Restriktaasid

Restriktaasid (sait-spetsiifilised endonukleaasid) on ensüümid, mis lõikavad DNA-ahelat kindlate nukleotiidsete järjestuste juurest. Selliseid spetsiifilisi järjestusi nimetatakse restriktsioonisaitideks.

Restriktaase on leitud bakteritest ja arhedest, kus need kaitsevad rakku sissetungivate viiruste eest. Prokarüootides lõikavad restriktaasid vaid võõrast DNA-d, raku enda DNA-d kaitseb restriktaasi eest metülaas, metüleerides A ja C nukleotiidid. Sellist kaitsemehhanismi nimetatakse restriktsiooni-modifikatsiooni süsteemiks.

Praeguseks on põhjalikult uuritud üle 3000 restriktaasi ja neist ligikaudu 600 kasutatakse igapäevaselt laborites, et DNA-d modifitseerida ja manipuleerida.

Ajalugu

Esimene bakteritest isoleeritud restriktaas oli HindII. See eraldati 1970. aastal bakterist Haemophilus influenzae. Selle ja veel mitme restriktaasi avastamise eest anti 1978. aastal Nobeli füsioloogia- või meditsiiniauhind kolmele teadlasele: Daniel Nathans, Werner Arber ja Hamilton O. Smith. Nende avastus pani aluse rekombinantse DNA tehnoloogia arengule, millel on väga palju kasutusalasid, näiteks saab selle tehnoloogia abil kasutada E. coli baktereid kiireks ja suuremahuliseks insuliini tootmiseks.

Restriktsioonisait

Palindroomse ala järjestus on mõlemal ahelal sama, kui lugeda nukleotiide mõlemal ahelal samasuunaliselt (5’ otsast 3’ otsa).

Restriktaasid tunnevad ära teatud nukleotiidse järjestuse ja lõikavad läbi DNA kaksikheeliksi mõlemad ahelad. Restriktsioonisaidis on enamasti 4–8 nukleotiidi ja tihti on see palindroomne, mis tähendab, et nukleotiidide järjestus on mõlemat pidi lugedes sama. DNA-l on kaks palindroomse järjestuse võimalust. Peegelpalindroom (ingl mirror-like palindrome) on sarnane palindroomidega, mis esinevad keeles, näiteks "udu". DNA-järjestuses on peegelpalindroom näiteks GTAATG. Pöördkorduv palindroom (ingl inverted repeat palindrome) on samuti mõlemat pidi samasugune, kuid palindroom esineb komplementaarsetes DNA-ahelates, näiteks järjestuse GTATAC puhul, millele komplementaarne järjestus on CATATG. Pöördkorduvad palindroomid esinevad sagedamini ja omavad suuremat tähtsust kui peegelpalindroomid. Palindroomid võivad ahelates tekitada "volte", kus osa ahelast jääb U-kujuliselt üheahelaliseks.

EcoRI restriktaas jätab lõigates kleepuvad otsad:

SmaI restriktaas jätab lõigates tömbid otsad:

Äratundmisjärjestus on restriktaasidel erinev, mistõttu tekivad lõigates eri pikkusega kleepuvad otsad. Need võivad asuda nii peaahelal kui komplementaarsel ahelal.

Restriktaase, mis tunnevad ära sama järjestuse, kuid lõikavad erinevatest kohtadest, nimetatakse neoskisomeerideks. Ensüüme, mis tunnevad ära sama järjestuse ja ka lõikavad samade nukleotiidide vahelt, nimetatakse isoskisomeerideks.

Tüübid

Restriktaasid jagatakse nelja gruppi (I, II, III ja IV tüüpi) nende struktuuri, vajaliku kofaktori, äratundmisjärjestuse ja restriktsioonisaidi järgi. Kõik restriktaasid tunnevad ära kindla järjestuse ja teevad endonukleolüütilise lõike sellisel viisil, et tekiksid kindla järjestusega 5’ ja 3’ otsad. Nende eristamistunnused on järgnevad:

• I tüüpi ensüümide (EC 3.1.21.3) restriktsioonisait asub äratundmisjärjestusest eemal. Need vajavad funktsioneerimiseks nii ATP-d kui S-adenosüülmetioniini. On multifunktsionaalsed valgud, millel on nii restriktsiooni kui metülaasi (EC 2.1.1.72) ülesanded.
• II tüüpi ensüümide (EC 3.1.21.4) restriktsioonisait asub äratundmisjärjestuse sees või selle lähedal. Enamik neist vajavad magneesiumi. Need on vaid restriktsioonifunktsiooniga metülaasist sõltumatud valgud.
• III tüüpi ensüümide (EC 3.1.21.5) restriktsioonisait asub äratundmisjärjestuse lähedal. Need vajavad ATP-d (kuid ei hüdrolüüsi seda). S-adenosüülmetioniin stimuleerib reaktsiooni, kuid ei ole vajalik selle toimumiseks. Esineb osana suuremast valgust koos modifitseeriva metülaasiga (EC 2.1.1.72).
• IV tüüpi ensüümid seonduvad modifitseeritud (näiteks metüleeritud, hüdroksümetüleeritud või glükosüül-hüdroksümetüleeritud) DNA-ga. Need on bakteri viimase järgu kaitseensüümid.

I tüüp

I tüüpi restriktaasid olid esimesed, mis avastati ja mille omadusi iseloomustati. Need isoleeriti E. coli bakterist. I tüüpi restriktaaside restriktsioonisait erineb ja on vähemalt 1000 aluspaari kaugusel nende äratundmisjärjestusest. Lõikamine järgneb DNA translokatsioonile, mis tähendab, et need ensüümid on ka molekulaarmootorid. Äratundmisjärjestus on asümmeetriline ja koosneb kahest osast: ühes 3–4 nukleotiidi, teises 4–5 nukleotiidi. Neid eraldab mittespetsiifiline 6–8 nukleotiidi pikkune vaheala. Sellised ensüümid on multifunktsionaalsed ning on sõltuvalt DNA metüleeritusest võimelised nii restriktsiooniks kui modifitseerimiseks. Täielikuks aktiivsuseks on neil vaja kofaktoreid S-adenosüülmetioniini, hüdrolüüsitud ATP-d ja magneesiumiioone (Mg²⁺). I tüüpi restriktaasidel on 3 allüksust: HsdR, HsdM ja HsdS. HsdR on vajalik restriktsiooniks, HsdM on vajalik DNA metüleerimiseks ja HsdS on vajalik nii mõlemaks eelnevaks ülesandeks kui ka DNA-ga seondumiseks.

II tüüp

"Eco"RI restriktaasi struktuur (roheline ja sinine ala). Ensüüm seondub DNA kaksikheeliksi (pruun ala) külge. Ensüümi lõikamiskohale liitub kaks magneesiumi iooni (üks mõlemale monomeerile), mis tekitavad lünga DNA struktuuris

II tüüpi restriktaasid erinevad I tüüpi restriktaasidest mitmel moel. Need moodustavad homodimeere, mille äratundmisjärjestused on enamasti lahutamata palindroomid, mis on 4–8 nukleotiidi pikad. DNA-d lõikavad need sama koha pealt, kuhu seonduvad, ning ei vaja kofaktorina ATP-d ega S-adenosüülmetioniini, vaid ainult Mg²⁺ iooni. Selle rühma ensüüme kasutatakse enim ja need on teaduslaborites laialt levinud. 1990. aastatel ja 2000. aastate alguses leiti sellest klassist uusi ensüüme, mis ei vastanud täpselt eelpool mainitud tingimustele. Seetõttu loodi alamklassid, kuhu jaotada ensüüme vastavalt nende erinevustele rühma põhitüübist. Alamklassidele on lisatud järelliide.

IIB tüüpi restriktaasid (nt BcgI ja BplI) on multimeerid, mis tähendab, et need koosnevad rohkem kui ühest allüksusest. IIB tüüpi restriktaasid lõikavad ahela läbi mõlemalt poolt äratundmisjärjestust, lõigates kogu seondumisala ahelast välja. Need vajavad kofaktoritena S-adenosüülmetioniini ja Mg²⁺-ioone.

IIE tüüpi restriktaasid (nt NaeI) seonduvad oma äratundmisjärjestusega kahes kohas. Üks neist on replikatsioonisait, teist ala kasutab ensüüm allosteerilise aktivaatorina, mis kiirendab DNA lõikamist.

IIF tüüpi restriktaasid (nt NgoMIV) toimivad sarnaselt IIE tüüpi restriktaasidega, kuid lõikavad DNA järjestuse mõlemast seondumisalast korraga.

IIG tüüpi restriktaasidel (nt Eco57I) on sarnaselt II tüüpi restriktaasidega üks allüksus, kuid need vajavad kofaktorina S-adenosüülmetioniini.

IIM tüüpi restriktaasid (nt DpnI) tunnevad ära ja lõikavad metüleeritud DNA-d.

IIS tüüpi restriktaasid (nt FokI) lõikavad DNA-d kindla nukleotiidse järjestuse kauguselt oma äratundmisjärjestusest, mis on asümmeetriline ja mittepalindroomne. Need ensüümid võivad funktsioneerida dimeeridena.

IIT tüüpi restriktaasid (nt Bpu10I ja BslI) koosnevad kahest erinevast allüksusest. Mõned selle alamklassi ensüümid seonduvad palindroomse järjestusega, teised asümmeetrilise järjestusega.

III tüüp

III tüüpi restriktaasidel (nt EcoP15) on kaks erinevat mittepalindroomset äratundmisjärjestust, mis on vastassuunalised. Ensüüm lõikab DNA-ahela läbi 20–30 aluspaari kauguselt seondumisalast. Nendel ensüümidel on mitu allüksust, need täidavad nii metüleerimise kui restriktsiooni ülesannet ning need vajavad S-adenosüülmetioniini ja ATP-d. Selliseid restriktaase kasutavad prokarüoodid selleks, et kaitsta end sissetungiva võõra DNA eest. III tüüpi restriktaasid on hetero-oligomeersed multifunktsionaalsed valgud, mis koosnevad kahest allüksusest (Res ja Mod). Mod-allüksus tunneb ära spetsiifilise DNA järjestuse ja on DNA modifitseerimiseks vajalik metüültransferaas. Res on vajalik restriktsiooniks, kuid iseseisvalt pole see aktiivne. III tüüpi restriktaasidel on 5–6 aluspaari pikkused asümmeetrilised äratundmisjärjestused ning need lõikavad DNA-ahela läbi 25–27 aluspaari kauguselt pärisuunas, jättes vabaks lühikese üheahelalise üleulatuva 5’ otsa. Selleks, et ensüüm lõikaks, on vaja kaht vastupidise suunaga metüleerimata äratundmisjärjestust. III tüüpi ensüümid metüleerivad adenosüüljäägi N-6-positsioonil ühe DNA-ahela, seega on värskelt replitseeritud DNA-l vaid üks metüleeritud ahel, kuid see on piisav, et kaitsta seda uue restriktsiooni eest.

Tehislikud restriktaasid

Tehislikke restriktaase valmistatakse, liites looduslikke või tehislikke DNA seondumisdomeene nukleaasdomeenidega (selleks on sageli IIS tüüpi restriktaasi FokI-i restriktsioonidomeen). Sünteetilised restriktaasid suudavad ära tunda suuri saite (kuni 36 aluspaari) ja neid võib panna seonduma mis tahes DNA-järjestusega. Tsinksõrmnukleaasid on geenitehnoloogias enim kasutatavad tehislikud restriktaasid.

Näited

Näiteid restriktaasidest:

Ensüüm	Allikas	Spetsiifiline järjestus	Lõige
EcoRI	Escherichia coli	5'GAATTC 3'CTTAAG	5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5'
EcoRII	Escherichia coli	5'CCWGG 3'GGWCC	5'--- CCWGG---3' 3'---GGWCC ---5'
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens	5'GGATCC 3'CCTAGG	5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5'
HindIII	Haemophilus influenzae	5'AAGCTT 3'TTCGAA	5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5'
TaqI	Thermus aquaticus	5'TCGA 3'AGCT	5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5'
NotI	Nocardia otitidis	5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG	5'---GC GGCCGC---3' 3'---CGCCGG CG---5'
HinfI	Haemophilus influenzae	5'GANTCA 3'CTNAGT	5'---G ANTC---3' 3'---CTNA G---5'
Sau3A	Staphylococcus aureus	5'GATC 3'CTAG	5'--- GATC---3' 3'---CTAG ---5'
PvuII*	Proteus vulgaris	5'CAGCTG 3'GTCGAC	5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5'
SmaI*	Serratia marcescens	5'CCCGGG 3'GGGCCC	5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5'
HaeIII*	Haemophilus aegyptius	5'GGCC 3'CCGG	5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5'
HgaI	Haemophilus gallinarum	5'GACGC 3'CTGCG	5'---NN NN---3' 3'---NN NN---5'
AluI*	Arthrobacter luteus	5'AGCT 3'TCGA	5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5'
EcoRV*	Escherichia coli	5'GATATC 3'CTATAG	5'---GAT ATC---3' 3'---CTA TAG---5'
EcoP15I	Escherichia coli	5'CAGCAGN25NN 3'GTCGTCN25NN	5'---CAGCAGN25NN ---3' 3'---GTCGTCN25 NN---5'
KpnI	Klebsiella pneumoniae	5'GGTACC 3'CCATGG	5'---GGTAC C---3' 3'---C CATGG---5'
PstI	Providencia stuartii	5'CTGCAG 3'GACGTC	5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5'
SacI	Streptomyces achromogenes	5'GAGCTC 3'CTCGAG	5'---GAGCT C---3' 3'---C TCGAG---5'
SalI	Streptomyces albus	5'GTCGAC 3'CAGCTG	5'---G TCGAC---3' 3'---CAGCT G---5'
ScaI	Streptomyces caespitosus	5'AGTACT 3'TCATGA	5'---AGT ACT---3' 3'---TCA TGA---5'
SpeI	Sphaerotilus natans	5'ACTAGT 3'TGATCA	5'---A CTAGT---3' 3'---TGATC A---5'
SphI	Streptomyces phaeochromogenes	5'GCATGC 3'CGTACG	5'---GCATG C---3' 3'---C GTACG---5'
StuI	Streptomyces tubercidicus	5'AGGCCT 3'TCCGGA	5'---AGG CCT---3' 3'---TCC GGA---5'
XbaI	Xanthomonas badrii	5'TCTAGA 3'AGATCT	5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5'

Tähistused:

* = tömp ots
N = C või G või T või A
W = A või T

Pöördtranskriptaas

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

Pöördtranskriptaas on ensüüm, mille abil sünteesitakse RNA matriitsahelalt komplementaarne DNA (cDNA) ahel. Seda protsessi nimetatakse pöördtranskriptsiooniks ning valdavalt seostatakse seda retroviirustega. Lisaks retroviirustele kasutavad pöördtranskriptaasi ka mõned teised viirused, näiteks B-hepatiidi viirus, mis kuulub sugukonda Hepadnaviridae. Sellepärast on pöördtranskriptaasi inhibeerivad ühendid laialdaselt kasutusel antiretroviraalsete ravimitena. Pöördtranskriptaasi on seostatud ka kromosoomide otsade ehk telomeeride replikatsiooni protsessiga ning osade mobiilsete geneetiliste elementidega (retrotransposoonid).

Pöördtranskriptsiooni kasutatakse laialdaselt molekulaarses kloneerimises RNA-lt DNA saamiseks, RNA sekveneerimises, polümeraasi ahelreaktsioonis (PCR) või genoomses analüüsis.

Enim uuritud pöördtranskriptaasid:

• HIV-1 pöördtranksriptaas, mis on pärit inimese immuunpuudulikkuse tüüp 1 viiruselt ning koosneb kahest subühikust molekulmassidega 66 kDA ja 51 kDa.
• M-MLV pöördtranskriptaas Moloney hiire leukeemia viirusest, mis esineb üksiku 75 kDa-lise monomeerina.
• AMV pöördtranskriptaas linnu müeloblastoosi viirusest, mis koosneb samuti kahest subühikust,molekulmassidega 63 kDa ja 95 kDa.
• Telomeraasi pöördtranskriptaas, mis säilitab telomeere replikatsiooni käigus.

Sisukord

AjaluguRedigeeri

Pöördtranskriptaasi avastas Howard Temin Wisconsini ülikoolis respiratoor-süntsütiaalse viiruse (RSV) virionidest ning David Baltimore isoleeris selle 1970. aastal kahest RNA kasvajaviirusest: R-MLV ja samuti RSV. Nende saavutuste eest anti neile 1975. aastal ühine Nobeli auhind füsioloogia või meditsiini kategoorias (koos Renato Dulbeccoga). Alguses oli idee pöördtranskriptsioonist väga ebapopulaarne, kuna see oli vastuolus molekulaarbioloogia keskse dogmaga, mis väidab, et DNA-d transkribeeritakse RNA-ks ning seda omakorda valguks. Alles pärast pöördtranskriptaasi avastamist hakati aktsepteerima ideed, et geneetilist informatsiooni on võimalik üle kanda ka RNA-lt DNA-le.

Pöördtranskriptaas viirustesRedigeeri

Pöördtranskriptaasi kasutavad viirused replikatsioonil. Pöördtranskribeerivad RNA-viirused (näiteks HI-viirus) kasutavad ensüümi, et pöördtranskribeerida oma RNA genoom DNA-ks. Saadud DNA on võimalik seejärel integreerida peremeesorganismi genoomi ning läbi selle saab viirus enda genoomi replitseerida. Pöördtranskribeerides DNA-viiruseid, näiteks hepadnaviirust, on võimalik kasutada saadud RNA-d matriitsahelana uute DNA ahelate kokkupanemisel. Pöördtranskriptaasi puudumisel ei oleks viirused võimelised enda genoomi replitseerima.

Pöördtranskriptsiooni protsessRedigeeri

Pöördtranskriptaas kasutab RNA matriitsahelat, et sünteesida kaheahelaline DNA. Viirustes, kus pöördtranskriptaasil on puudu DNA-sõltuv DNA polümeraasne aktiivsus, on võimalus, et kaheahelalist DNA-d sünteesitakse peremeesorganismi kodeeritud DNA polümeraas δ abil. Polümeraas tuvastab ekslikult viraalse DNA-RNA kui praimeri ning sünteesib kaheahelalise DNA samal mehhanismil nagu praimeri eemaldamiselgi, kus uus sünteesitud ahel vahetab välja algse RNA matriitsahela. Pöördtranskriptsiooni puhul on vigade ehk mutatsioonide tekkimise tõenäosus suur. Need mutatsoonid võivad põhjustada ravimiresistentsust.

Retroviiruste pöördtranskriptsioonRedigeeri

Retroviirused kasutavad pöördtranskriptaasi üheahelalise genoomse RNA transkribeerimiseks kaheahelaliseks cDNA-ks, et see integreerida peremeesgenoomi. Nende genoom koosneb kahest positiivse laenguga üheahelalisest RNA molekulist (ss-RNA ehk single-stranded RNA), millel on 5’-cap ja 3’-polüadenenüleeritud saba. Retroviirusteks on näiteks inimese immuunpuudulikkuse viirus (HIV) ja inimese T-lümfotroopne viirus (HTLV). Kaheahelalise DNA süntees toimub tsütosoolis järgmiste protsesside tulemusena:

Pöördtranskriptsiooni mehhanism VI klassi ssRNA-RT HI-viiruses

1. Spetsiifiline tRNA käitub kui praimer ning hübridiseerub viiruse RNA genoomi komplementaarsesse piirkonda, mida kutsutakse praimeri seondumisala (PBS ehk primer binding site).
2. Seejärel lisab pöördtranskriptaas praimeri 3' otsa DNA nukleotiide, sünteesides nii DNA, mis on komplementaarne RNA U5 (mittekodeeriv ala) ja R regiooniga (otsene kordusjärjestus RNA molekuli mõlemas otsas).
3. Pöördtranskriptaasil on domeen nimega RNaas H, mis lagundab U5 JA R regiooni RNA 5’-otsas.
4. Praimer seob viraalse genoomi 3’-otsa ning äsja sünteesitud DNA ahelad hübridiseeruvad RNA komplementaarse R regiooniga.
5. Sünteesitud komplementaarne DNA (cDNA) pikendatakse ning enamus viraalsest RNA-st lagundatakse RNaas H abil.
6. Lagundamata viraalne RNA toimib praimerina DNA teise ahela sünteesil.
7. Toimub "hüpe", kus teiselt ahela PBS hübridiseerub esimese ahela komplementaarse PBS-järjestusega.
8. Mõlemad ahelad pikendatakse, et moodustada täielik kaksikahelaline DNA, mida on võimalik integraasi abil integreerida peremeesorganismi genoomi.

Kaheahelalise DNA sünteesi käigus toimub ka ahela ülekanne, mil lühike DNA (algse RNA-sõltuva DNA sünteesi produkt) translokeerub aktseptor-regiooni genoomi teises otsas. Pöördtranskriptaas töötleb seda ala hiljem tänu oma DNA-sõltuvale DNA aktiivsusele. Retroviraalse RNA praimeri seondumise ala PBS regiooni 5' otsas asub U5 ning sellest 3' otsas paikneb "juhtiv" ala. tRNA praimer on 14. ja 22. nukleotiidi vahel lahti harutatud ning moodustab viraalse RNA PBS regiooni aluspaaridega dupleksi. PBS paiknemine viraalse RNA 5’-otsa lähedal on ebatavaline, kuna pöördtranskriptaas sünteesib DNA-d praimeri 3’-otsast 5’-3’-suunas (vaadeldes RNA matriitsi). Seega praimer ja pöördtranksriptaas peavad ümber paiknema viraalse RNA 3’-otsa. Nende ümberpaigutumine hõlmab mitut etappi ja kasutab mitmeid ensüüme, sealhulgas DNA polümeraas, ribonukleaas H (RNaas H) ja vajalik on polünukleotiidide lahti keerdumine.

HI-viiruse pöördtranskriptaas omab samuti ribonukleaasset aktiivsust, mis lagundab cDNA sünteesi käigus viraalse RNA. Lisaks on HIV pöördtranskriptaasil DNA-sõltuv DNA polümeraasne aktiivsus, mis kopeerib cDNA senssahela antisenss-DNA ahelaks, et sünteesida kaheahelaline viraalse DNA vaheühend vDNA.

Kloneerimisvektor

Molekulaarbioloogias mõistetakse kloneerimisvektori all ümberkorraldatud DNA molekuli, mille abil saab biotehnoloogilistel eesmärkidel transportida võõraid DNA lõike rakku. Kloneerimisvektorite abil saab uurida geenide funktsioone ja toota valke tööstuslikel eesmärkidel. Vektorit, mis sisaldab võõrast uuritavat DNA-d, nimetatakse rekombinantseks DNA-ks.

Joonis plasmiidsest vektorist pBluescript II KS

Viis tähtsaimat vektorit on plasmiidid, bakteriofaagid, kosmiidid, süstikvektorid ja kunstlikud kromosoomid, millest on enim kasutatud plasmiidid. Igal vektoril on kloneerimiseks vajalikud regioonid: multikloneerimisjärjestus, selektiivsusmarker, reportergeenid ja replikatsiooni alguspunktid.

Terminoloogia

Selektiivsusmarker

Selektiivsusmarker on kloneerimisvektoris olev geen (tavaliselt antibiootikumiresistentsust määrav geen), mis tagab peremeesraku kasvu kindlal söötmel. Kui näiteks vektoril on mõne penitsilliini resistentsusgeen, siis saab selle vektoriga rakk kasvada söötmel, millele on lisatud penitsilliini. Sellega tehakse kindlaks, et rakku on sisenenud õige vektor.

Reportergeenid

Tihti võib leida vektoritel reportergeene. Nende kaudu saab vektori olemasolu testida. Nende geenide katkestamine toob esile fenotüübilise muudatuse ja paljudel juhtudel sisestatakse uuritav DNA just reportergeeni sisse. Reportergeenis asub ka multikloneerimisjärjestus, mis lubab teha sinna lõikeid võõra DNA sisestamiseks.

Üheks reportergeeniks plasmiidses vektoris pBluescript II KS on lacZ geen, mille katkestamisel ei sünteesita enam β-galaktosidaasi. Kui söötmes on ühendit X-gal, siis katkestamata geeniga bakterikolooniad muutuvad siniseks ja katkestatud geeniga kolooniad valgeks. Selline värvil põhinev testsüsteem on sisenenud vektori kindlakstegemiseke tõhus viis.

Multikloneerimisjärjestus

Multikloneerimise asukoht on regioon vektoril, kuhu saab teha lõikeid uuritava geeni sisestamiseks. Tavaliselt on selleks regiooniks reportergeen, mille lõikamisel katkestatakse geeni funktsioon, mille järel on näha fenotüüpilisi muudatusi kolooniates. Lõigete tegemiseks kasutatakse restriktsiooniensüüme ja pärast vektori lahtilõikamist saab sisestada sinna uuritava geeni DNA ligeerimisega.

Replikatsiooni alguspunkt

Replikatsioon alguspunkt on selline piirkond vektoris, kust replikatsioon saab alata. Kloneerimisvektoris ei ole tavaliselt geene, mis tagaksid replikatsiooni. Selle eest vastutab bakteriraku kromosomaalne DNA, mis sünteesib vajalikke valke plasmiidi replikatsiooniks. See tagab uuritava geeni ekspressiooni vektoris.

Vektorid

Plasmiidid

Plasmiidid on kromosoomivälised, isereplitseeruvad DNA rõngasmolekulid bakteriraku sees, mis sisaldavad kasulikke geene peremeesrakule ja geene, mis lubavad sel säilida raku sees. Kui plasmiid aga bakterirakule kasulik ei ole, püüab bakter sellest loobuda ja selle tõttu on laborites kasvavad bakterid tavaliselt vähem elujõulised kui looduses elavad bakterid. Bakteriraku plasmiid ei ole automaatselt vektor. Selleks, et plasmiidist saaks vektor, tuleb seda laboritingimustes muuta. Plasmiidsete vektorite suurus võib varieeruda alates 1000 aluspaarist kuni 200 000 aluspaarini. Paljud plasmiidid sisaldavad antibiootikumiresistentsuse geene, mis on ideaalsed selektiivsusmarkerid.

Bakteriofaagid

Enamik viiruse vektoreid on sünteesitud lambda-nimelise bakteriofaagi kromosoomist. Viiruse genoomi saab lõigata lahti restriktsiooni ensüümidega ja seejärel in vitro sisestada sinna uuritav geen. Viirus siseneb seejärel rakku ja eraldab sinna oma vektori (viiruse genoomi, kuhu on sisse viidud uuritav geen), kust saab alata kloneerimine. Kloneerimise saaduse alusel saab teha edasisi uuringuid.

Kosmiidid

Kosmiidid on kunstlikult sünteesitud vektorid, millel on nii bakteriofaagi kui ka plasmiidi omadusi. Kosmiidid arendati välja suurte geenide (rohkem kui 150 000 aluspaari) kloneerimiseks, kuna plasmiidides ega viiruse vektorites nii suuri geene kloneerida ei saa. Kosmiididel on nii plasmiidide isereplitseerumise mehhanismid kui ka viiruse vektorite in vitro geeni sisestamise võimalusi.

Süstikvektorid

Kui plasmiidid, bakteriofaagid ja kosmiidid suudavad replitseeruda ainult bakterites, siis süstikvektorid on kunstlikult sünteesitud kloneermisvektorid, mis töötavad nii eükarüootsetes kui ka prokarüootsetes organismides. Süstikvekorid on väga kasulikud bakterite ja loomariigi vahelisteks geneetilisteks uuringuteks.

Kunstlikud kromosoomid

Uurtava DNA fragmendi sisestamine BAC vektorisse

Kunstlikud kromosoomid on välja töötatud samuti väga suurte DNA regioonide uurimiseks. YAC (yeast artificial chromosomes) vektorid suudavad kanda endas kuni poole miljoni aluspaari suuruseid DNA segmente. YAC-e on kasutatud ka Inimese Genoomi Projektis, kus oli vaja kaardistada suuri genoomisegmente.

BAC-id (Bacterial artificial chromosomes) on sarnaselt YAC-idele suure DNA hoidmise mahuga. Erinevus on selles, et eükarüootsete organismide asemel kasutatakse neid bakterites.

Vektori kloneerimine

Selleks, et kasutada kloneerimisvektoreid, tuleb eelnevalt läbida mitu protsessi. Iga protsess viiakse läbi in vitro tingimustes ning kasutatakse mitut lahust. Esmalt tuleb uuritav DNA fragment restriktsiooniensüümidega lahti lõigata ja seda fragmenti polümeraasi ahelreaktsiooni meetodil paljundada. Seejärel tuleb lahti lõigata ka vektor ja uuritav geen ning vektor omavahel kokku ligeerida. Valminud rekombinantne DNA viiakse sisse peremeesrakku, kus rakk saab paljuneda koos vektoriga. Viimase etapina eraldatakse vektor ja seda kasutatakse vastavalt vajadusele. Lihtsuse mõttes kirjeldatakse järgnevates alapunktides plasmiidse DNA kloneerimist.

DNA fragmendi lõikamine

Uuritava DNA fragmendi lahtilõikamine algsest genoomist toimub restriktaaside kaudu. Restriktaasid on valgud, mis looduslikult kaitsevad rakke võõra DNA eest, tehes spetsiifilisi katkeid võõrasse sissetungivasse DNA-sse. Sellised restriktaasid tagavad rakule kaitse. Tänapäeval kasutavad restriktsiooniensüüme geneetikud DNA fragmentide kloneerimiseks. Restriktaase on palju ja igaüks neist lõikab ainult ühte kindlat järjestust DNA lõigul. Kui uuritava DNA järjestus on teada, saab ka kindlaks teha kohad, kust DNA-d lõigata, et uuritav lõik eraldada algsest genoomist.

Polümeraasi ahelreaktsioon

Kui uuritav DNA lõik on eraldatud, siis tuleb seda paljundada, et sooritada katseid, mis vajavad rohkem kui ühte DNA fragmenti. Paljundamiseks kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni. See on laialdaselt kasutatav meetod DNA fragmentide paljundamiseks.

DNA ligeerimine

Selleks, et kloneerimisvektorisse uuritav DNA fragment sisestada, peab kõigepealt vektori restriktaasidega multikloneerimisjärjestuse alast lahti lõikama. Kui lahtilõigatud vektor ja uuritav DNA fragment kokku panna, peab need ligeerimisega kokku "kleepima". Selliseks kleepimiseks kasutatakse DNA ligaasi, mis liidab kokku fragmendi ja vektori.

Transformatsioon ja kompetentsed rakud

Protsess, mille käigus rakud võtavad endasse võõra geneetilise materjali, nimetatakse transformatsiooniks. Võõras DNA aga ei saa siseneda rakku ilma rakumembraanis toimuvate muutusteta. Selliseid meetodeid, kus rakumembraan muudetakse võõrale DNA-le vastuvõtlikuks, nimetatakse rakkude kompetentseteks muutmiseks. Laborites kasutatakse selleks tavaliselt rakkude töötlemist kahevalentsete katioonidega, näiteks Ca²⁺ (kaltsiumkloriid CaCl₂). Kaltsiumkloriid laeb rakumembraani pinna positiivselt, mis lubab negatiivselt laetud DNA-l seonduda membraanile. Temperatuuri tõstmisega muudetakse membraan elastseks ja seejärel saab vektor rakku siseneda.

DNA replikatsioon

Selleks, et saada suurel hulgal sünteesitud kloneerimisvektoreid, tuleb rekombinantse DNA-ga rakke paljundada. Kui vektor on sisenenud rakku, hakkab vektor replitseeruma koos rakuga. Kuna kloneerimisvektor on olemuse poolest DNA, siis saab see paljuneda tavalise replikatsioonimehhanismi alusel. Selleks kasutab vektor peremeesraku enda nukleotiide ja polümeraase. Replikatsiooni tulemusena saadakse suur kogus kloneerimisvektoreid, mis on järgneva uurimistöö toormaterjaliks.

Plasmiidse DNA eraldamine bakterirakkudest

Plasmiidse DNA eraldamiseks on vaja algselt suurt kogust rakke. Selleks kasvatatakse plasmiidse DNA-ga rakke söötmes, kus on sees vektori selektiivsusmarkerile vastav antibiootikum. Vedelsöötmel kasvanud rakkudest saab eraldada plasmiidse DNA mitmel meetodil, kuid peamine on aluselise lüüsi meetod. Selle käigus lüüsitakse (purustatakse) rakud ning DNA denatureerub (sulab lahti). Aluselise lüüsi metoodikas kasutatakse pH muutuste mõju DNA-le. Kromosomaalne DNA ei jõua piisavalt kiiresti renatureeruda (tagasi ühineda) ja alles jääb ainult plasmiidne DNA. Seejärel tsentrifuugitakse valgud ja kromosomaalne DNA põhja ning lahusesse jääb ainult plasmiidne DNA. Edasi saab neid vektoreid sisestada teistesse organismidesse ja jälgida, kuidas sünteesitud vektor neid mõjutab.

Plasmiidid

Plasmiidid on kromosoomivälised DNA molekulid, mis avastati Enterobacteriaceae sugukonda kuuluvatest bakteritest. Praeguseks on leitud neid peaaegu kõikidest uuritud bakteritaksonitest. Plasmiidid on enamasti kaksikahelalised DNA 

rõngasmolekulid, mis replitseeruvad bakteri genoomist 

sõltumatult. Nende suurus võib varieeruda mõnesajast kuni mõnesaja tuhande aluspaarini. Plasmiidid sisaldavad geene, mis on vajalikud nende talitlemiseks ja säilimiseks peremeesrakus. Mõnedel plasmiididel on geenid, mis tagavad plasmiidi stabiilse püsimise bakterirakus, näiteks toksiini-antitoksiini süsteemi kodeerivad geenid. Kuigi plasmiidid pole bakterite populatsiooni kasvuks ja bakteritele elutähtsateks funktsioonideks vajalikud, siis teatud juhtudel, näiteks ebasoodsate keskkonnatingimuste korral, võib plasmiidi olemasolu oluliselt soodustada bakteriraku ellujäämist. Soodsates keskkonnatingimustes võib bakterirakk plasmiidist vabaneda, ilma et sellele järgneks peremeesraku jaoks eluohtlikke tagajärgi. Plasmiidid kanduvad ühest bakterirakust teise peremeesraku pooldumise ajal ja horisontaalselt, peamiselt konjugatsiooni teel.

Bakter: 1. Kromosomaalne DNA, 2. Plasmiidid

Geneetiline struktuur

Klassikalise lähenemise kohaselt on plasmiidid modulaarse struktuuriga, mis tähendab seda, et üksteisega seotud funktsioonid on kodeeritud ja rühmitatud kindlatesse DNA lõikudesse. Iga moodul (DNA fragment) on plasmiidi genoomis sageli erineva fülogeneetilise päritoluga. Arvestatava osa plasmiidide struktuurist hõlmavad plasmiidi ellujäämise, levimise ja replikatsiooni jaoks vajalikud geenid. Neid nimetatakse plasmiidi selgrooks. Selgroo-geenid on plasmiidide süstematiseerimise aluseks. Plasmiidide klassifitseerimine põhineb geneetilistel tunnustel, mis on kõigis plasmiidides püsivalt esindatud. Need tagavad plasmiidide võime säilitada end peremeesrakus ja kontrollida replikatsiooniprotsessi.

Plasmiidide klassifitseerimise ajalugu

Plasmiidide klassifitseerimise vajadus tekkis 1950. aastate lõpus, kui avastati R-plasmiidid ehk resistentsust põhjustavad plasmiidid. Varasemate uuringute tähelepanu oli valdavalt suunatud F-plasmiididele ehk fertiilsust põhjustavatele plasmiididele ja nende osalusele geeniülekandes, ning samuti kolitsiine kodeerivatele (Col) plasmiididele. Multiresistentsust tagavad R-plasmiidid avastati tänu nende võimele kanda konjugatsiooni teel ühest bakterirakust teise mitme ravimi suhtes resistentsust kodeerivaid geene.

Esmane kriteerium, mida plasmiidide klassifitseerimisel kasutati, oli seotud konjugatiivse ülekandevõimega. Selgus, et R-plasmiidid kanduvad üle madala sagedusega, F-plasmiidid aga kõrge sagedusega. Samuti täheldati, et teatud juhtudel pärssis samas peremeesrakus olev R-plasmiid F-plasmiidi ülekannet. Selle tunnuse põhjal jaotas Watanabe plasmiide fi+ (fertiilsuse pärssimine) ja fi– plasmiidideks. Hiljem selgus, peamiselt tänu Meynelli ja Datta uurimistööle, et on olemas seos plasmiidi fi-oleku ja sugukiu (sex pili) tüübi vahel. Fi+ tüvedel olid sugukiud immunoloogiliselt ja struktuuri poolest sarnased F-plasmiide sisaldavate tüvede kiududega, samas kui fi-tüvede kiud sarnanesid ColI-plasmiide omavate bakteritüvede sugukiududega.

1960. aastatel, mil plasmiidide uurimine pälvis suuremat tähelepanu, avastati plasmiidid, mis olid mittekonjugatiivsed ega pärssinud konjugatiivset ülekannet. Seetõttu ei saanud neid fi-süsteemi järgi määrata. Lisaks avastati veel uusi sugukiudude tüüpe. Need avastused muutsid plasmiidide senise klassifitseerimise ebapiisavaks.

Plasmiidide mittesobivusgrupid ja määramine replikonide järgi

Mittesobivus (incompatibility) on eripära, mis on omane plasmiididele ning sobib nende klassifitseerimiseks. Plasmiidide mittesobivust kirjeldati esmakordselt F-plasmiidide näitel 1960. aastate alguses. Klassifitseerimise ametliku skeemi, mis põhineb plasmiidide mittesobivusel, töötasid 1970. aastate alguses välja Datta ja Hedges. Mittesobivus on kahe plasmiidi suutmatus samas rakuliinis stabiilselt säilida. Plasmiidid, mis on üksteise suhtes mittesobivad, paigutatakse samasse mittesobivusgruppi. Praeguseks on teada umbes 30 mittesobivusgruppi enterobakterite plasmiidide seas ja 7 stafülokokkide plasmiidide seas.

Mittesobivust testitakse plasmiidi sisestamisega tüvesse, mis kannab teist plasmiidi. Mõlemal plasmiidil peavad olema erinevad geneetilised markerid, et peremeesrakk saaks plasmiide eristada. Valik langetatakse siseneva plasmiidi järgi. Seejärel kontrollitakse, kas järgmises põlvkonnas on plasmiide, mida bakteris esialgselt leidus. Kui antud plasmiidi järglaskonnas ei ole, loetakse need kaks plasmiidi mittesobivaks (incompatible) ja määratakse samasse mittesobivusgruppi.

Eristatakse mitmeid erinevaid mittesobivusgruppe: IncP, IncW, IncN, IncT, IncY, IncF, IncB/O jne.

Kirjeldatud meetodika rakendamine on töö- ja ajamahukas ning sellega kaasnevad mitmed raskused, mis on tingitud näiteks arvukatest replikatsiooni kontrollmehhanismidest ning sobivate geenide puudumisest. Seetõttu töötati välja uus meetod plasmiidide identifitseerimiseks – määramine replikonide järgi (plasmid replicon typing). Selle meetodi aluseks on erinevate replikonide genotüübi äratundmine. Plasmiididele, mis kannavad enam kui ühte replikoni või sarnast, aga siiski kokkusobivat replikoni, annab plasmiidide määramine replikonide järgi kõige täpsemaid tulemusi. Replikoni järgi liigitamine on lihtsam kui mittesobivusgruppide testimine ja nõuab ühtlasi ka vähem aega. See on rakendatav paljude eri bakteriliikide puhul.

Konjugatsioon

Bakteritevaheline plasmiidide ülekanne toimub horisontaalselt konjugatsiooni teel. Konjugatsioon on protsess, kus rakkudevahelise kontakti teel doonorraku (rakk, mis loovutab plasmiidi) DNA kantakse üle retsipientrakku (rakk, mis võtab DNA vastu). Sõltuvalt konjugatiivsusest saab plasmiidid jagada kahte klassi. Plasmiide, mis kannavad tervet konjugatsiooniks vajalike geenide komplekti, nimetatakse konjugatiivseteks plasmiidideks, näiteks enterobakterist pärit IncW rühma kuuluv R-plasmiid R388. Teised plasmiidid sisaldavad vaid minimaalset geenide hulka, mis võimaldavad neil konjugatsiooni teel liikuda vaid konjugatiivsete plasmiidide abiga. Neid nimetatakse mittekonjugatiivseteks või mobiliseeritavateks plasmiidideks, näiteks IncQ1 rühma plasmiid RSF1010. Konjugatiivsed plasmiidid on tavaliselt väikese koopiaarvuga, samas kui mittekonjugatiivsed plasmiidid on kõrge koopiaarvuga. Konjugatiivsed plasmiidid kannavad konjugatsiooniprotsessi tagavaid geene, sealhulgas sugukiude kodeerivaid geene, mis on vajalikud rakkudevaheliste kontaktide loomiseks. Plasmiidid, mis kuuluvad samasse mittesobivusgruppi, omavad tavaliselt DNA homoloogiat ja nad kodeerivad sarnaseid sugukiude ja konjugatsioonisüsteeme. Konjugatsiooniprotsessis toimuvad sündmused:

1. DNA ülekande algus ülekande lähtekohast (oriT), kuhu ensüüm relaksaas teeb üheahelalise katke;
2. plasmiidi DNA ahelate lahtiharutamine;
3. ühe ahela ülekanne retsipientrakku;
4. üksikahelalisele DNA-le komplementaarse ahela süntees nii doonor- kui ka retsipientrakus;
5. plasmiidse DNA rõngasmolekuli moodustumine.

Plasmiidide funktsioonid

Plasmiidide olemasolu on rakkudele kasulik: paljud plasmiidide omadused aitavad rakul kindlates tingimustes ellu jääda. Need tunnused jagatakse nelja peamisse rühma:

1. resistentsus – kannavad resistentsust raskmetallide, antibiootikumide suhtes;
2. energeetiline metabolism – võimaldavad peremeesrakul lagundada saasteaineid;
3. patogeensus, sümbioos ja virulentsus – plasmiidid sisaldavad virulentsusgeene, mis tõstavad bakterite patogeensust ja põhjustavad haigusi, näiteks katku ja teetanust;
4. levik ja säilimine – viivad läbi sugukiudude sünteesi ja võimaldavad kemotaksise toimumist

Plasmiidide tüübid

Funktsioonide alusel jagatakse plasmiidid viide gruppi:

1. resistentsusplasmiidid – kannavad tavaliselt geene, mis kodeerivad antibiootikumide või mürkide suhtes resistentsust. R-plasmiidid on sageli konjugatiivsed ning võimelised levima bakterikoosluses horisontaalselt;
2. degradatiivsed plasmiidid – suured kataboolsed plasmiidid, mis kodeerivad erinevate orgaaniliste ainete, näiteks tolueen, naftaleen, fenool jt, lagundamiseks vajalikke ensüüme;
3. fertiilsusplasmiidid (F-plasmiidid) – sisaldavad tra-geene, mille kodeeritud produkte kasutatakse konjugatsiooniprotsessis ning geneetilise materjali ülekandmisel bakterite vahel;
4. col-plasmiidid – sisaldavad antibiootikume kodeerivaid geene. Neid antibiootikume nimetatakse kolitsiinideks. Kolitsiinid toimivad teistele bakteritele surmavalt;
5. virulentsusplasmiidid – nendel plasmiididel on võime muuta bakterid patogeenideks. Virulentsusplasmiidid osalevad haigusi põhjustavate geenide kandmises.

Antibiootikumiresistentsuse levik

Plasmiididel on antibiootikumiresistentsuse saavutamises keskne roll. Plasmiidid võivad resistentsusgeene koguda ja levitada. Antibiootikumide resistentsusmehhanismid bakterites on erinevad. Nendeks on sihtmärgi kaitsmine, märklaua asendamine, antibiootikumi mürgitustamine ja antibiootikumi rakusisese kuhjumise blokeerimine. Resistentsusmehhanismide läbiviimiseks vajalike geenide omandamine võib toimuda erineval viisil, näiteks transpositsiooni abil. Transpositsioon on protsess, kus kindel järjestus, mis pärineb kindlast replikonist, on sisestatud teise replikoni (plasmiid või kromosoom). Vastupidi klassikalisele rekombinatsioonile ei nõua transpositsioon geneetilist homoloogsust doonori ja retsipiendi vahel.

Transposoonid on geneetilised elemendid, mis on võimelised teistesse geneetilistesse struktuuridesse sisenema, kuid võivad transpositsiooni käigus nendest ka lahkuda. Sageli esinevad nad plasmiididel. Transposoonid võivad sisaldada resistentsusgeene pea kõigi antibiootikumide vastu: ampitsilliini (ja teiste penitsilliinide), tetratsükliini, klooramfenikooli, trimetoprimi, streptomütsiini, kanamütsiini, neomütsiini, gentamütsiini ja tobramütsiini vastu. Need "hüppavad geenid" suudavad ennast ümber paigutada ühest plasmiidist teise või plasmiidist kromosoomi. Transposoonid võivad olla kiire resistentsuse leviku põhjustajateks bakteriperekondade seas.

Kui gramnegatiivsed enterobakterid sisaldavad tavaliselt ühte tüüpi suurt plasmiidi mitme ravimi suhtes resistentsuse saavutamiseks, siis osa grampositiivseid baktereid, nagu stafülokokid, omandavad multiresistentsuse tänu mitmele eri tüüpi väiksemale plasmiidile. Resistentsusplasmiidid võivad sageli kanduda üle konjugatsiooni teel nii sama liigi eri tüvede kui ka erinevatesse taksonitesse kuuluvate bakterite vahel.