Geenivektor

Geenivektor ehk geenisiirdaja on geeniteraapias kasutatav rekombinantse DNA või RNA konstrukt, milles siiratav pärilikkusaine on ühendatud elementidega, mis võimaldab sellel rakku siseneda, seal integreeruda ja avalduda.
Geeniteraapias kasutatakse viiruslikke ja mitteviiruslikke vektoreid. Vektori valik sõltub sihtmärkrakust ja terapeutilise geeni omadustest, näiteks selle suurusest ja avaldumise ajast.

Viirusvektorid

Viiruslikud vektorid põhinevad viirustele omasel käitumisel tungida organismi rakku, seal paljuneda ning sisestada oma pärilikkusaine peremeesorganismi genoomi.
Viirusvektori konstrueerimisel asendatakse enamik viiruse pärilikkusainet terapeutilise geeniga, kuid seejuures säilitatakse viiruse nukleiinhapete osa, mis on vajalik rakule kinnitumise ja rakku sisenemise tagamiseks.
Kuigi viirusvektorid on geeni viimisel rakku efektiivsemad kui mitteviiruslikud vektorid, võib nende kasutamisega kaasneda viiruslik infektsioon. Peamised geeniteraapias kasutatavad viirused on retroviirus, adenoviirus, adenoassotsieerunud viirus, alfaviirus, herpesviirus ja vaktsiinia viirus. 2012. aasta seisuga oli inimese geeniteraapia näidetest umbes 70% sellised, kus DNA viimiseks kudedesse on kasutatud viirusvektoreid.

Viirusvektorite konstrueerimine

Viirusvektori konstrueerimisel arvestatakse, et ideaalne viiruslik vektor hõlmab kõiki viiruse infektsioonitsüklile omaseid tunnuseid, kuid samas tuleb vältida haigust põhjustavate geenide avaldumist sihtmärkrakus. Selleks asendatakse enamik viiruse pärilikkusaine terapeutilise geeniga, kuid seejuures säilitatakse viiruse nukleiinhapete osa, mis on vajalikud rakule kinnitumiseks, rakku sisenemise tagamiseks, pärilikkusaine pakkimiseks kapsiidi ning DNA terapeutilise geeni lülitamiseks raku genoomi. Neid geene nimetatakse cis-elementideks. Kustutatud viiruse geenid, mis on seotud replikatsiooni, kapsiidi- ja membraanivalkudega, paiknevad eespool nimetatud geenidest eraldi konstruktis, näiteks plasmiidis. Neid nimetatakse trans-elementideks. Seejärel viiakse vektorgenoom ja trans-elemendid pakkimisrakku ning seal moodustuvad rekombinantsed viirused, mis on võimelised terapeutiliset geeni rakku viima ja seda genoomi lülitama.
Vahel konstrueeritakse geeniteraapia tarbeks ka pseudotüpeeritud viirusi, mis suurendavad või vähendavad sihtmärkrakkude ampluaad. Näiteks populaarseim viirus, mida vektorite tarbeks kasutatakse, on Retroviridae perekonda kuuluv Simia immuunpuudulikkuse viirus, mis on kaetud vesikulaarset stomatiiti põhjustava viiruse G-valkudega.

Retroviirus

Retroviirus kasutab nukleiinhappena RNA-d ning kasutades oma nakatamistsüklis pöörtranskriptaasi, kodeerib see DNA-d. Viiruse kodeeritud DNA seostub stabiilselt sihtmärkraku geneetilise struktuuriga viiruse kodeeritud ligaasi vahendusel. Retroviirus on võimeline nakatama ainult jagunevaid rakke, seega terapeutilise geeni omadused kantakse edasi rakuliini pidi. Kuna retroviirus siseneb peremeesraku geenidesse suvaliselt, suurendab see vähitekke riski. Maksimaalne kogus pärilikkusainet, mida viirusse laadida võib, on 8000 aluspaari.

Retroviirusel põhinevat vektorit ja ühtlasi ka geeniteraapiat rakendati inimese puhul esmakordselt 1990. aastal ADA-SCID ehk adenosiini deaminaasi puudusest põhjustatud ägedat immuunpuudulikkust põdeval patsiendil. Adenosiini deaminaasi defektsuse korral koguneb T-lümfotsüütidesse desoksüadenosiin, mis on T-rakkudele toksiline, seega organismil ei teki immuunvastust ning haiged surevad lapseeas. Inimese ADA-geen klooniti retroviirusel põhinevasse vektorisse ning viidi haige lapse valgeverelibledesse, mis olid organismist eelnevalt eraldatud. Pärast ADA-geeni avaldumise kontrollimist viidi leukotsüüdid organismi tagasi.

2000. aastal rakendati 15 poisslapsel geeniteraapiat X-liitelise SCID vastu. Nende vereloome tüvirakkudesse viidi IL₂Rye-geen. Selline ravimikatsetus osutus edukaks, kuid kahe aasta pärast haigestusid ravitutest kaks leukeemiasse. Neil kahel lapsel toimus seoses retroviiruse integratsiooniga translokatsioon 7. ja 11. kromosoomi vahel. Retroviiruse vektor oli koos terapeutilise geeniga integreerunud LMO2-geeni, mis kontrollib rakkude jagunemist, stimuleerides samuti selle avaldumist. Sellise kaasefekti tõttu keelustati vahepeal USA-s ning mitmes Euroopa riigis retroviirusel põhinev geeniteraapia.

Viirusvektori seostumine rakumembraaniga ja pärilikkusaine toimetamine rakku

Adenoviirus

Adenoviirusvektorite eelis on see, et viiruse DNA, millest haigust tekitav osa on osaliselt kustutatud, suudab mahutada suhteliselt pikka DNA osa ehk umbes 7500 aluspaari. Samuti viivad nad rakkudesse palju viiruse osakesi ja mõjutavad nii puhkavaid kui jagunevaid rakke. Sellegipoolest toodavad nad mitmeid viirusele omaseid valke, mis võivad põhjustada immuunreaktsiooni, mis nii vektorid kui ka nende mõjutatud rakud kiiresti elimineerib. Adenoviirust kasutades ei õnnestu manustamise kordamine, kui esmakordsel vektori manustamisel kaasnes immuunsüsteemi muutus, mis surus maha esmase vastuse adenoviiruse kattevalkude vastu. Seega on adenoviiruste kasutamine geenivektorina ohtlik, kuna see võib patsiendi organismis põhjustada väga tugeva immuunvastuse. Näiteks patsient, kes kannatas ornitiini transkarboksülaasi defektsuse all ja kelle geeniteraapilisel ravil kasutati adenoviiruse vektorit, suri organismi ägeda immuunvastuse tõttu.

Adenoviiruste kaksikahelalist DNA-d ei lülitata sihtmärkraku genoomi, vaid see jääb rakutuumas eraldiseisvaks. Seega terapeutiline geen ei jagune rakkude paljunemisel.

Adenoviirusel arvatakse olevat suur potentsiaal vektorina vähivastases geeniteraapias. 2003. aastal tuli Hiinas turule ravim Gendicine, milles kasutatav p53 tuumorsupressorgeen ravib lamerakulist kartsinoomi.

Adenoassotsieerunud viirus

Adenoassotsieerunud viiruste vektorid kasutavad nukleiinhappena üheahelalist DNA-d, nakatades efektiivselt jagunevaid ja mittejagunevaid rakke. Viiruste vektorid integreeruvad genoomi arvatavasti juhuslikult, kuigi mõned originaalviirused integreeruvad peamiselt 19. kromosoomi teatud piirkonnaga. Seepärast on nende puhul samasugune oht onkogeeni aktiveerimiseks nagu retroviirusvektorite puhul. Adenoassotsieerunud viirusega on võimalik transportida pärilikkusainet suurusega kuni 4500 aluspaari. Seda vektorit on kasutatud peamiselt lihas- ja silmaprobleemide korral.

Alfaviirus

Alfaviirus kasutab nukleiinhappena RNA-d, nakatades jagunevaid ja mittejagunevaid rakke. Maksimaalne kogus pärislikkusainet, mida selle vektoriga transportida saab, on 7500 aluspaari. Alfaviiruste kasutamine geeniteraapias on piiratud, kuna nad suudavad seonduda väheste rakkude retseptoritega ja nende ekspressioon on lühike.

Herpes simplex'i viirus

Herpes simplex'i viirus kasutab nukleiinhappena üheahelalist DNA-d, nakatades nii jagunevaid kui ka mittejagunevaid rakke. Maksimaalne kogus pärilikkusainet, mida selle vektoriga transportida saab, on 30 000 aluspaari. Seda viirust on kasutatud vektorina glioomi, melanoomi ja munasarjavähiga patsientidel. Kuna herpesviirus on neurotroofiline, siis kasutatakse herpesviirusel põhinevaid vektoreid kõige enam terapeutilise geeni saatmiseks pea- ja seljaajju. Herpesviirus on väga transgeenne ning selle põhjal konstrueeritud vektorid võimaldavad pikka terapeutilise geeni püsimist organismis.

Vaktsiiniaviirus

Vaktsiiniaviirus kasutab nukleiinhappena kaheahelalist DNA-d. Maksimaalne kogus vaktsiiniaviirusega transporditavat pärislikkusainet on 25 000 aluspaari. Vaktsiiniaviirus ei integreeru sihtmärkraku genoomi, vaid replitseerub täielikult raku tsütoplasmas.

Mitteviiruslikud vektorid

Mitteviiruslike vektorite korral sisestatakse terapeutiline geen rakku füüsilisel või elektrokeemilisel teel. Võrreldes viiruslike vektoritega on mitteviiruslikud vektorid odavamad, neid on lihtsam toota ja need on vähem patogeensed. Lisaks võimaldavad mitteviiruslikud vektorid transportida suuremat kogust pärislikkusainet. Mitteviiruslike vektorite populaarsust pärsib nende väiksem efektiivsus võrreldes viirusvektoritega.

Füüsilised meetodid

Füüsiliste meetodite puhul rakumembraanid lõhutakse ja terapeutiline geen sisestatakse füüsiliselt sihtrakku. Peamised geeniteraapias kasutatavad füüsilised meetodid on geeni süstimine sihtrakku või veresoonde, ballistiline DNA, elektroporatsioon, sonoporatsioon, fotoporatsioon, magnetofektsioon ja 

hüdroporatsioon.

Geenide süstimine

Terapeutilise geeni süstimine üksikusse keharakku või veresoonde on ohutuim meetod geeni ülekandmiseks. Teisest küljest pärsib selle meetodi populaarsust väike efektiivsus. Organismi immuunsüsteem elimineerib katmata eksogeense geeni kiiresti. Näiteks eksgeense plasmiidi poolestusaeg hiire organismis on 10 minutit, mis pole geenide avaldumiseks reeglina piisav. Seda meetodit on enim kasutatud naha-, südame- ja maksaprobleemide korral.

Ballistiline DNA

Ballistilise DNA meetod põhineb kulla- või hõbedaosakestega kaetud DNA tulistamisel geenipüssiga kõrge rõhu all sihtmärkrakku. See meetod võeti kasutusele 1980-ndate keskel ning kasutati esialgu markergeeni transportimiseks taimekudedesse. Seda meetodit kasutatakse munasarjavähi puhul.

Elektroporatsioon

Elektroporatsiooni korral tõstavad elektroporaatorid raku plasmamembraani elektrijuhtivust. Elektriline impulss tekitab plasmamembraanis ajutisi poore, mille kaudu saab terapeutiline geen rakku siseneda. Seda meetodit kasutatakse eelkõige naha- ja lihaskudede korral. Elektroporatsiooni negatiivseteks külgedeks on liiga suurte koekahjustuste tekitamine ning samuti ei pääse elektroodidega, millega rakumembraan lõhutakse, paljudele siseelunditele juurde.

Sono- ja fotoporatsioon

Sonoporatsioon on mitteinvasiivne kohtspetsiifiline meetod, mis kasutab ultrahelilaineid, mis augustavad rakumembraani, et geen saaks rakku pääseda. Fotoporatsiooni korral kasutatakse rakumembraani augustamiseks laserimpulssi.

Magnetofektsioon

Magnetofektsiooni korral seostatakse terapeutiline geen magnetiseeruvate nanoosakestega, mis sisestatakse tugeva magnetvälja toimel rakku. Magnetofektsioon on organismile ohutu, kuid vastava meetodi kasutamisel tuleb geeniteraapiat pidevalt korrata, kuna terapeutiline geen ei integreeru raku genoomi.

Hüdroporatsioon

Hüdroporatsiooni kutsutakse ka hüdrodünaamiliseks geeniülekandeks. See meetod kasutab hüdrodünaamilist rõhku läbimaks rakumembraani. Suure DNA kontsentratsiooniga lahuse süstimisel rakku luuakse hüdrodünaamiline surve, mille tulemusena tekib rakumembraanil juurde poore, mis hõlbustavad geeni levikut organismis ja seekaudu geeni jõudmist sihtmärkrakku.

Keemilised meetodid

Keemilised meetodid terapeutilise geeni sihtmärkrakku transportimiseks jagunevad anorgaanilisteks, lipiidseteks, valgulisteks ja polümeerseteks kandjateks. Selliste kandjate ülesanne on seostuda rakumembraaniga ning kaitsta terapeutilist geeni raku kaitsemehhanismide eest.

Anorgaanilised kandjad

Terapeutilised geenid kaetakse anorgaaniliste nanoosakestega, näiteks kaltsiumfosfaadi, kulla või räniga, mis tõhustavad terapeutilise geeni jõudmist sihtmärkrakku, madaldades organismi kaitsereaktsioonide mõju. Näiteks kullaosakestega kaetud geen, mis infrapunakiirguse mõjul rakumembraani läbib, on organismile vähem toksiline kui lipopleksid. Samas pole anorgaanilised kandjad biolagunevad, seega nad kuhjuvad rakkudesse ja pärsivad nende funktsiooni.

Oligonukleotiidid

Oligonukleotiidide ülesandeks geeniteraapias on pärssida pärilikku haigust põhjustava geeni avaldumist. Selle saavutamiseks eksisteerib mitmeid mehhanisme. Üheks võimaluseks on vigase geeni antisenss-spetsiifilisuse kasutamine, mis inhibeerib selle ekspressiooni. Võimalik on ka siRNA-de seostumine vigasele mRNA-le, mis pärsib valgusünteesi. Lisaks eelnenutele on väljatöötamisel kaheahelalised oligodeoksünukleotiidid. Ideaalis seonduksid transkriptsioonifaktorid vigase geeni promootori asemel vastavatele oligonukleotiididele, mis vähendaks sihtmärkgeeni avaldumist.

Lipoplekssed ühendid

Lipopleksne ühend koosneb lipiidist, millesse on pakitud geen. Lipiidil on positiivselt laetud hüdrofiilne pea ja hüdrofoobne saba. Lipiidi positiivselt laetud peaosa seostub elektrostaatilise interaktsiooni kaudu negatiivselt laetud geeniga, moodustades lipoplekse ühendi. Kuna lipopleks on positiivselt laetud, seostub see rakumembraanil olevate negatiivselt laetud glükoproteiinide ja proteoglükaanidega ning siseneb rakku. Lipiidikiht geeni ümber kaitseb geeni raku kaitsemehhanismide eest, kuid lipiidikihi laeng vähendab kaitse kestvust.

Rakku sisenevad peptiidid

Rakku sisenevad peptiidid on väikesed, sisaldades alla 40 aminohappejäägi. Need peptiidid on enamasti pärit viirusvalkudelt, mis tungivad rakku, seostudes mitmete rakumembraanivalkudega. Lisades lipiidsetele kandjatele kindlaid aminohappelisi järjestusi, võib kandja seonduda spetsiifiliselt mõne teatud organelliga.

Polümeersed kandjad

Kitosaan

Kitosaan on lineaarne katioonne polüsahhariid, mis on eraldatud krabidest ja krevettidest. Selle biolaguneva polümeeri toimeks on seostumine foolhappega ning on kahjutu ka suurte kontsentratsioonide juures.

Dendrimeerid

Dendrimeerid on korrapärase hargnenud struktuuriga positiivse pinnalaenguga polümeerid, mis läbivad endotsütoosi teel hõlpsalt rakumembraani. Dendrimeer seostub geeniga oma positiivse pinnalaengu tõttu füsioloogilise pH juures. Dendrimeeride laialdasemat kasutamist pärsib nende liigne spetsiifilisus seostumaks rakumembraanidega ja toksilisus.

Želatiin

Želatiin on looduslik biolagunev polümeer, mida kasutatakse laialdaselt farmaatsia- ja meditsiinivaldkonnas. See ühend koosneb denatureerunud kollageenist, millel on unikaalne aminohappeline sisaldus. Positiivse laenguga želatiin saadakse etüleendiamiini sisestamisel želatiini karboksüülrühma. Želatiini kasutamine geenivektorina on inimesele ohutu.

Hüaluroonhape

Hüaluroonhape on looduslik biolagunev polümeer, mis suudab sünteetilistest polümeeridest edukamalt terapeutilist geeni läbi rakumembraani transportida. Hüaluroonhapet kasutatakse sarv- ja võrkkestaprobleemide korral.

Restriktaasid

Restriktaasid (sait-spetsiifilised endonukleaasid) on ensüümid, mis lõikavad DNA-ahelat kindlate nukleotiidsete järjestuste juurest. Selliseid spetsiifilisi järjestusi nimetatakse restriktsioonisaitideks.

Restriktaase on leitud bakteritest ja arhedest, kus need kaitsevad rakku sissetungivate viiruste eest. Prokarüootides lõikavad restriktaasid vaid võõrast DNA-d, raku enda DNA-d kaitseb restriktaasi eest metülaas, metüleerides A ja C nukleotiidid. Sellist kaitsemehhanismi nimetatakse restriktsiooni-modifikatsiooni süsteemiks.

Praeguseks on põhjalikult uuritud üle 3000 restriktaasi ja neist ligikaudu 600 kasutatakse igapäevaselt laborites, et DNA-d modifitseerida ja manipuleerida.

Ajalugu

Esimene bakteritest isoleeritud restriktaas oli HindII. See eraldati 1970. aastal bakterist Haemophilus influenzae. Selle ja veel mitme restriktaasi avastamise eest anti 1978. aastal Nobeli füsioloogia- või meditsiiniauhind kolmele teadlasele: Daniel Nathans, Werner Arber ja Hamilton O. Smith. Nende avastus pani aluse rekombinantse DNA tehnoloogia arengule, millel on väga palju kasutusalasid, näiteks saab selle tehnoloogia abil kasutada E. coli baktereid kiireks ja suuremahuliseks insuliini tootmiseks.

Restriktsioonisait

Palindroomse ala järjestus on mõlemal ahelal sama, kui lugeda nukleotiide mõlemal ahelal samasuunaliselt (5’ otsast 3’ otsa).

Restriktaasid tunnevad ära teatud nukleotiidse järjestuse ja lõikavad läbi DNA kaksikheeliksi mõlemad ahelad. Restriktsioonisaidis on enamasti 4–8 nukleotiidi ja tihti on see palindroomne, mis tähendab, et nukleotiidide järjestus on mõlemat pidi lugedes sama. DNA-l on kaks palindroomse järjestuse võimalust. Peegelpalindroom (ingl mirror-like palindrome) on sarnane palindroomidega, mis esinevad keeles, näiteks "udu". DNA-järjestuses on peegelpalindroom näiteks GTAATG. Pöördkorduv palindroom (ingl inverted repeat palindrome) on samuti mõlemat pidi samasugune, kuid palindroom esineb komplementaarsetes DNA-ahelates, näiteks järjestuse GTATAC puhul, millele komplementaarne järjestus on CATATG. Pöördkorduvad palindroomid esinevad sagedamini ja omavad suuremat tähtsust kui peegelpalindroomid. Palindroomid võivad ahelates tekitada "volte", kus osa ahelast jääb U-kujuliselt üheahelaliseks.

EcoRI restriktaas jätab lõigates kleepuvad otsad:

SmaI restriktaas jätab lõigates tömbid otsad:

Äratundmisjärjestus on restriktaasidel erinev, mistõttu tekivad lõigates eri pikkusega kleepuvad otsad. Need võivad asuda nii peaahelal kui komplementaarsel ahelal.

Restriktaase, mis tunnevad ära sama järjestuse, kuid lõikavad erinevatest kohtadest, nimetatakse neoskisomeerideks. Ensüüme, mis tunnevad ära sama järjestuse ja ka lõikavad samade nukleotiidide vahelt, nimetatakse isoskisomeerideks.

Tüübid

Restriktaasid jagatakse nelja gruppi (I, II, III ja IV tüüpi) nende struktuuri, vajaliku kofaktori, äratundmisjärjestuse ja restriktsioonisaidi järgi. Kõik restriktaasid tunnevad ära kindla järjestuse ja teevad endonukleolüütilise lõike sellisel viisil, et tekiksid kindla järjestusega 5’ ja 3’ otsad. Nende eristamistunnused on järgnevad:

• I tüüpi ensüümide (EC 3.1.21.3) restriktsioonisait asub äratundmisjärjestusest eemal. Need vajavad funktsioneerimiseks nii ATP-d kui S-adenosüülmetioniini. On multifunktsionaalsed valgud, millel on nii restriktsiooni kui metülaasi (EC 2.1.1.72) ülesanded.
• II tüüpi ensüümide (EC 3.1.21.4) restriktsioonisait asub äratundmisjärjestuse sees või selle lähedal. Enamik neist vajavad magneesiumi. Need on vaid restriktsioonifunktsiooniga metülaasist sõltumatud valgud.
• III tüüpi ensüümide (EC 3.1.21.5) restriktsioonisait asub äratundmisjärjestuse lähedal. Need vajavad ATP-d (kuid ei hüdrolüüsi seda). S-adenosüülmetioniin stimuleerib reaktsiooni, kuid ei ole vajalik selle toimumiseks. Esineb osana suuremast valgust koos modifitseeriva metülaasiga (EC 2.1.1.72).
• IV tüüpi ensüümid seonduvad modifitseeritud (näiteks metüleeritud, hüdroksümetüleeritud või glükosüül-hüdroksümetüleeritud) DNA-ga. Need on bakteri viimase järgu kaitseensüümid.

I tüüp

I tüüpi restriktaasid olid esimesed, mis avastati ja mille omadusi iseloomustati. Need isoleeriti E. coli bakterist. I tüüpi restriktaaside restriktsioonisait erineb ja on vähemalt 1000 aluspaari kaugusel nende äratundmisjärjestusest. Lõikamine järgneb DNA translokatsioonile, mis tähendab, et need ensüümid on ka molekulaarmootorid. Äratundmisjärjestus on asümmeetriline ja koosneb kahest osast: ühes 3–4 nukleotiidi, teises 4–5 nukleotiidi. Neid eraldab mittespetsiifiline 6–8 nukleotiidi pikkune vaheala. Sellised ensüümid on multifunktsionaalsed ning on sõltuvalt DNA metüleeritusest võimelised nii restriktsiooniks kui modifitseerimiseks. Täielikuks aktiivsuseks on neil vaja kofaktoreid S-adenosüülmetioniini, hüdrolüüsitud ATP-d ja magneesiumiioone (Mg²⁺). I tüüpi restriktaasidel on 3 allüksust: HsdR, HsdM ja HsdS. HsdR on vajalik restriktsiooniks, HsdM on vajalik DNA metüleerimiseks ja HsdS on vajalik nii mõlemaks eelnevaks ülesandeks kui ka DNA-ga seondumiseks.

II tüüp

"Eco"RI restriktaasi struktuur (roheline ja sinine ala). Ensüüm seondub DNA kaksikheeliksi (pruun ala) külge. Ensüümi lõikamiskohale liitub kaks magneesiumi iooni (üks mõlemale monomeerile), mis tekitavad lünga DNA struktuuris

II tüüpi restriktaasid erinevad I tüüpi restriktaasidest mitmel moel. Need moodustavad homodimeere, mille äratundmisjärjestused on enamasti lahutamata palindroomid, mis on 4–8 nukleotiidi pikad. DNA-d lõikavad need sama koha pealt, kuhu seonduvad, ning ei vaja kofaktorina ATP-d ega S-adenosüülmetioniini, vaid ainult Mg²⁺ iooni. Selle rühma ensüüme kasutatakse enim ja need on teaduslaborites laialt levinud. 1990. aastatel ja 2000. aastate alguses leiti sellest klassist uusi ensüüme, mis ei vastanud täpselt eelpool mainitud tingimustele. Seetõttu loodi alamklassid, kuhu jaotada ensüüme vastavalt nende erinevustele rühma põhitüübist. Alamklassidele on lisatud järelliide.

IIB tüüpi restriktaasid (nt BcgI ja BplI) on multimeerid, mis tähendab, et need koosnevad rohkem kui ühest allüksusest. IIB tüüpi restriktaasid lõikavad ahela läbi mõlemalt poolt äratundmisjärjestust, lõigates kogu seondumisala ahelast välja. Need vajavad kofaktoritena S-adenosüülmetioniini ja Mg²⁺-ioone.

IIE tüüpi restriktaasid (nt NaeI) seonduvad oma äratundmisjärjestusega kahes kohas. Üks neist on replikatsioonisait, teist ala kasutab ensüüm allosteerilise aktivaatorina, mis kiirendab DNA lõikamist.

IIF tüüpi restriktaasid (nt NgoMIV) toimivad sarnaselt IIE tüüpi restriktaasidega, kuid lõikavad DNA järjestuse mõlemast seondumisalast korraga.

IIG tüüpi restriktaasidel (nt Eco57I) on sarnaselt II tüüpi restriktaasidega üks allüksus, kuid need vajavad kofaktorina S-adenosüülmetioniini.

IIM tüüpi restriktaasid (nt DpnI) tunnevad ära ja lõikavad metüleeritud DNA-d.

IIS tüüpi restriktaasid (nt FokI) lõikavad DNA-d kindla nukleotiidse järjestuse kauguselt oma äratundmisjärjestusest, mis on asümmeetriline ja mittepalindroomne. Need ensüümid võivad funktsioneerida dimeeridena.

IIT tüüpi restriktaasid (nt Bpu10I ja BslI) koosnevad kahest erinevast allüksusest. Mõned selle alamklassi ensüümid seonduvad palindroomse järjestusega, teised asümmeetrilise järjestusega.

III tüüp

III tüüpi restriktaasidel (nt EcoP15) on kaks erinevat mittepalindroomset äratundmisjärjestust, mis on vastassuunalised. Ensüüm lõikab DNA-ahela läbi 20–30 aluspaari kauguselt seondumisalast. Nendel ensüümidel on mitu allüksust, need täidavad nii metüleerimise kui restriktsiooni ülesannet ning need vajavad S-adenosüülmetioniini ja ATP-d. Selliseid restriktaase kasutavad prokarüoodid selleks, et kaitsta end sissetungiva võõra DNA eest. III tüüpi restriktaasid on hetero-oligomeersed multifunktsionaalsed valgud, mis koosnevad kahest allüksusest (Res ja Mod). Mod-allüksus tunneb ära spetsiifilise DNA järjestuse ja on DNA modifitseerimiseks vajalik metüültransferaas. Res on vajalik restriktsiooniks, kuid iseseisvalt pole see aktiivne. III tüüpi restriktaasidel on 5–6 aluspaari pikkused asümmeetrilised äratundmisjärjestused ning need lõikavad DNA-ahela läbi 25–27 aluspaari kauguselt pärisuunas, jättes vabaks lühikese üheahelalise üleulatuva 5’ otsa. Selleks, et ensüüm lõikaks, on vaja kaht vastupidise suunaga metüleerimata äratundmisjärjestust. III tüüpi ensüümid metüleerivad adenosüüljäägi N-6-positsioonil ühe DNA-ahela, seega on värskelt replitseeritud DNA-l vaid üks metüleeritud ahel, kuid see on piisav, et kaitsta seda uue restriktsiooni eest.

Tehislikud restriktaasid

Tehislikke restriktaase valmistatakse, liites looduslikke või tehislikke DNA seondumisdomeene nukleaasdomeenidega (selleks on sageli IIS tüüpi restriktaasi FokI-i restriktsioonidomeen). Sünteetilised restriktaasid suudavad ära tunda suuri saite (kuni 36 aluspaari) ja neid võib panna seonduma mis tahes DNA-järjestusega. Tsinksõrmnukleaasid on geenitehnoloogias enim kasutatavad tehislikud restriktaasid.

Näited

Näiteid restriktaasidest:

Ensüüm	Allikas	Spetsiifiline järjestus	Lõige
EcoRI	Escherichia coli	5'GAATTC 3'CTTAAG	5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5'
EcoRII	Escherichia coli	5'CCWGG 3'GGWCC	5'--- CCWGG---3' 3'---GGWCC ---5'
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens	5'GGATCC 3'CCTAGG	5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5'
HindIII	Haemophilus influenzae	5'AAGCTT 3'TTCGAA	5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5'
TaqI	Thermus aquaticus	5'TCGA 3'AGCT	5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5'
NotI	Nocardia otitidis	5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG	5'---GC GGCCGC---3' 3'---CGCCGG CG---5'
HinfI	Haemophilus influenzae	5'GANTCA 3'CTNAGT	5'---G ANTC---3' 3'---CTNA G---5'
Sau3A	Staphylococcus aureus	5'GATC 3'CTAG	5'--- GATC---3' 3'---CTAG ---5'
PvuII*	Proteus vulgaris	5'CAGCTG 3'GTCGAC	5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5'
SmaI*	Serratia marcescens	5'CCCGGG 3'GGGCCC	5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5'
HaeIII*	Haemophilus aegyptius	5'GGCC 3'CCGG	5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5'
HgaI	Haemophilus gallinarum	5'GACGC 3'CTGCG	5'---NN NN---3' 3'---NN NN---5'
AluI*	Arthrobacter luteus	5'AGCT 3'TCGA	5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5'
EcoRV*	Escherichia coli	5'GATATC 3'CTATAG	5'---GAT ATC---3' 3'---CTA TAG---5'
EcoP15I	Escherichia coli	5'CAGCAGN25NN 3'GTCGTCN25NN	5'---CAGCAGN25NN ---3' 3'---GTCGTCN25 NN---5'
KpnI	Klebsiella pneumoniae	5'GGTACC 3'CCATGG	5'---GGTAC C---3' 3'---C CATGG---5'
PstI	Providencia stuartii	5'CTGCAG 3'GACGTC	5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5'
SacI	Streptomyces achromogenes	5'GAGCTC 3'CTCGAG	5'---GAGCT C---3' 3'---C TCGAG---5'
SalI	Streptomyces albus	5'GTCGAC 3'CAGCTG	5'---G TCGAC---3' 3'---CAGCT G---5'
ScaI	Streptomyces caespitosus	5'AGTACT 3'TCATGA	5'---AGT ACT---3' 3'---TCA TGA---5'
SpeI	Sphaerotilus natans	5'ACTAGT 3'TGATCA	5'---A CTAGT---3' 3'---TGATC A---5'
SphI	Streptomyces phaeochromogenes	5'GCATGC 3'CGTACG	5'---GCATG C---3' 3'---C GTACG---5'
StuI	Streptomyces tubercidicus	5'AGGCCT 3'TCCGGA	5'---AGG CCT---3' 3'---TCC GGA---5'
XbaI	Xanthomonas badrii	5'TCTAGA 3'AGATCT	5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5'

Tähistused:

* = tömp ots
N = C või G või T või A
W = A või T

Pöördtranskriptaas

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

Pöördtranskriptaas on ensüüm, mille abil sünteesitakse RNA matriitsahelalt komplementaarne DNA (cDNA) ahel. Seda protsessi nimetatakse pöördtranskriptsiooniks ning valdavalt seostatakse seda retroviirustega. Lisaks retroviirustele kasutavad pöördtranskriptaasi ka mõned teised viirused, näiteks B-hepatiidi viirus, mis kuulub sugukonda Hepadnaviridae. Sellepärast on pöördtranskriptaasi inhibeerivad ühendid laialdaselt kasutusel antiretroviraalsete ravimitena. Pöördtranskriptaasi on seostatud ka kromosoomide otsade ehk telomeeride replikatsiooni protsessiga ning osade mobiilsete geneetiliste elementidega (retrotransposoonid).

Pöördtranskriptsiooni kasutatakse laialdaselt molekulaarses kloneerimises RNA-lt DNA saamiseks, RNA sekveneerimises, polümeraasi ahelreaktsioonis (PCR) või genoomses analüüsis.

Enim uuritud pöördtranskriptaasid:

• HIV-1 pöördtranksriptaas, mis on pärit inimese immuunpuudulikkuse tüüp 1 viiruselt ning koosneb kahest subühikust molekulmassidega 66 kDA ja 51 kDa.
• M-MLV pöördtranskriptaas Moloney hiire leukeemia viirusest, mis esineb üksiku 75 kDa-lise monomeerina.
• AMV pöördtranskriptaas linnu müeloblastoosi viirusest, mis koosneb samuti kahest subühikust,molekulmassidega 63 kDa ja 95 kDa.
• Telomeraasi pöördtranskriptaas, mis säilitab telomeere replikatsiooni käigus.

Sisukord

AjaluguRedigeeri

Pöördtranskriptaasi avastas Howard Temin Wisconsini ülikoolis respiratoor-süntsütiaalse viiruse (RSV) virionidest ning David Baltimore isoleeris selle 1970. aastal kahest RNA kasvajaviirusest: R-MLV ja samuti RSV. Nende saavutuste eest anti neile 1975. aastal ühine Nobeli auhind füsioloogia või meditsiini kategoorias (koos Renato Dulbeccoga). Alguses oli idee pöördtranskriptsioonist väga ebapopulaarne, kuna see oli vastuolus molekulaarbioloogia keskse dogmaga, mis väidab, et DNA-d transkribeeritakse RNA-ks ning seda omakorda valguks. Alles pärast pöördtranskriptaasi avastamist hakati aktsepteerima ideed, et geneetilist informatsiooni on võimalik üle kanda ka RNA-lt DNA-le.

Pöördtranskriptaas viirustesRedigeeri

Pöördtranskriptaasi kasutavad viirused replikatsioonil. Pöördtranskribeerivad RNA-viirused (näiteks HI-viirus) kasutavad ensüümi, et pöördtranskribeerida oma RNA genoom DNA-ks. Saadud DNA on võimalik seejärel integreerida peremeesorganismi genoomi ning läbi selle saab viirus enda genoomi replitseerida. Pöördtranskribeerides DNA-viiruseid, näiteks hepadnaviirust, on võimalik kasutada saadud RNA-d matriitsahelana uute DNA ahelate kokkupanemisel. Pöördtranskriptaasi puudumisel ei oleks viirused võimelised enda genoomi replitseerima.

Pöördtranskriptsiooni protsessRedigeeri

Pöördtranskriptaas kasutab RNA matriitsahelat, et sünteesida kaheahelaline DNA. Viirustes, kus pöördtranskriptaasil on puudu DNA-sõltuv DNA polümeraasne aktiivsus, on võimalus, et kaheahelalist DNA-d sünteesitakse peremeesorganismi kodeeritud DNA polümeraas δ abil. Polümeraas tuvastab ekslikult viraalse DNA-RNA kui praimeri ning sünteesib kaheahelalise DNA samal mehhanismil nagu praimeri eemaldamiselgi, kus uus sünteesitud ahel vahetab välja algse RNA matriitsahela. Pöördtranskriptsiooni puhul on vigade ehk mutatsioonide tekkimise tõenäosus suur. Need mutatsoonid võivad põhjustada ravimiresistentsust.

Retroviiruste pöördtranskriptsioonRedigeeri

Retroviirused kasutavad pöördtranskriptaasi üheahelalise genoomse RNA transkribeerimiseks kaheahelaliseks cDNA-ks, et see integreerida peremeesgenoomi. Nende genoom koosneb kahest positiivse laenguga üheahelalisest RNA molekulist (ss-RNA ehk single-stranded RNA), millel on 5’-cap ja 3’-polüadenenüleeritud saba. Retroviirusteks on näiteks inimese immuunpuudulikkuse viirus (HIV) ja inimese T-lümfotroopne viirus (HTLV). Kaheahelalise DNA süntees toimub tsütosoolis järgmiste protsesside tulemusena:

Pöördtranskriptsiooni mehhanism VI klassi ssRNA-RT HI-viiruses

1. Spetsiifiline tRNA käitub kui praimer ning hübridiseerub viiruse RNA genoomi komplementaarsesse piirkonda, mida kutsutakse praimeri seondumisala (PBS ehk primer binding site).
2. Seejärel lisab pöördtranskriptaas praimeri 3' otsa DNA nukleotiide, sünteesides nii DNA, mis on komplementaarne RNA U5 (mittekodeeriv ala) ja R regiooniga (otsene kordusjärjestus RNA molekuli mõlemas otsas).
3. Pöördtranskriptaasil on domeen nimega RNaas H, mis lagundab U5 JA R regiooni RNA 5’-otsas.
4. Praimer seob viraalse genoomi 3’-otsa ning äsja sünteesitud DNA ahelad hübridiseeruvad RNA komplementaarse R regiooniga.
5. Sünteesitud komplementaarne DNA (cDNA) pikendatakse ning enamus viraalsest RNA-st lagundatakse RNaas H abil.
6. Lagundamata viraalne RNA toimib praimerina DNA teise ahela sünteesil.
7. Toimub "hüpe", kus teiselt ahela PBS hübridiseerub esimese ahela komplementaarse PBS-järjestusega.
8. Mõlemad ahelad pikendatakse, et moodustada täielik kaksikahelaline DNA, mida on võimalik integraasi abil integreerida peremeesorganismi genoomi.

Kaheahelalise DNA sünteesi käigus toimub ka ahela ülekanne, mil lühike DNA (algse RNA-sõltuva DNA sünteesi produkt) translokeerub aktseptor-regiooni genoomi teises otsas. Pöördtranskriptaas töötleb seda ala hiljem tänu oma DNA-sõltuvale DNA aktiivsusele. Retroviraalse RNA praimeri seondumise ala PBS regiooni 5' otsas asub U5 ning sellest 3' otsas paikneb "juhtiv" ala. tRNA praimer on 14. ja 22. nukleotiidi vahel lahti harutatud ning moodustab viraalse RNA PBS regiooni aluspaaridega dupleksi. PBS paiknemine viraalse RNA 5’-otsa lähedal on ebatavaline, kuna pöördtranskriptaas sünteesib DNA-d praimeri 3’-otsast 5’-3’-suunas (vaadeldes RNA matriitsi). Seega praimer ja pöördtranksriptaas peavad ümber paiknema viraalse RNA 3’-otsa. Nende ümberpaigutumine hõlmab mitut etappi ja kasutab mitmeid ensüüme, sealhulgas DNA polümeraas, ribonukleaas H (RNaas H) ja vajalik on polünukleotiidide lahti keerdumine.

HI-viiruse pöördtranskriptaas omab samuti ribonukleaasset aktiivsust, mis lagundab cDNA sünteesi käigus viraalse RNA. Lisaks on HIV pöördtranskriptaasil DNA-sõltuv DNA polümeraasne aktiivsus, mis kopeerib cDNA senssahela antisenss-DNA ahelaks, et sünteesida kaheahelaline viraalse DNA vaheühend vDNA.

Kloneerimisvektor

Molekulaarbioloogias mõistetakse kloneerimisvektori all ümberkorraldatud DNA molekuli, mille abil saab biotehnoloogilistel eesmärkidel transportida võõraid DNA lõike rakku. Kloneerimisvektorite abil saab uurida geenide funktsioone ja toota valke tööstuslikel eesmärkidel. Vektorit, mis sisaldab võõrast uuritavat DNA-d, nimetatakse rekombinantseks DNA-ks.

Joonis plasmiidsest vektorist pBluescript II KS

Viis tähtsaimat vektorit on plasmiidid, bakteriofaagid, kosmiidid, süstikvektorid ja kunstlikud kromosoomid, millest on enim kasutatud plasmiidid. Igal vektoril on kloneerimiseks vajalikud regioonid: multikloneerimisjärjestus, selektiivsusmarker, reportergeenid ja replikatsiooni alguspunktid.

Terminoloogia

Selektiivsusmarker

Selektiivsusmarker on kloneerimisvektoris olev geen (tavaliselt antibiootikumiresistentsust määrav geen), mis tagab peremeesraku kasvu kindlal söötmel. Kui näiteks vektoril on mõne penitsilliini resistentsusgeen, siis saab selle vektoriga rakk kasvada söötmel, millele on lisatud penitsilliini. Sellega tehakse kindlaks, et rakku on sisenenud õige vektor.

Reportergeenid

Tihti võib leida vektoritel reportergeene. Nende kaudu saab vektori olemasolu testida. Nende geenide katkestamine toob esile fenotüübilise muudatuse ja paljudel juhtudel sisestatakse uuritav DNA just reportergeeni sisse. Reportergeenis asub ka multikloneerimisjärjestus, mis lubab teha sinna lõikeid võõra DNA sisestamiseks.

Üheks reportergeeniks plasmiidses vektoris pBluescript II KS on lacZ geen, mille katkestamisel ei sünteesita enam β-galaktosidaasi. Kui söötmes on ühendit X-gal, siis katkestamata geeniga bakterikolooniad muutuvad siniseks ja katkestatud geeniga kolooniad valgeks. Selline värvil põhinev testsüsteem on sisenenud vektori kindlakstegemiseke tõhus viis.

Multikloneerimisjärjestus

Multikloneerimise asukoht on regioon vektoril, kuhu saab teha lõikeid uuritava geeni sisestamiseks. Tavaliselt on selleks regiooniks reportergeen, mille lõikamisel katkestatakse geeni funktsioon, mille järel on näha fenotüüpilisi muudatusi kolooniates. Lõigete tegemiseks kasutatakse restriktsiooniensüüme ja pärast vektori lahtilõikamist saab sisestada sinna uuritava geeni DNA ligeerimisega.

Replikatsiooni alguspunkt

Replikatsioon alguspunkt on selline piirkond vektoris, kust replikatsioon saab alata. Kloneerimisvektoris ei ole tavaliselt geene, mis tagaksid replikatsiooni. Selle eest vastutab bakteriraku kromosomaalne DNA, mis sünteesib vajalikke valke plasmiidi replikatsiooniks. See tagab uuritava geeni ekspressiooni vektoris.

Vektorid

Plasmiidid

Plasmiidid on kromosoomivälised, isereplitseeruvad DNA rõngasmolekulid bakteriraku sees, mis sisaldavad kasulikke geene peremeesrakule ja geene, mis lubavad sel säilida raku sees. Kui plasmiid aga bakterirakule kasulik ei ole, püüab bakter sellest loobuda ja selle tõttu on laborites kasvavad bakterid tavaliselt vähem elujõulised kui looduses elavad bakterid. Bakteriraku plasmiid ei ole automaatselt vektor. Selleks, et plasmiidist saaks vektor, tuleb seda laboritingimustes muuta. Plasmiidsete vektorite suurus võib varieeruda alates 1000 aluspaarist kuni 200 000 aluspaarini. Paljud plasmiidid sisaldavad antibiootikumiresistentsuse geene, mis on ideaalsed selektiivsusmarkerid.

Bakteriofaagid

Enamik viiruse vektoreid on sünteesitud lambda-nimelise bakteriofaagi kromosoomist. Viiruse genoomi saab lõigata lahti restriktsiooni ensüümidega ja seejärel in vitro sisestada sinna uuritav geen. Viirus siseneb seejärel rakku ja eraldab sinna oma vektori (viiruse genoomi, kuhu on sisse viidud uuritav geen), kust saab alata kloneerimine. Kloneerimise saaduse alusel saab teha edasisi uuringuid.

Kosmiidid

Kosmiidid on kunstlikult sünteesitud vektorid, millel on nii bakteriofaagi kui ka plasmiidi omadusi. Kosmiidid arendati välja suurte geenide (rohkem kui 150 000 aluspaari) kloneerimiseks, kuna plasmiidides ega viiruse vektorites nii suuri geene kloneerida ei saa. Kosmiididel on nii plasmiidide isereplitseerumise mehhanismid kui ka viiruse vektorite in vitro geeni sisestamise võimalusi.

Süstikvektorid

Kui plasmiidid, bakteriofaagid ja kosmiidid suudavad replitseeruda ainult bakterites, siis süstikvektorid on kunstlikult sünteesitud kloneermisvektorid, mis töötavad nii eükarüootsetes kui ka prokarüootsetes organismides. Süstikvekorid on väga kasulikud bakterite ja loomariigi vahelisteks geneetilisteks uuringuteks.

Kunstlikud kromosoomid

Uurtava DNA fragmendi sisestamine BAC vektorisse

Kunstlikud kromosoomid on välja töötatud samuti väga suurte DNA regioonide uurimiseks. YAC (yeast artificial chromosomes) vektorid suudavad kanda endas kuni poole miljoni aluspaari suuruseid DNA segmente. YAC-e on kasutatud ka Inimese Genoomi Projektis, kus oli vaja kaardistada suuri genoomisegmente.

BAC-id (Bacterial artificial chromosomes) on sarnaselt YAC-idele suure DNA hoidmise mahuga. Erinevus on selles, et eükarüootsete organismide asemel kasutatakse neid bakterites.

Vektori kloneerimine

Selleks, et kasutada kloneerimisvektoreid, tuleb eelnevalt läbida mitu protsessi. Iga protsess viiakse läbi in vitro tingimustes ning kasutatakse mitut lahust. Esmalt tuleb uuritav DNA fragment restriktsiooniensüümidega lahti lõigata ja seda fragmenti polümeraasi ahelreaktsiooni meetodil paljundada. Seejärel tuleb lahti lõigata ka vektor ja uuritav geen ning vektor omavahel kokku ligeerida. Valminud rekombinantne DNA viiakse sisse peremeesrakku, kus rakk saab paljuneda koos vektoriga. Viimase etapina eraldatakse vektor ja seda kasutatakse vastavalt vajadusele. Lihtsuse mõttes kirjeldatakse järgnevates alapunktides plasmiidse DNA kloneerimist.

DNA fragmendi lõikamine

Uuritava DNA fragmendi lahtilõikamine algsest genoomist toimub restriktaaside kaudu. Restriktaasid on valgud, mis looduslikult kaitsevad rakke võõra DNA eest, tehes spetsiifilisi katkeid võõrasse sissetungivasse DNA-sse. Sellised restriktaasid tagavad rakule kaitse. Tänapäeval kasutavad restriktsiooniensüüme geneetikud DNA fragmentide kloneerimiseks. Restriktaase on palju ja igaüks neist lõikab ainult ühte kindlat järjestust DNA lõigul. Kui uuritava DNA järjestus on teada, saab ka kindlaks teha kohad, kust DNA-d lõigata, et uuritav lõik eraldada algsest genoomist.

Polümeraasi ahelreaktsioon

Kui uuritav DNA lõik on eraldatud, siis tuleb seda paljundada, et sooritada katseid, mis vajavad rohkem kui ühte DNA fragmenti. Paljundamiseks kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni. See on laialdaselt kasutatav meetod DNA fragmentide paljundamiseks.

DNA ligeerimine

Selleks, et kloneerimisvektorisse uuritav DNA fragment sisestada, peab kõigepealt vektori restriktaasidega multikloneerimisjärjestuse alast lahti lõikama. Kui lahtilõigatud vektor ja uuritav DNA fragment kokku panna, peab need ligeerimisega kokku "kleepima". Selliseks kleepimiseks kasutatakse DNA ligaasi, mis liidab kokku fragmendi ja vektori.

Transformatsioon ja kompetentsed rakud

Protsess, mille käigus rakud võtavad endasse võõra geneetilise materjali, nimetatakse transformatsiooniks. Võõras DNA aga ei saa siseneda rakku ilma rakumembraanis toimuvate muutusteta. Selliseid meetodeid, kus rakumembraan muudetakse võõrale DNA-le vastuvõtlikuks, nimetatakse rakkude kompetentseteks muutmiseks. Laborites kasutatakse selleks tavaliselt rakkude töötlemist kahevalentsete katioonidega, näiteks Ca²⁺ (kaltsiumkloriid CaCl₂). Kaltsiumkloriid laeb rakumembraani pinna positiivselt, mis lubab negatiivselt laetud DNA-l seonduda membraanile. Temperatuuri tõstmisega muudetakse membraan elastseks ja seejärel saab vektor rakku siseneda.

DNA replikatsioon

Selleks, et saada suurel hulgal sünteesitud kloneerimisvektoreid, tuleb rekombinantse DNA-ga rakke paljundada. Kui vektor on sisenenud rakku, hakkab vektor replitseeruma koos rakuga. Kuna kloneerimisvektor on olemuse poolest DNA, siis saab see paljuneda tavalise replikatsioonimehhanismi alusel. Selleks kasutab vektor peremeesraku enda nukleotiide ja polümeraase. Replikatsiooni tulemusena saadakse suur kogus kloneerimisvektoreid, mis on järgneva uurimistöö toormaterjaliks.

Plasmiidse DNA eraldamine bakterirakkudest

Plasmiidse DNA eraldamiseks on vaja algselt suurt kogust rakke. Selleks kasvatatakse plasmiidse DNA-ga rakke söötmes, kus on sees vektori selektiivsusmarkerile vastav antibiootikum. Vedelsöötmel kasvanud rakkudest saab eraldada plasmiidse DNA mitmel meetodil, kuid peamine on aluselise lüüsi meetod. Selle käigus lüüsitakse (purustatakse) rakud ning DNA denatureerub (sulab lahti). Aluselise lüüsi metoodikas kasutatakse pH muutuste mõju DNA-le. Kromosomaalne DNA ei jõua piisavalt kiiresti renatureeruda (tagasi ühineda) ja alles jääb ainult plasmiidne DNA. Seejärel tsentrifuugitakse valgud ja kromosomaalne DNA põhja ning lahusesse jääb ainult plasmiidne DNA. Edasi saab neid vektoreid sisestada teistesse organismidesse ja jälgida, kuidas sünteesitud vektor neid mõjutab.