehk geneetilise materjali saamiseks teiselt organismilt, olemata selle järglane. Lähedaste liikide vahel toimib transformatsioon paremini kui evolutsiooniliselt kaugemate liikide puhul. Looduslikult kompetentsetes bakterites on olemas geenikomplektid, mis kodeerivad DNA transmembraanseks transpordiks vajalikke valke, näiteks DNA translokaasi komplekse tsütoplasmamembraanis ja tüüp IV piilide kokkupanekuks tarvilikke valke.

Tulenevalt grampositiivsete ja gramnegatiivsete bakterite rakumembraani erinevustest esineb mõningaid erinevusi viisis, kuidas bakterid rakuvälist geneetilist materjali enda sisse toovad, kuid üldjoontes on protsess sarnane. Esmalt seondub DNA kompetentse raku pinnal paiknevale DNA-retseptorile ja liigub DNA translokaasi abil läbi rakumembraani. Selle käigus lagundatakse selle üks ahel nukleaaside poolt, kuna rakku pääseb vaid üheahelaline DNA. Sellist üheahelalist DNA-d on RecA ehk rekombinaas A abil võimalik genoomi integreerida. Gramnegatiivsed bakterid vajavad oma rakuseina mitmekihilise ehituse tõttu valgulist kanalit ka välismembraanis, mille moodustavad sekretiinid. Arvatakse ka, et oma roll on piliinil, kuid selle funktsiooni kohta pole veel kuigi palju teada. DNA transport rakku ei sõltu enamasti selle järjestusest, ent mõne liigi puhul võivad kindlad järjestused rakuvälises DNA-s seda soodustada.

Kunstlik kompetentsus

Kunstliku kompetentsuse tekitamiseks on kaks enamlevinud meetodit: elektroporatsioon ja rakkude manipuleerimine temperatuuri ning soolalahuse abil. Mõlemad neist muudavad rakumembraani DNA-le passiivselt läbitavaks looduses harilikult mitteilmnevate keskkonnategurite mõjul.

Elektroporatsiooni käigus antakse bakterirakke sisaldavale lahusele, kuhu on lisatud soovitav plasmiid, elektrilöök, mis perforeerib rakumembraani, et plasmiidne DNA siseneda saaks. Pärast elektriväljale eksponeerumist parandavad bakteri kaitsemehhanismid rakumembraani defektid taas ära. Tegu on rakusõbralikuma meetodiga kui soolalahuse kasutamine, kuna rakud viibivad kahjustavates tingimustes palju lühemat aega. Kasutatava elektrivälja tugevus jääb tavaliselt vahemikku 10–20 kV/cm.

Keemilisi kompetente hoitakse mõnda aega jää peal kahevalentsete katioonidega soolalahuses, enamasti kaltsiumkloriidi lahuses, misjärel vapustatakse neid kiire lühiajalise kuumutamisega. Arvatakse, et soolalahuse positiivsed ioonid aitavad bakteriraku negatiivse laenguga pinnamolekule neutraliseerida, muutes membraani negatiivselt laetud DNA jaoks paremini läbitavaks. Kuumašokk on vajalik selleks, et tekitada temperatuurierinevus raku sise- ja väliskeskkonnas, mis sunnib DNA läbi kahjustatud membraani rakku sisenema.

Taimed

DNA viimiseks taimedesse on mitmeid mehhanisme. Lihtsaim neist on transformatsioon Agrobacterium tumefaciens’i abil. Selleks lõigatakse taimekude, milleks tavaliselt on leht, väikesteks tükkideks ja leotatakse umbes kümme minutit Agrobacterium’i sisaldavas suspensioonis. Lõikepindade servmised rakud transformeeruvad bakteri mõjul Kui selliselt töödeldud koetükid juurdumise ja võrsekasvu suhtes selektiivsel söötmel üles kasvatada, saadakse geneetiliselt modifitseeritud taimed. Mõnede taimeliikide puhul piisab ka sellest, kui nende õis bakterisuspensiooni kasta ja hiljem seemned selektiivsele söötmele külvata. Paljusid taimeliike selle meetodiga siiski modifitseerida ei saa. Suur osa taimedest on transformeeritavad kulla- või volframiosakestega pommitamise teel. Selleks kaetakse metalliosakesed DNA-ga ning tulistatakse noortesse taimerakkudesse või taimeembrüosse. Efektiivsus on sel meetodil küll madalam kui Agrobacterium’i kasutades, kuid sobivate taimeliikide valik on oluliselt laiem. Samuti on eeliseks see, et nii saab transformeerida ka taime plastiide. Kolmandaks võimaluseks on taimerakkude elektroporatsioon, mis toimib sarnaselt bakterite puhul kirjeldatule.

Geneetilist materjali on võimalik taimerakkudesse viia ka mitmete taimeviiruste abil, kuid siis pole tegemist transformatsiooni, vaid transduktsiooniga – rakku viidav info on pakitud viiruskapslisse. Kuna suurem osa taimeviirustest on ssRNA-viirused, kelle pärilik materjal replitseerub tsütoplasmas, siis saab sel moel enamasti modifitseerida vaid üht põlvkonda rakke. Nakatatud taime järglased ei ole viirusega nakatunud ega kanna endas sisestatud geeni. DNA-viirused seevastu on võimelised kromosoomidega rekombineeruma, tekitades taime genoomis püsivaid muutusi, mis kanduvad üle ka järglastele.

Loomad

DNA viimist loomsetesse rakkudesse nimetatakse harilikult transfektsiooniks. Ka sel puhul muudetakse rakusein erinevate võtete abil poorseks, et soovitud materjal rakku liikuda saaks. Transfektsioon ei tähenda ainult DNA viimist rakku, vaid ka siRNA konstruktsiooni või valgu (näiteks antikeha) rakku sisestamist. Transfekteerimiseks kasutatakse kaltsiumfosfaati, elektroporatsiooni või segatakse rakku viidav aine katioonsete lipiididega, moodustamaks liposoome, mis membraaniga ühinedes sisaldise rakku viivad.

Rakendusi molekulaarbioloogias

Kunstliku kompetentsuse tekitamine bakterites võimaldab DNA-ga ja valkude ekspressiooniga manipuleerida. Levinuimaks mudelorganismiks on Escherichia coli, mida enamasti plasmiididega transformeeritakse. Plasmiidsel DNA-l peab rakku püsimajäämiseks olema oma replikatsiooni alguspunkt, et seda genoomist sõltumatult paljundada saaks. Transformatsiooni efektiivsuse ehk tõhususe, millega töödeldud bakterid väliskeskkonnast DNA-d omastavad, mõõtühikuks on CFU/μg DNA kohta.

CFU ehk colony forming unit väljendab eluvõimeliste rakkude hulka mingis koguses lahuses. Väikese plasmiidi, nagu pUC19 puhul tähendab transformatsiooniefektiivsus 1×10⁸ CFU/μg seda, et umbes üks plasmiid 2000 hulgast siseneb rakku. Keemiliste kompetentide puhul hoitakse rakke jää peal külmas CaCl₂ lahuses, muutes rakud plasmiidsele DNA-le läbitavaks. Rakke inkubeeritakse jääl plasmiidi juuresolekul ja seejärel kuumutatakse 42 °C juures sõltuvalt metoodikast 30–120 sekundit. Mittetööstuslikud meetodid annavad tulemuseks keskmiselt 10⁶–10⁷ transformanti mikrogrammi plasmiidi kohta. Keemiline meetod toimib plasmiidse DNA puhul väga hästi, kuid ei sobi lineaarsete DNA-fragmentide puhul, arvatavasti seetõttu, et raku eksonukleaasid lagundavad lineaarse DNA kiiresti ära. Looduslikud kompetendid seevastu transformeeruvad lineaarse DNA-ga paremini kui plasmiidsega.

Transformatsiooni efektiivsus väheneb plasmiidi suuruse kasvades, mistõttu kasutatakse suuremate DNA-molekulide puhul elektroporatsiooni. Elektroporeeritavaid rakke on enne töötlust soovitatav pesta külma mitmekordselt destilleeritud veega, eemaldamaks laetud osakesi, mis protsessi käigus sädet anda võiksid.

Transduktsioon

Transduktsioon (inglise keeles transduction) on geneetilise info kandumine ühelt bakterirakult teisele bakteriofaagide (viiruste) vahendusel.

Transduktsioon

Viiruste vahendatud transduktsiooni peetakse tänapäeval võimalikuks ka kõrgematel loomadel.

Transduktsioon avastasid 1952. aastal USA geneetikud Norton Zinder ja Joshua Lederberg.