Viiruste geneetika 15

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

15. Viiruste geneetika

 

Viiruste definitsioon.

 

Viirused on obligatoorsed rakusisesed parasiidid. Samas on rakusisesed parasiidid ka mitmed prokarüootsed organismid, näit. bakterid perekonnast Rickettsiae ja Chlamydiae, mis suudavad rakuväliselt eksisteerida ainult väga lühiajaliselt. Seetõttu on viiruste defineerimiseks vaja juurde tuua veel lisaparameetrid:

1) Viiruspartiklid assambleeritakse eelnevalt valmissünteesitud komponentidest

2) Viiruspartiklid ei kasva ega jagune

3) Puudub geneetiline info energia tootmiseks ja valgusünteesiks.

 

Viiruste spetsiifika:

Iga viirus on võimeline nakatama ainult teatud tüüpi rakke. Vastavalt sellele klassifitseeritakse viiruseid loomaviirusteks, taimeviirusteks ning bakteriviirusteks e. bakteriofaagideks. Viirusega nakatamiseks on vaja, et viiruse välispind interakteeruks rakupinna spetsiifiliste retseptoritega. Loomaviiruste retseptorid paiknevad plasmamembraaanil, faagide retseptorid bakteriraku rakukestal või kiududel e. piilidel. Viirusega nakatumise tagajärjel toimub raku metabolismi ümberlülitamine normaalselt elutegevuselt viiruse paljundamisele. 

 

Viiruste avastamine.

 

Nimetus viirus tuleneb ladinakeelsest sõnast virus, mis tähendab tõlkes mürki. Kuni 20-nda sajandini tähistati terminiga “viirus” kõiki haigustekitajaid. Kuigi paljudel juhtudel oli tegemist bakteriaalsete infektsioonidega, nimetati ka neid viirusinfektsioonideks.  Eraldi rühmana toodi viirused välja alles 20-nda sajandi künnisel. Keskmise bakteriraku pikkus 2-3 mm. Viiruspartikli e. viriooni suurus varieerub aga vahemikus 20 - 400 nm. Viirused tuvastati kui haigusi tekitav toimeaine, mis läbib bakterifiltreid, mille pooride läbimõõt on väiksem kui 0,4 mm.

 

Eelajalugu.

Esmased teated viirushaiguste kohta pärinevad Egiptusest 3500 a. tagasi. Memphises on leitud hieroglüüfe, mis kujutavad templipreestrit tüüpiliste poliomüeliidi nähtudega. Ka Kairos eksponeeritud vaarao Ramses V muumial (vaarao suri 1196. a. e. m. a.) on täheldatavad viirushaiguse - rõugete - tunnused. Esimesed katsed vältida viirushaigusi pärinevad vanast Hiinast. Rõugete vältimiseks oli Hiinas juba 3000 a. tagasi kasutusel variolatsioon, kus haiguse läbipõdenute paranevatest rõugekahjustuskohtadest võeti materjali ning kraabiti laste käsivartele. Variolatsioon oli kasutusel sajandeid ka Euroopas. Tulemus oli tõhus, kuid sisaldas alati riskimomenti. Nii oleks äärepealt variolatsiooni tagajärjel 7-aastaselt surnud Edward Jenner, kes hiljem, 1796. a. viis läbi esimese vaktsineerimise. E. Jenner märkas, et lüpsinaised haigestusid võrreldes teistega rõugetesse vähem, kuna nad puutusid lüpsmise käigus kokku lehmarõugetega. E. Jenner viis oma kodukülas Berekeley’s läbi eksperimendi, kus võttis lüpsinaise Sarah Nemes kätelt lehmarõugete materjali ning nakatas sellega 8-aastast poissi James Phipps. Poiss osutus hiljem rõugete suhtes immuunseks. 19. sajandil võeti vaktsineerimine lehmarõugetega laialdaselt kasutusele üle kogu maailma.

  

L. Pasteur isoleeris marutaudi viiruse. Samas ei eristanud ta haigustekitajat bakeritest ning seega kuulub viiruste esmaavastaja au Vene botaanikule Dimitri Ivanovile, kes demonstreeris 1892. a., et tubaka haigust põhjustab bakterifiltreid läbiv taimeviirus. 1898. a. kordas Martinus Beijerinick Ivanovski katseid tubakataimedega ning nimetas haigust põhjustava viiruse tubaka mosaiigiviiruseks (TMV). Järgnesid teated teistest viirushaiguistest:

1898 Loeffler ja Frosch - veiste suu- ja sõrataud

1908 Ellerman ja Bang - kodulindude leukoos

1909 Landsteiner ja Popper - poliomüeliit inimestel on viirushaigus

 

1915. a. näitasid Twort ning 1917. a. d’Herelle, et ka baktereid nakatavad viirused - bakteriofaagid, põhjustades bakterirakkude lüüsi.

 

 

 

Viriooni ehitus.

 

Viiruspartikkel sisaldab nukleiinhapet, mis kodeerib viirusspetsiifilisi valke. Viiruse geneetiliseks materjaliks on kas DNA või RNA molekul. Eristatakse üksikahelalise (ss -single strand) ja kaksikahelalise (ds - double strand) genoomiga viirusi. dsDNA viirused on näiteks loomaviirustest papilloomiviirus ning bakteriofaagidest T4 ja lambda faag; ssDNA genoomiga on bakteriofaag M13. Reoviiruste (põhjustavad hingamisteede haigusi) genoomiks on dsRNA. ssRNA genoomiga viiruste näiteks võib tuua retroviirused, näit. HTLV, mis põhjustab leukoosi ja HIV, mis põhjustab AIDS-i.

 

Retroviiruste genoomiks on ssRNA molekul. Pärast raku nakatamist retroviirusega sünteesitakse rakus viiruse RNA-le komplementaarse dsDNA. DNA sünteesi viib läbi pöördtranskriptaas e. revertaas, mis on viiruse poolt kodeeritud ja on valmiskujul olemas juba viiruspartiklites. dsDNA integreerub raku genoomi viiruse poolt kodeeritud integraasi abil. Integreerunud DNA võib genoomis püsida pikka aega latentsena, proviirusena. Viiruse genoomi paljundamisel muutub ta transkriptsiooniliselt aktiivseks. Viiruse valkude sünteesiks avalduvad viiruse-spetsiifilised geenid. Samuti toimub viiruse genoomi (RNA) amplifikatsioon. 

 

Viiruse nukleiinhapet ümbritseb valkkate - kapsiid, millel võib olla ümbris. Genoomi pakkimine kapsiidi on vajalik selleks, et kaitsta nukleiinhapet välismõjude eest. Pakkimisel osalevad spetsiifilised pakkimisvalgud, mis tunnevad nukleiinhappel ära pakkimissignaale. Selleks, et stabiliseerida pakitud nukleiinhapet, vältida negatiivsete laengute tõukumist, jääb nukleiinhape seotuks positiivselt laetud ioonidega, polüamiinide ning valkudega. Valgu monomeerid kapsiidis moodustavad kapsomeeri. Kapsiidi struktuurüksused on omavahel ühendatud mittekovalentsete sidemetega.

 

Viiruspartiklite arv ja nende infektsioonivõime on vaid harva 1:1 vastavuses. Mitte kõik virioonid ei sisalda kogu viiruse geneetilist informatsiooni.

 

Kapsiidi sümmeetria:

 

1. Helikaalne (TMV, faag M13;)

 

TMV (Tubaka Mosaiigiviirus): 6400 nt, 2130 identset valgu subühikut pakitud helikaalselt ümber ssRNA, iga valgu subühik interakteerub 3 nt-ga. Assambleerumise ühikuks 34 subühikut. 1955. a. näitasid Fraenkel-Conrat ja Williams, et dissotseerunud valgud ja NH on võimelised spontaanselt reassambleeruma.

 

2. Ikosaeedriline - 12-nurkne 20 võrdkülgse kolmnurgaga hulktahukas. Näit. faag FX174, adenoviirused, pikornaviirused. Kui kapsiidis on rohkem kui 60 subühikut, on kapsiid kvaasi-ekvivalentne.

 

Viiruste ümbris ehk kest esineb peamiselt loomaviirustel.

 

Ümbris pärineb peremeesraku membraanist; herpesviiruste puhul on ümbriseks tuumamembraan. Ümbris sisaldab lipiide ja valke. Valgud on viirusspetsiifilised:

1. Maatriksvalgud, tavaliselt glükosüleerimata

2. Glükoproteiinid

   a) eksternaalsed - "spikes" (gripiviirus - hemaglutiniin)

   b) transportkanalivalgud.

Ümbrisega virioonid võivad olla pleomorfsed, s.o. erineva kujuga.

 

Komplekssed viirused

 

Rõugeviirused - omavad ümber DNA mitut valkkesta

Kapsiid lisastruktuuridega (T faagid)

Bakuloviirused - viiruspartiklid kahesugused

 

 

 

Bakteriofaagid uurimisobjektina geneetikas.

 

Pärast bakteriofaagide avastamist jätkati nende uurimist eeskätt meditsiinilistel eesmärkidel. Kuna faagid hävitavad baktereid, siis loodeti neid kasutada bakteriaalsete haiguste (nt. koolera, tüüfus) raviks. Selgus aga, et faagide viimisel haige organismi asub neid tõrjuma organismi immuunsüsteem. Geneetikud avastasid bakteriofaagid kui uurimisobjekti 30-ndate aastate algul. Bakteriofaagide uurimine oli perspektiivikas eeskätt nende lihtsuse tõttu ja võimaldas täpsemalt defineerida geenide olemust.

 

Bakteriofaagi elutsükkel.

 

Vastavalt faagide paljunemisstrateegiale jaotatakse nad virulentseteks ja mõõdukateks faagideks. Virulentsed faagid (näit. T4) põhjustavad alati pärast faagipartiklite taastootmist peremeesraku surma. Sellist elutsüklit nimetatakse lüütiliseks tsükliks. Mõõdukad faagid (näit. faag lambda) võivad aga pärast bakteriraku nakatamist valida kas lüütilise tsükli või lülituda bakteri kromosoomi, replitseeruda kromosoomi koostisosana ja püsida seal, ilma et faagi paljundamisega seotud geenid avalduksid, paljude rakupõlvkondade vältel. Sellist kromosoomi integreerunud faagi nimetatakse profaagiks ja tema paljunemisstrateegiat lüsogeenseks. Mingil hetkel profaag vabaneb ja paljuneb lüütilise tsükli teel.

 

T4 ja tema sugulased (T2, T6).

 

E. coli T-faagid on dsDNA faagid, lineaarse genoomiga (T2, T4, T6 - ~167000 bp; T7 - ~39000 bp). Nad on virulentsed faagid.

 

Need faagid on nii seroloogiliste kui ka morfoloogiliste tunnuste põhjal omavahel suguluses. Nende DNA on 80% ulatuses homoloogiline, võimaldades liikidevahelist rekombinatsiooni. Ka geenide järjekord ja regulatsiooniskeem on sarnased. Enamus uuringuid on kontsentreerunud T4-le. T-faagide paljunemistsükkel sõltub peremeesraku energiametabolismist, rakumembraani ehitusest, transkriptsiooni- ja translatsiooniaparaadist. Bakteriraku funktsioonid allutatakse faagipartiklite taastootmisele. T-faagide partiklid on teadaolevatest viiruspartiklitest ühed kõige komplekssemad. Kapsiidi struktuurvalgud ja assambleerumisel osalevad valgud võtavad enda alla üle 40% kogu geneetilisest informatsioonist: 24 geeni - pea morfogenees; 25 geeni saba ja sabakiud; assambleerumisel osalevad valgud.

 

Infektsioonitsükkel.

 

T-faagide saba keskel on helikaalse ehitusega toru, mille kaudu DNA pääseb rakku.Toru on ümbritsetud helikaalse tupega, mis on võimeline kokku tõmbuma. Tupe peapoolne ots on ühendatud kaelusega ja teine ots basaalplaadiga. Basaalplaat on 6-nurkne, igas nurgas on nõel (pin). Saba pikkus on konstantne. Basaalplaadilt algavad ka 6 sabakiudu. Sabakiud tunnevad ära raku pinnal olevaid faagi-spetsiifilisi retseptoreid. Erinevad T-faagid tunnevad ära erinevaid retseptoreid. Faagi kinnitumine rakupinnale sabakiududega on pöörduv protsess. Seejärel toimib kinnitumine basaalplaadi nõelte abil, mis on pöördumatu. Basaalplaat lõhub rakukesta basaalplaadis sisalduva lüsosüümi toimel. Plaadis toimuvad konformatsioonilised muutused ning ta avaneb DNA väljutamiseks. ATP-d tarbiv tupe kontrakteerumine surub faagi pead basaalplaadi ja kiudude suunas. Saba südamikus olev toru läbib rakukesta, kuid mitte rakumembraani ning valkkatteta DNA siseneb läbi rakumembraani. Selleks, et faagi DNA oleks kaitstud rakusiseste nukleaaside eest, on ta modifitseeritud.

 

Faagi paljunemistsükli erinevatel etappidel avalduvad erinevad geenid. Varajases infektsioonistaadiumis inaktiveeritakse faagi poolt kodeeritud valkude abil raku geenide transkriptsioon ja translatsioon. Bakteri RNA polümeraas modifitseeritakse nii, et ta tunneb ära faagi geenide promootoreid. Toimub ka intensiivne faagi genoomi paljundamine. Hilised geenid kodeerivad faagi kapsiidi valke ja faagi DNA-d lahtilõikavaid ensüüme. Lisaks basaalplaadis sisalduvale lüsotsüümile sünteesitakse ka lahustuvat lüsotsüümi, mis hävitab rakuseina. Vabaneb 200 viiruspartiklit, kogu infektsioonitsükkel kestab 25 minutit.

 

Faag paljuneb erinevates bakteritüvedes erineva edukusega. Seda nähtust kirjeldati esmalt faag lambda ja P2 puhul. W. Arber leidis, et T4 paljunemine on osades E. coli tüvedes restrikteeritud (piiratud). Rakus on olemas metülaasid, mis modifitseerivad nukleotiide spetsiifiliselt restriktaaside poolt äratuntavatest 4 - 6 bp pikkustest DNA järjestustest. Metüleerimata DNA on substraadiks restriktaasidele, mis lõikavad DNA kleepuvate või tömpide otstega fragmentideks. Edasise degradatsiooni viib läbi rakuline nukleaas ExoV. Restriktsiooni-modifikatsioonisüsteemi bioloogiliseks funktsiooniks on võõra DNA degradatsioon (raku enda DNA on spetsiifiliselt samade restriktaaside äratundmissaitidest metüleeritud). Enamlevinud on klass I ja klass III restriktsiooni-modifikatsiooni süsteem.

 

T-faagide DNA sisaldab hüdroksümetüültsütosiini (HMC) tsütosiini (C) asemel. Selline modifikatsioon kaitseb T4 faagi DNA-d T4 poolt kodeeritud endonukleaaside eest. Vahetult peale faagi infektsiooni ja faagi varajaste geenide avaldumist toimub bakteri DNA degradatsioon mononukleotiidideks. Seejärel konverteerib faagi poolt kodeeritud ensüüm tsütosiini HMC-ks. Faagi genoomi replikatsioonil osaleb ka valk, mis takistab C lülitumist HMC asemel sünteesitavasse DNA ahelasse. Selline DNA jääb aga atakeeritavaks bakteriraku poolt kodeeritud restriktsioonisüsteemi poolt. Et seda vältida, on HMC alused lisaks veel faagi poolt kodeeritud glükosüültransferaasi poolt glükosüleeritud. T2 ja T4 (kuid mitte T6 DNA) on metüleeritud ka adeniini N6 positsioonist enamasti GATC järjestustest. Metülatsiooni läbiviiv ensüüm omab valgu tasemel sarnasust E. coli Dam metülaasiga.

 

Bakteriofaagi genoomi kaardistamine.

 

Suvalise organismi geneetilise kaardi koostamine eeldab ristamiskatseid nende isendite vahel, mis sisaldavad sama geeni erinevaid alleele. Faagide puhul saab erinevaid fenotüüpe kirjeldada ainult läbi faagi ja bakteriraku interaktsioonide. Üks põhilisi tunnuseid, mida faagigeneetikud jälgivad, on faagi laikude morfoloogia. Kui tardsöötmetele on külvatud bakterirakud ja osa rakke on nakatunud faagiga, siis infektsioonitsoonis bakterirakud kas lüüsuvad või on nende kasv tugevalt pärsitud. Selle tulemusena pole söötme pind bakterirakkudega ühtlaselt kaetud, vaid sisaldab rakuvabu tsoone. Sõltuvalt faagi genotüübist ja faagi ning bakterivahelisest interaktsioonist on faagilaikude morfoloogia erinev. Metsiktüüpi T faag (r⁺) põhjustab väikeseid laike säbruliste äärtega. Tema kiirelt lüüsiv mutant r aga põhjustab bakterikultuuris suuri laike, mille ääred on selgelt piiritletud.

 

Teine üks sagedamini jälgitavaid faagi fenotüüpe on seotud faagi peremeesringiga. Peremeesringi mutandid on võimelised nakatama ainult teatavaid bakteritüvesid. Näiteks faag T2 nakatab E. coli tüve B rakke. Selle tüve mutant B/2 on T2 infektsiooni suhtes resistentne. Faagi T2 peremeesringi mutant T2h on võimeline nakatama mõlemaid E. coli tüvesid. Nii faagi T2 kui ka tema mutandi T2h laikude morfoloogia on sarnane. Kui aga segada kokku E. coli tüved B ja B/2, tekivad läbipaistvad laigud üksnes bakteri segakultuuri nakatamisel T2h-ga. T2-ga (T2h⁺) nakatamisel on faagilaigud hägused, sest see faagi tüvi on võimeline paljunema ainult algses E. coli tüves B, B/2 rakkude kasv saab toimuda aga ka seal, kus tüve B rakud on lüüsunud.

 

Geneetiline rekombinatsioon faagides.

 

1946-ndal aastal teatasid Delbrück ja Hershey geneetilise rekombinatsiooni toimumisest bakteriofaagidel. Nad nakatasid E. coli tüve kahe erineva faagi T2 tüvega – rh⁺ ja r⁺h (seda protseduuri nimetatakse faagide ristamiseks) ning seejärel nende järglaskonnaga bakteritüvede B ja B/2 segu. Faagide genoomide vahel oli toimunud geneetiline rekombinatsioon. Seda näitas faagilaikude morfoloogia. Genotüüp rh⁺ põhjustab suuri häguseid laike, r⁺h väikeseid ning läbipaistvaid. Lisaks kirjeldati ka suuri läbipaistvaid laike (genotüüp hr) ja ja väikeseid häguseid (genotüüp r⁺h⁺), mis saavad ilmneda ainult siis, kui genoomid on rekombineerunud. Rekombinante oli järglaskonnas 2%, mis näitab, et geenid h ja r paiknevad T2 geneetilisel kaardil teineteisest 2 ühiku kaugusel. Faagide genoomidevaheline rekombinatsioon võib aset leida suvalisel hetkel faagi elutsükli vältel, kui genoom pole pakitud kapsiidi.

 

Faagi geenide peenstruktuur.

 

50-ndate aastate keskel hoogustus faagide geenistruktuuri uurimine. Seymor Benzer kaardistas faagi T4  rII lookuse mutatsioone kahes järjestikku paiknevas geenis rIIA ja rIIB. rII mutandid põhjustasid suurte terava servaga faagilaikude teket. Algse faagitüve puhul olid laigud jälle väiksemad ning säbruliste servadega. rII mutandid tekkisid algsest tüvest spontaanselt, sagedusega 1/100 000 kohta. Mutatsioonisagedust oli võimalik kemikaalide ja UV-kiirguse toimel tõsta. Erinevalt algsest T4 faagist polnud rII mutandid võimelised paljunema E. coli tüves K12. E. coli tüvi B võimaldas aga paljuneda nii algsel kui ka mutantsel faagil. Benzer ristas 2 erinevat rII mutanti E. coli tüve B rakkudes ja analüüsis järglaskonda tüve K12 nakatamisvõime suhtes. Rekombinatsiooni tulemusena tekkis väga madala sagedusega (10^-6) variante, kus rII lookuses oli taastunud algne DNA järjestus (olid võimelised paljunema tüves K12) ja topeltmutante. Rekombinatsioonisagedus oli madal seetõttu, kuna mutatsioonikohad geneetilisel kaardil paiknesid väga lähestikku, kahes kõrvutiasuvas geenis. Juhul, kui kindla faagi kogusega nakatamisel ilmus K12 plaadile 2 faagi laiku, näitas see, et tegemist 4 rekombinandiga, millest 2 olid metsiktüüpi ning 2 topeltmutanti. Rekombinatsioonisageduse arvutamiseks on vaja eelnevalt teada, mitu baktereid nakatavat faagi (infektsiooniühikut) sisaldub ühes ruumalaühikus (seda nimetatakse faagi tiitri määramiseks). Kui algset faagipreparaati oli lahjendatud 10⁷ korda ja kui sellega E. coli tüve B rakkude nakatamisel saadi 100 faagilaiku, siis algne preparaat sisaldas 10⁹ faagi. Seega toimus rekombinatsioon kahe mutantse piirkonna vahel sagedusega 4x10^-9. Antud juhul tuli arvestada ka võimalusega, et mutandid võisid spontaanselt metsiktüübiks reverteeruda. Seetõttu tuli leida ka spontaansete revertantide tekkesagedus ning see rekombinatsioonisagedusest maha arvutada.

 

Edaspidi täiustas Benzer metoodikat ning asus kaardistama deletsioonmutante, mis ei olnud võimelised spontaanselt metsiktüübiks reverteeruma. Kui mõlemal mutandil oli deletsioon samast piirkonnast, ei saanud rekombinatsiooni teel metsiktüüpi tekkida. Kahe mutandi ristamisel ilmnes metsiktüüp üksnes siis, kui deletsioonid ei kattunud. Nii sai erinevate mutantide ristamisel mutatsioonide asukohti geenis juba täpsemalt lokaliseerida. 2400 rII mutandi analüüsimisel lokaliseeriti kokku 308 erinevat mutatsioonisaiti. Samas leiti osades saitides mutatsioone sagedamini kui teistes. Neid saite hakati nimetama kuumadeks punktideks. Benzeri uuringud näitasid, et kõige väiksemaks mutatsiooniüksuseks on 1 aluspaar (bp) ning rekombinatsioon võib toimuda kahe külgneva aluspaari vahel. Tema tööd lükkasid ümber seni levinud seisukoha, nagu oleks geen jagamatu ja seega kõige väiksem mutatsiooni ja rekombinatsiooni üksus.

 

Miks on lineaarse kromosoomiga faagi geneetiline kaart esitatud rõngasmolekulina?

 

Erinevate faagimutantide ristamistel leitud rekombinatsioonisageduste põhjal koostatud geneetiline kaart viitas sellele, et T4 kromosoom on rõngasmolekul. Tegelikult on T faagide kromosoom lineaarne. Millest sellised vastuolulisena näivad tulemused? T4 genoom on 168000 bp suurune. Viriooni pakitud DNA molekulid sisaldavad 3 - 5% ulatuses terminaalseid kordusi. Lineaarse DNA replikatsioonil jäävad molekulide otstesse üksikahelalised alad. DNA replikatsioon toimub ainult ühes suunas (5’®3’) ning seetõttu jääb praimerialune ala lineaarse DNA molekuli otstes pärast täis sünteesimata (praimeriks on RNA ja see kõrvaldatakse DNA molekulist DNA sünteesi järgselt). Selleks, et üksikahelalistele regioonidele sünteesitaks komplementaarsed ahelad, moodustuvad konkatemeerid (sama genoomi lineaarsed kordused). Konkatemeeride lahtilõikamine toimub faagi genoomi kapsiidi pakkimisel konstantse nukleiinhappe pikkuse tagant (ületab genoomi täismahu). Seetõttu on T4 DNA molekulid oma otsmistelt järjestustelt redundantsed (sisaldavad samu järjestusi, näit. abcdefg....wxyzabc) ja  tsirkulaarselt permuteeritud (võivad alata suvalisest geenist, näit abcdef...xyzabc ja defghi...xyzabcdef jne.).

 

Lisaks geneetilistele katsetele kinnitasid T4 kromosoomi terminaalsete järjestuste redundantsust ja DNA molekulide tsirkulaarset permuteeritust hübridisatsioonikatsed. T4 DNA-d töödeldi 3’ eksonukleaasiga. Selle protsessi tulemusena tekkisid molekulid, mis sisaldasid mõlemas otsas üksikahelalisi järjestusi, mis olid komplementaarsed (kleepuvad otsad). Nende otste omavahelise hübridiseerumise tulemusena moodustusid DNA rõngasmolekulid, mida sai vaadelda elektronmikroskoobi abil. Juhul, kui faagi lineaarse genoomi otsad poleks olnud redundantsed, poleks rõngasmolekule üksikahelaliste otste hübridiseerumise tulemusena tekkida saanud. Viidi läbi ka sellised DNA hübridisatsioonikatsed, kus T4 kromosoomid kõigepealt denatureeriti, seejärel aga hübridiseeriti omavahel. Erinevatest DNA molekulidest pärinevate üksikahelate hübridiseerumise tulemusena tekkisid kaksikahelalised DNA rõngasmolekulid üksikahelaliste otstega. Kuna erinevad DNA molekulid sisaldasid erinevaid otsmisi kordusi, polnud omavahel juhuslikult hübridiseerunud DNA ahelate otsad komplementaarsed.

 

Bakteriofaagi FC174 genoom.

 

Faagi FC174 genoomiks on üksikahelaline DNA rõngasmolekul, mis koosneb 5386-st nukleotiidist. Kui arvestada keskmise valgu pikkuseks 400 aminohapet, ei saaks FC174 genoom kodeerida enam kui 4 – 5 valku. Tegelikult kodeerib FC174 genoom 11 erinevat valku. Seda võimaldab geenide kattuvus – erinevad valgud on kodeeritud sama DNA järjestuse poolt erinevates lugemisraamides. Valke kodeerivad lugemisraamid algavad erinevatest kohtadest, sõltuvalt initsiaatorkoodoni (AUG järjestus mRNA-s, TAC järjestus DNA molekulis) asukohast. Näiteks faagi FC174 geen E (rakkude lüüs) sisaldub geenis D (viiruspartikli assambleerumine). Need 2 geeni paiknevad erinevates lugemisraamides. Geen J, mille produkt on samuti viiruspartikli üks komponente, paikneb geeni D järjestuse kolmandas lugemisraamis. Geenide kattuvust on kirjeldatud ka teiste faagide genoomide korral.

 

Faagide heterosügootsus.

 

Faagi genoomiks on kas DNA või RNA molekul. Seega, kui mitte arvestada osade lineaarse genoomiga faagide DNA molekulide otstes asuvate geenijärjestuste redundantsust, sisaldab faagi genoom kõiki geene ühealleelsena. 1951. aastal juhtisid Hershey ja Chase tähelepanu sellele, et teatavatel juhtudel esineb ka faagide puhul heterosügootsus, mis väljendub näiteks faagilaikude morfoloogias – laigud on ebaühtlased, kirjud (ingl. k. “mottled plaques”). T2 r ja r⁺ faagide ristamisel tekitas järglaskond ka laike, millel esines samaaegselt nii metsiktüübi kui ka mutantse faagi laikude omadusi. Selline morfoloogia saab ilmneda ainult siis, kui mõlemad alleelid on korraga esindatud. Heterodupleksi moodustumine on DNA rekombinatsiooni üks vaheetappe. Faagide ristamisel võib r ja r⁺ molekulide rekombinatsiooni tulemusena r lookuses moodustuda heterodupleks, kus üks DNA ahel sisaldab r alleeli ning teine r⁺ alleeli. Heterodupleksit sisaldava DNA molekuli replikatsioonil toimub lahknemine, üks tütarmolekul kannab r ja teine r⁺ alleeli.

 

Eukarüootne viirus HIV.

 

1981. a. kirjeldati Los Angeleses ja New York'is homoseksuaalsetel meestel immuunpuudulikkusest põhjustatud haruldast kopsupõletiku vormi (haigustekitajaks parasiit Pneumocystis carinii, millega normaalne immuunsüsteem toime tuleb) ja Kaposi sarkoomi, mis on samuti haruldane haigus. Sündroomi hakati nimetama AIDS-iks (acquired immune deficiency syndrome). Haigust põhjustab viirus HIV (human immunodeficiency virus). Praeguseks on teada üle 30 miljoni HIV-ga nakatanu. Mõnes Aafrika riigis on nakatunud veerand täiskasvanud elanikkonnast.

 

HIV-i struktuur ja elutsükkel.

 

Viiruspartikkel on ikosaeedrilise kujuga. Kapsiid on kaetud lipiidse membraaniga (ümbrisega), millest ulatuvad välja pulgakommi-kujulised glükoproteiinid (koosnevad 41 kd suurusest tüviosast ja ja 120 kd peast - gp120). HIV-i genoomiks on 2 identset RNA molekuli, mis on koos pöördtranskriptaasiga pakitud valkkesta.

 

Infektsiooni algstaadiumis toimub HIV-i spetsiifiline seondumine gp120 valkude abil T helperrakkude membraanil asuvate CD4 retseptoritega. T helperrakkude funktsiooniks on aktiveerida teisi immuunsüsteemi rakke. Kui need rakud on hävitatud, "kukub kokku" ka organismi immuunsüsteem. CD4 retseptorid asuvad ka teist tüüpi immuunrakkudel, mida nimetatakse makrofaagideks. Kui HIV on rakuga seondunud, liitub tema membraan rakumembraaniga ja rakku siseneb RNA.

 

Genoomselt RNA molekulilt sünteesitakse pöördtranskriptaasi abil dsDNA molekul, mis integreerub integraasi abil raku genoomi. Integreerunud DNA-lt toimub peremeesraku RNA polümeraasi abil transkriptsioon, mille tulemusena saadakse nii mRNA kui ka genoomne RNA. Genoomselt RNA-lt DNA süntees on mitmeetapiline protsess, mille käigus sünteesitakse DNA molekuli otstesse pikad terminaalsed kordused LTR  (long terminal repeats) (vt. joonis 16.21). LTR-e on vaja viiruse genoomi integreerumiseks peremeesraku kromosoomi.

 

Viiruse RNA-lt esimese DNA ahela sünteesil (süntees algab molekuli keskelt) kasutatakse kõigepealt praimerina tRNA-d, mis on komplementaarne HIV RNA järjestusega PBS (primer binding site). Vastav tRNA on juba rakke nakatavates viiruspartiklites viiruse PBS-ga seondunud. Kui DNA süntees on jõudnud molekuli otsani, degradeerib ribonukleaas H (RNaas H) RNA-DNA dupleksist RNA. Seejärel toimub sünteesitud DNA 3' otsas asuva ja genoomse RNA 3' otsas asuva kordusjärjestuse R (repeated sequence) paardumine ning DNA süntees jätkub eelnevalt sünteesitud DNA 3' otsalt. Seejärel degradeerib RNaas H jällegi RNA-DNA dupleksist RNA, väljaarvatud spetsiifilise polü-puriin ala (koosneb peamiselt A-st ja G-st). Allesjäänud RNA järjestus on praimeriks teise DNA ahela sünteesil. Süntees toimub jällegi kaheetapiliselt, nii et algul sünteesitakse genoomist 3' pool, kõrvaldatakse RNA praimer ja tRNA ning seejärel toimub "hüpe". Teise DNA ahela 3' otsas olev PBS hübridiseerub temale komplementaarse PBS järjestusega esimese DNA ahela 3' otsas ja mõlemad käituvad praimeritena. Lõpptulemuseks on kaksikahelaline DNA, mille otstes on pikad kordusjärjestused LTR.

 

HIV-DNA integreerumisel raku genoomi tekitab endonukleaasse aktiivsusega integraas LTR-desse üksikahelalised katked, mille tulemusena tekivad "kleepuvad otsad", kus 3' otsad on 5' otstest lühemad (3' recessed ends). 3' otste kaudu atakeeritakse fosfodiestersidemeid märklaud-DNA-s ning seejärel moodustuvad uued fosfodiestersidemed HIV-DNA 3' otste ning ning peremeesraku genoomse DNA 5' fosfaatide vahel. Üksikahelalised alad täidetakse DNA reparatsiooniensüümide poolt ja lõpptulemusena on HIV-DNA peremeesraku genoomiga kovalentselt seotud. Integreerunud HIV genoom võib olla transkriptsiooniliselt kas inaktiivne või aktiivne. HIV genoomi aktivatsioonil osalevad nii viiruse kui ka peremeesraku valgud.

 

Kuna HIV-i genoomiks on RNA molekul, millelt sünteesitakse peremeesraku genoomi integreeruv DNA molekul, kuulub HIV retroviiruste klassi. HIV-i genoom sarnaneb teiste retroviiruste genoomidega:

                     gag - kapsiidivalgud

                     pol - pöördtranskriptaas, integraas ja ribonukleaas

                     env - ümbrises asuvad glükoproteiinid.

HIV-i genoomis on lisaks veel 6 geeni, mis kodeerivad regulatoorsete funktsioonidega valke. Geenidest väljapoole jäävad LTR järjestused, mis sisaldavad regulatoorseid elemente transkriptsioonifaktorite seondumiseks. Sarnaselt eelpoolkirjeldatud bakteriofaagile FC174 on ka HIV-i geenid kattuvad.

 

Kui inimene on nakatunud HIV-iga, järgneb sellele paarikuine akuutne faas, mille käigus nakatanul esineb palavikku, ta tunneb pea- ja lihasvalu. Sel ajal on haige veres palju HIV-i partikleid. Akuutse faasi järel sümptomid kaovad, partiklite arvukus veres langeb ning viirus lokaliseerub lümfisüsteemi. Latentne periood kestab 8-10 aastat ning sel ajal on organismi immuunsüsteem võimeline HIV-i partikleid hävitama. Lõppfaasis annab organismi immuunsüsteem alla. Selleks ajaks on 75% T helperitest hävinud.

 

Kuigi kuni tänaseni pole suudetud luua ravimeid AIDS-ist vabanemiseks, on võimalik haiguskulgu latentsusperioodi arvel pikendada. Selleks kasutatakse kombineerituna 3 ravimit. 2 neist, Epvir ja Retrovir inhibeerivad pöördtranskriptaasi, kolmas, Crixivan toimib proteaasi inhibiitorina. Proteaasi on vaja HIV-i primaarse translatsiooniprodukti lõikamisel individuaalseteks viirusvalkudeks. Kõiki neid ravimeid on vaja võtta regulaarselt 2-3 korda päevas. Kui ka üks ravimitest ära jätta, tõuseb viiruse hulk organismis kiiresti. Ravimid on kallid ning nende tarvitamine kutsub esile nõrkust, unetust ning iiveldustunnet.   

 

DNA ja kromosoomide molekulaarne struktuur ja DNA-replikatsioon 9-10

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

9. DNA ja kromosoomide molekulaarne struktuur.  

1868. aastal isoleeris Johann Friedrich Miescher rakkudest happelise ühendi ning nimetas selle nukleiiniks. Võrreldes teiste rakust eraldatud komponentidega oli see ühend ebatavaline oma kõrge lämmastiku ja fosfori sisalduse poolest. 1871. aastal need andmed ka publitseeriti, kuid nukleiinhappe rolli geneetilise informatsiooni kandjana mõisteti alles aastakümneid hiljem.

Tõendid selle kohta, et geneetiline informatsioon sisaldub DNA-s.

Kromosoomid koosnevad 2 tüüpi makromolekulidest - valkudest ja nukleiinhapetest. Nukleiinhape võib olla kas DNA (desoksüribonukleiinhape) või RNA (ribonukleiinhape). Enamuse organismide puhul on geneetiline informatsioon kodeeritud DNA nukleotiidse järjestuse poolt. Erandiks on mõned RNA viirused, mille genoomiks on RNA molekul. Viiruste eripäraks on veel see, et kui teiste organismide genoomiks on kaksikahelaline DNA, siis mõnede DNA viiruste genoomiks on üksikahelaline DNA. Ka RNA viiruste genoomiks võib olla kas üksikahelaline või kaksikahelaline RNA.

Kaudsed tõendid selle kohta, et geneetilist informatsiooni säilitatakse DNA-s.

Eukarüootidel paikneb DNA rakutuumas, kromosoomides, enamus valke ja RNA-d aga tsütoplasmas. Kui DNA on sama organismi rakkude piires kõikjal ühesuguse molekulaarse koostisega, siis RNA ja valgumolekulide poolest on varieeruvus suur, sest erinevates rakutüüpides avalduvad geenid erinevalt. Võrreldes RNA-ga on DNA tunduvalt stabiilsem, kuna geneetiline materjal peab säiluma ja kanduma vanematelt järglastele.

Otsesed tõendid selle kohta, et geneetiline informatsioon sisaldub DNA-s, on saadud järgmiste katsetega:

1.         Bakterite transformatsiooni põhjustab DNA

2.         Bakteriofaagi T2 geneetiline informatsioon sisaldub DNA molekulis

 

Bakterite transformatsiooni avastamine.

Transformatsioon on geneetilise informatsiooni ülekandumine ühest bakterirakust teise rakust isoleeritud DNA abil. Transformatsioon võib toimuda ka looduslikes tingimustes. Sel juhul kandub elusrakkudesse surnud rakkudest vabanenud DNA.

Streptococcus pneumoniae (pneumokokk) on patogeenne bakter, mis võib põhjustada kopsupõletikku. Pneumokokid on geneetiliselt muutlikud, mis avaldub nende fenotüübis. Üheks silmatorkavaks tunnuseks on polüsahhariididest koosneva limakapsli olemasolu. Patogeensed on ainult limakapsliga pneumokokid, sest limakapsli tõttu ei suuda peremeesorganism neid hävitada. Kapsli olemasolu või puudumist on võimalik hinnata tardsöötmel moodustuvate bakterikolooniate suuruse alusel. Limakapsliga rakud (S-tüüpi, smooth = sile) moodustavad söötmel suuri, siledapinnalisi kolooniaid, kapslita rakud (R-tüüpi, rough =  kare, konarlik) moodustavad aga väikesi, ebatasase pinnaga kolooniaid. Hiirte süstimisel S-tüüpi rakkudega hiired surid, R-tüüpi rakkudega süstimisel aga jäid ellu. 1928. a. demonstreeris Frederick Griffith, et hiired surid ka siis, kui neid süstiti seguga, mis sisaldas R tüüpi elusaid rakke ning S-tüüpi surmatud rakke. Kapslita rakud omandasid surnud rakukultuurist midagi, mis muutis - transformeeris - nad patogeenseteks kapsliga rakkudeks, võimaldades neil selle tulemusena hiire immuunsüsteemile vastu seista.

1944. a. näitasid Oswald Avery, Colin MacLeod ja Maclyn McCarty, et Streptococcus pneumoniae avirulentsete R-tüüpi rakkude transformeerumist S-tüüpi virulentseteks rakkudeks põhjustas DNA. Nad isoleerisid S-tüüpi pneumokokkidest DNA. Kuna DNA preparaat võis sisaldada ka RNA-d ja valke, töötlesid nad seda erinevate ensüümidega, mis degradeerisid valikuliselt kas DNA (DNaasid), RNA (RNaasid) või valgud (proteaasid) ning uurisid töödeldud preparaadi võimet transformeerida R-tüüpi rakke virulentseteks. Selgus, et transformatsioonivõime oli kaotanud ainult see preparaat, mida oli töödeldud DNaasiga. Järelikult osutus geneetilise informatsiooni kandjaks DNA.

Tõendid selle kohta, et bakteriofaagi T2 geneetiline informatsioon on talletatud DNA-s.

Lisatõendid selle kohta, et geneetilise informatsiooni kandjaks on DNA, avaldasid 1952. a. Alfred Hershey ja Martha Chase. Viirused on rakusisesed parasiidid, kelle elutegevus sõltub täielikult peremeesraku valgusünteesiaparaadist ja energiat genereerivatest süsteemidest. Erinevad viirused paljunevad erinevat tüüpi rakkudes. Bakterirakke nakatavaid viiruseid nimetatakse bakteriofaagideks e. faagideks. Bakteriofaagi genoom (DNA molekul) on pakitud valkkattesse. Hershey ja Chase näitasid, et kui viirus nakatab bakterirakku, jäävad valgud raku pinnale ning rakku siseneb ainult DNA. Seega sisaldub geneetiline informatsioon viiruse taastootmiseks DNA molekulis. DNA-d ja valke on võimalik valikuliselt märkida radioaktiivsete isotoopidega ja hinnata seejärel, kuhu radioaktiivselt märgistatud molekulid pärast jäävad. DNA-d märgistatakse fosfori radioaktiivse isotoobiga ³²P ning valke väävli radioaktiivse isotoobiga ³⁵S. Selleks, et märgistada  faagi T2 valke ja DNA-d, kasvatasid Hershey ja Chase faagiga nakatatud bakterirakke söötmel, mis sisaldas normaalsete väävli või fosfori isotoopide asemel radioaktiivseid. Nii paljundati rakkude kasvatamisel ³⁵S sisaldaval söötmel faagi, kus radioaktiivselt olid märgistatud valgud, DNA aga mitte. Kui söötmesse oli lisatud ³²P, kuid mitte radioaktiivne väävel, sisaldasid paljunemistsükli läbinud faagipartiklid radioaktiivselt märgistatud DNA-d ja valkudesse radioaktiivsust ei lülitunud. Viidi läbi 2 paralleelkatset:

1)        ³⁵S-ga märgistatud T2 partiklitega nakatati E. coli rakke mõne minuti vältel. Seejärel viidi nakatatud rakukultuur segistisse (blender) ning tsentrifuugiti rakud põhja. Enamus radioaktiivsusest jaotus rakupinnalt vabanenud faagi valkude koostises supernatanti.

2)        ³²P-ga märgistatud T2 partiklite puhul viidi läbi sama protseduur. Sel juhul jäi enamus radioaktiivsust pärast rakkude põhjatsentrifuugimist rakkudesse.

Need katsed kinnitasid, et rakkudesse sisenes faagi T2 DNA, mitte aga valguline komponent.

Tänapäevaks on välja töötatud meetodeid, mis võimaldavad rakkudesse viia eelnevalt puhastatud viiruse DNA-d. Vastavat protseduuri nimetatakse transfektsiooniks.

Tõendid selle kohta, et mõnede viiruste geneetiline informatsioon on salvestatud RNA molekuli.

Tubaka mosaiigiviiruse (TMV) genoomiks on RNA molekul. TMV partiklite komponendid (valgumolekulid ja RNA) on võimelised ise assambleeruma, mille tulemusena moodustuvad infektsioonivõimelised viiruspartiklid. 1957. a. avaldas Heinz Fraenkel-Conrat kolleegidega rekonstitutsioonikatse tulemused. Ühe viirustüve RNA ja valgu molekulid segati teise viirustüve RNA ja valgu molekulidega, lasti partiklitel assambleeruda ning seejärel nakatati taimelehti. Järgmise põlvkonna viiruspartiklid olid nii oma genotüübilt kui ka fenotüübilt alati identsed selle viirustüvega, millelt pärines RNA.

DNA ja RNA struktuur.

Nukleiinhape (DNA või RNA) on polümeer, mis koosneb nukleotiididest. Igas nukleotiidis sisaldub fosfaatrühm, 5-süsinikuline suhkur (pentoos) ja tsükliline lämmastikalus. Kui lämmastikalus on ainult suhkrujäägiga seotud, on tegemist nukleosiididega. Näiteks, kui adeniin on seotud riboosiga, on tegemst adenosiiniga. Ühe või mitme fosfaatrühma kovalentsel sidumisel nukleosiidile saadakse nukleotiid. Näiteks nukleotiid adenosiintrifosfaat (ATP) koosneb adeniinist, riboosist ja kolmest fosfaatrühmast. Kui riboosi asemel on suhkrujäägiks desoksüriboos, saame desoksüadenosiintrifosfaadi. DNA puhul on suhkruks desoksüriboos, sellest ka nimetus - desoksüribonukleiinhape. RNA puhul on suhkruks riboos, mistõttu RNA-d nimetatakse ribonukleiinhappeks. RNA molekul on tavaliselt üksikahelaline polümeer, DNA esineb tavaliselt aga kaksikahelalisena.

DNA-s on 4 erinevat lämmastikalust: adeniin (A), guaniin (G), tümiin (T) ja tsütosiin (C). RNA sisaldab tümiini asemel uratsiili (U). A ja G on 2-tsüklilised lämmastikalused - puriinid. T, C ja U puhul on tegemist pürimidiinidega, kus lämmastikuaatomid moodustavad ühe tsükli.

DNA kaksikahela ehitus.

1953. a.  kirjeldasid James Watson ja Francis Crick DNA ruumilise struktuuri. Mudeli loomisel lähtusid nad järgmisest informatsioonist:

1)     Erwin Chargaff kolleegidega analüüsis DNA koostist. Segus, et tümiini kontsentratsioon vastas alati adeniini kontsentratsioonile ja tsütosiini kogus guaniini hulgale. Samuti näitasid nad, et pürimidiinide summaarne kontsentratsioon DNA molekulis vastas kõigil juhtudel puriinide summaarsele kontsentratsioonile. Samas oli molaarne suhe T + A/ C + G liigiti erinev.

2)     Maurice Wilkins'i ja Rosalind Franklin'i poolt saadud DNA röntgenstruktuuri analüüsi tulemused. DNA kristallstruktuuri uuringud näitasid, et DNA on 2-ahelaline, kusjuures ümber molekuli telje kordub regulaarselt (iga 0,34 nm järel) teatav alamstruktuur.

Watson ja Crick esitasid DNA mudeli, mis hiljem leidis kinnitust ka eksperimentaalselt.

DNA on paremalepöörduv 2-ahelaline heeliks. Nukleotiidid polünukleotiidahelas on kovalentselt seotud fosfodiestersidemete kaudu. 2 polünukleotiidahelat on omavahel seotud vesiniksidemete kaudu, mis tekivad lämmastikaluste vahel. Alustevaheline paardumine on spetsiifiline: A paardub T-ga ja G paardub C-ga. Seega koosnevad kõik aluspaarid ühest puriinist ja pürimidiinist. Lämmastikaluste spetsiifilise paardumise määrab ära see, et vesiniksidemed saavad moodustuda ainult kindlate paaride korral. A ja T vahel moodustub 2 vesiniksidet, C ja G vahel 3.

Lämmastikaluste spetsiifilisest paardumisest tuleneb DNA ahelate komplementaarsus. Kui ühe DNA ahela nukleotiidne järjestus on teada, on selle põhjal võimalik kirjutada vastasahela nukleotiidne järjestus. Just DNA ahelate komplementaarsus võimaldab geneetilist informatsiooni säilitada ja kanda põlvkonniti edasi.

Ühte DNA kaksikheeliksi pöördesse mahub 10 lämmastikaluste kaudu paardunud nukleotiidi. Suhkrus tähistatakse C-aatomeid C1', C2', C3', C4' ja C5'. Fosfodiestersidemed polünukleotiidahelas tekivad sel viisil, et kasvava DNA ahela viimase nukleotiidi suhkru vabale 3'C-OH rühmale lisatakse  nukleosiidtrifosfaat, kus fosfaadid on seotud suhkru 5'C-ga. Suhkru 3'C küljes olev OH-rühm ühineb lisanduva nukleotiidi (nukleosiidtrifosfaadi) suhkru 5'C-ga seotud fosfaadi H-aatomiga ning 3'C ning järgmise nukleotiidi fosfaadi vahele tekib fosfodiesterside. Sideme tekkel eraldub vesi ja vabaneb pürofosfaat (PP_i). Nukleiinhapet sünteesitakse 5' otsast 3' suunas. Kuna see on ainuvõimalik DNA ahela sünteesi suund, on DNA ahelad kaksikheeliksis antiparalleelsed. DNA molekuli ühe ahela otsas on vaba 3' OH-rühm, teise ahela otsas aga vaba 5' fosfaat.

DNA kaksikheeliks püsib stabiilsena tänu paardunud lämmastikaluste vahel moodustunud vesiniksidemetele. Lisaks stabiliseerivad DNA-d ka külgnevate aluspaaride vahelised hüdrofoobsed sidemed.

DNA kaksikheeliksi alternatiivsed vormid.

Watsoni ja Crick'i poolt esitatud DNA kaksikheeliksi mudel kirjeldab DNA struktuuri, mis vastab B-DNA vormile. Sellises konformatsioonis on DNA füsioloogilistes tingimustes (vesilahuses, milles soolade kontsentratsioon on madal). Seega on elusrakus DNA molekulid tavaliselt B-konformatsioonis. Kui DNA satub kõrge soolsusega keskkonda või ta on osaliselt dehüdreeritud, moodustub A-konformatsioon. A-DNA sarnaneb B-DNA-le, sest ka siis on tegemist paremale pöörduva kaksikheeliksiga, kuid sel juhul on DNA heeliks tihedam - ühte pöördesse mahub 11 paardunud nukleotiidi. DNA heeliksil on eristatavad suur ja väike vagu. A-DNA puhul on väike vagu laiem ja madalam kui B-DNA puhul. Kas A-DNA-l on ka bioloogilisi funktsioone, on seni küsitav, kuid see kaksikheeliksi vorm on huvipakkuv seetõttu, et sarnaneb väga konformatsiooniga, mis tekib DNA-RNA ja RNA:RNA dupleksite puhul. DNA-RNA dupleksite moodustumine on rakkudes sage protsess.

DNA puhul on kirjeldatud ka vasakule pöörduvat kaksikheeliksit, mida nimetatakse Z-DNA-ks. Nimetus Z-DNA tuleneb sellest, et selle konformatsiooni puhul paikneb suhkur-fosfaat selgroog sikk-sakiliselt. Z-DNA puhul mahub heeliksi täispöördesse 12 aluspaari ning molekuli pinnal on ainult üks sügav vagu. Z-DNA esineb selliste nukleotiidsete järjestuste puhul, kus üksteisele järgnevad vaheldumisi G:C ja C:G aluspaarid:

5'-GCGCGCGCGCGC-3'

3'-CGCGCGCGCGCG-5'

Z-DNA tekkimist soodustavad tsütosiini metüleerimine ning DNA negatiivne superspiralisatsioon. Arvatakse, et üks Z-DNA bioloogilisi rolle võib olla seotud transkriptsiooniga.

Nukleiinhapete primaar- sekundaar- ja tertsiaarstruktuurid.

Kui nukleotiidid on omavahel ühendatud DNA või RNA ahelaks, on tegemist DNA või RNA primaarstruktuuriga. Sekundaarstruktuur tekib siis, kui kaks polünukleotiidahelat moodustavad kaksikheeliksi. Sekundaarstruktuure moodustab ka RNA. Rakkudes on DNA assotsieerunud erinevate valkudega, mille tulemusena DNA kaksikheeliks on volditud ja painutatud 3-mõõtmelisse struktuuri, mida nimetatakse DNA tertsiaarstruktuuriks. Tertsiaarstruktuure on kirjeldatud ka RNA puhul.

DNA denaturatsioon ja renaturatsioon.

Kui vesilahuses olevat DNA-d kuumutada 100°C-ni, katkevad aluspaaridevahelised vesiniksidemed ja DNA ahelad eralduvad teineteisest. Sellist protsessi nimetatakse DNA denaturatsiooniks. Kui üksikahelaid sisaldava lahuse temperatuuri uuesti langetada, paarduvad komplementaarsed ahelad uuesti. Sel juhul on tegemist renaturatsiooniga. Kui denatureeritakse ja renatureeritakse DNA molekulide segu, kus DNA molekulide nukleotiidses järjestuses on erinevusi, võivad renaturatsiooni käigus liituda DNA ahelad, mis ei ole teineteise suhtes täielikult komplementaarsed, s.t. nad ei ole 100%-liselt homoloogilised. Sel juhul moodustub heterodupleks, kus on paardunud ainult komplementaarsed lämmastikalused ning seal, kus homoloogia puudub, jäävad DNA ahelad üksikahelalisteks. 

Kromosoomide struktuur

Viiruste genoom. 

Üldjuhul on viiruse pärilik informatsioon säilitatud ühe nukleiinhappe molekulina, milleks on kas DNA või RNA. Seega võib öelda, et viirustel on üks kromosoom. Viiruse genoomiks on kas üksik- või kaksikahelaline DNA või RNA molekul. Erinevate viiruste genoom varieerub mõnest tuhandest kuni mõnesaja tuhane nukleotiidini. Viiruste genoom on pakitud valkkattesse e. kapsiidi.

Bakterikromosoom.

Nii nagu viirustel, on ka bakteritel kogu geneetiline informatsioon ühes kromosoomis. Bakterikromosoom on rõngasmolekul, mis esineb rakus kõrgelt struktureeritud kujul alas, mida nimetatakse nukleoidiks. Näiteks E. coli kromosoomi kontuurpikkuseks on 1100 mm, raku enda diameeter on aga ainult 1-2 mm, mistõttu kromosoom on ligi 1000 korda lühemaks kokku pakitud. DNA rõngasmolekul on kokku volditud, nii et moodustub 50-100 lingu. Genoomi voltimisel osalevad nii RNA kui ka valgud. Ühe DNA lingu moodustavad ligikaudu 40000 aluspaari. Selline DNA linge sisaldav struktuur suurendab kromosoomi kompaktsust aga ainult 10 korda. DNA kompaktsemaks muutmisel on oluline roll DNA superspiralisatsioonil.

DNA superspiralisatsioon toimub nii bakteri ka eukarüoodi rakus. DNA superspiralisatsioon tekib näiteks siis, kui üks DNA ahel on kaksikheeliksis teise, fikseertitud ahela suhtes roteerunud kas vasaku- või paremasuunaliselt. Kui keerdumine toimub kaksikheeliksi pöördumise suunas (seega paremasuunaliselt), viib see positiivse superspiralisatsiooni tekkele. Sel juhul on DNA ahelad teineteise suhtes tihedamalt kokku keerdunud. Vaba ahela vastassuunaline roteerumine viib negatiivse superspiralisatsiooni tekkele. Negatiivse superspiralisatsiooni puhul on DNA ahelad teineteisest rohkem lahti keerdunud ning võivad isegi eralduda. DNA negatiivsel superspiralisatsioonil on palju bioloogilisi funktsioone seoses DNA replikatsiooniga, rekombinatsiooniga, geenide avaldumise regulatsiooniga. DNA superspiralisatsioonil osalevad ensüümid, mida nimetatakse topoisomeraasideks. Topoisomeraasid viivad DNA kaksikheeliksisse kas üksik- või kaksikahelalisi katkeid ning lõdvendavad või pingutavad kaksikheeliksit. Seejärel viiakse katkenud DNA ahelate otsad omavahel jälle kokku. Bakterites on leitud topoisomeraas II, mida nimetatakse DNA güraasiks. See ensüüm tekitab DNA negatiivset superspiralisatsiooni ja vähendab positiivset superspiralisatsiooni. Topoisomeraas I on vastupidise toimega ja vähendab negatiivset superspiralisatsiooni. 

Negatiivne superspiralisatsioon on oluline bakterikromosoomi kompaktsemaks muutmisel. Keskmiselt on bakterikromosoomis iga kaksikheeliksi 40 täispöörde kohta üks negatiivne superspiraal.

Eukarüootsete kromosoomide struktuur.

Kuigi võrreldes E. coli genoomiga on erinevatel eukarüootidel ainult 2-25 korda enam geene, ületab nende genoomi suurus bakteri genoomi mitu suurusjärku. Suur osa eukarüootsest DNA-st ei ole kodeeriv. Eukarüootidel on genoom jaotunud mitmeks erinevaks kromosoomiks ning enamasti on kõiki kromosoome 2 komplekti. Inimese genoomi moodustava DNA kogupikkus on ligikaudu 1 meeter. Erinevate kromosoomide DNA pikkus varieerub 15-85 millimeetrini. Et kogu selline DNA hulk rakku ära mahuks, peab see võrreldes bakteri DNA-ga olema märksa kompaktsemalt pakitud. Inimese kõige suurem kromosoom on metafaasis ainult 10 mm pikkune ja läbimõduga 0,5 mm.

Eukarüootse kromosoomi keemiline koostis.

Interfaasi rakkude tuumast isoleeritud kromatiin koosneb peamiselt DNA-st ja valkudest. Kromatiini koostises olevad valgud jaotuvad kahte suurde klassi:

1.           Histoonid – aluselised valgud (neutraalse pH juures positiivselt laetud), sisaldavad 20-30% arginiini ja lüsiini, mis on positiivse laenguga.

2.           Mittehistoonsed kromosoomivalgud – tugevalt happelised (neutraalse pH juures negatiivselt laetud).

Histoonidel on põhiline kromosoomi struktuuri kujundav roll. Kõrgemate eukarüootide kromatiin sisaldab ekvivalentses hulgas histoone ja DNA-d. Taimedel ja loomadel on 5 klassi histoone – H1, H2a, H2b, H3 ja H4. Need valgud on olemas peaaegu kõigis rakutüüpides v. a. spermarakkudes, kus nad on asendatud protamiinidega, mis on samuti aluselised valgud. Eritüüpi histoone on kromatiinis kindel hulk, mis on väljendatav molaarse suhtena 1 H1: 2 Ha: 2 H2b: 2 H3: 2H4. Histoonid on DNA-ga spetsiifiliselt komplekseerunud, moodustades kromatiinist struktuurseid alaüksusi, mida nimetatakse nukleosoomideks. Üks nukleosoom on  läbimõõduga 11 nm ning 6 nm kõrgune struktuur. Histoonid on fülogeneetiliselt väga tugevalt konserveerunud. 

Kromosoom koosneb ühest pikast DNA molekulist.

Veenvaid tõendeid selle kohta, et kromosoomi moodustab algusest lõpuni üks DNA molekul (“unineemi mudel”), saadi lambiharjakromosoomide tsütoloogilistel uuringutel. Lambiharjakromosoomid on mikroskoopiliselt jälgitavad amfiibide oogeneesis, I profaasi vältel. Sel ajal on need kromosoomid kuni 800 mm pikkused. Homoloogilised kromosoomid on siis paardunud, olles eelnevalt duplitseerunud, mistõttu nad koosnevad kahest tütarkromatiidist. Lambiharjakromosoomidel on tsentraalne telg, kus tütarkromatiidid on tugevalt kondenseerunud ja lateraalsed lingud, mis kujutavad endast individuaalsete kromatiidide transkriptsiooniliselt aktiivseid piirkondi. DNaasi töötlus põhjustab nii telje kui ka lingude fragmenteerumist. Samas töötlus RNaasiga ja proteaasidega lambiharjakromosoome ei fragmenteeri.

Teatud erijuhtudel (näiteks polüteenkromosoomid äädikakärbse süljenäärmetes) on kromosoomid multineemse struktuuriga, mis tähendab seda, et palju identseid DNA kaksikahelaid on kromosoomis kõrvuti.

Seda, et kromosoom koosneb ühest DNA molekulist, on näidatud ka geelelektroforeesiga, kus uuritava liigi kromosoome on geelis lahutatud nende suuruse järgi ja leitud, et erineva pikkusega DNA molekule on sama palju kui on antud liigil erinevaid kromosoome.

Eukarüootse kromosoomi pakkimine.

Metafaasi kromosoomi kondensatsiooniaste on võrreldes DNA molekuli kontuurpikkusega 10000 kordne. Võrreldes interfaasi kromosoomidega on meioosi ja mitoosi kromosoomid rohkem kondenseerunud. Eukarüoodi kromosoomi kondensatsioonil on eristatavad kolm astet.

1)        DNA nukleosoomne struktuur. Iga 200 nukleotiidi pikkuse DNA lõigu kohta on moodustunud üks nukleosoom, mis sisaldab 146 aluspaari. Nukleosoomid on ühendatud linkeraladega, mis on nukleaaside poolt atakeeritavad. Iga nukleosoomi koostises on 2 molekuli histoone H2a, H2b, H3 ja H4. DNA on nukleosoomis negatiivselt superspiraliseerunud ja keritud 1,75 korda ümber histoonidest moodustunud oktameeri. Histoon H1 on seondunud linkeralaga. Linkeralade pikkus võib varieeruda nii liigiti kui ka erinevates rakutüüpides liigisiseselt. Nende pikkus varieerub 8 aluspaarist 114-ni. Nukleosoomide struktuur geneetiliselt aktiivsetes kromosoomi piirkondades erineb struktuurist geneetiliselt inaktiivsetes piirkondades.

2)        Kromatiini kiud (ingl. k. fibers). Interfaasis on elektronmikroskoobi abil nähtavad 10 nm diameetriga nukleosoome sisaldavad kromatiini kiud. Meioosi- ja mitoosikromosoomide puhul on elektronmikroskoopiliselt tuvastatavad 30 nm diameetriga kiud, mis on tekkinud 10 nm kiudude baasil H1 osalusel. Vastavat struktuuri nimetatakse ka solenoidseks struktuuriks.

3)        Metafaasi kromosoom. Metafaasis saavutavad kromosoomid kõrgeima kondensatsiooni astme. Selle struktuuri moodustumisel, mis tekib 30 nm kiudude kokkupakkimisel, osalevad mittehistoonsed valgud. Moodustuvad radiaalsed lingud, mis on ankurdatud nukleaarsele skeletile. Iga ling sisaldab 50000-100000 aluspaari. Nukleaarne skelett koosneb erinevatest valkudest, mis on seonduvad üksteisega ja DNA-ga. DNA järjestused, mis seonduvad skeletile (scaffold-attached regions - SARs) on mõnisada nukleotiidi pikad ning A-T-rikkad. Iseloomulikud on motiivid, kus 3 või enam A-d või T-d on järjestikku. SAR-idel on oluline roll ka geeniekspressiooni regulatsioonil. 

Kõrgemat järku struktuurid kaitsevad kromosoome murdumast ja omavahel sassi minemast, kui tütarkromatiidid/kromosoomid anafaasis üksteisest lahknevad. Samal ajal takistab kromosoomide kõrge kondensatsiooniaste geenide transkriptsiooni, sest transkriptsioonil osalevad ensüümid ei pääse DNA-le ligi. Seetõttu transkribeeritakse M-faasis ainult väheseid geene.

Interfaasis (G₁, S ja G₂) on kromosoomide kondensatsiooniaste oluliselt vähenenud, kuigi ka sel ajal kinnituvad lingud nukleaarsele skeletile. Samal ajal on kromosoomid seotud ka tuuma sisemembraanile kinnitunud valkudega, mida nimetatakse lamiinideks. Interfaasi kromosoomide kompaktsusaste ei ole ühtlane. Vähemkondenseerunud alad, mida transkribeeritakse aktiivselt, vastavad eukromatiinile. Heterokromatiin on märksa kompaktsem ning transkriptsiooniliselt inaktiivne. Eristatakse konstitutiivset heterokromatiini, mida ei transkribeerita kunagi ning fakultatiivset heterokromatiini, mis formeerub teatud juhtudel eukromatiinist. Konstitutiivne heterokromatiin  sisaldab mittekodeerivaid kõrgelt korduvaid DNA järjestusi. Fakultatiivne heterokromatiin moodustub näiteks imetajatel teise X kromosoomi kondenseerumisel transkriptsiooniliselt inaktiivseks Barri kehakeseks. 

Tsentromeerid ja telomeerid.

Tütarkromatiidide liikumisel anafaasis raku vastaspoolustele on nende tsentromeeridele kinnitunud mikrotuubulitest koosnevad kiud (kääviniidid). Metafaasi kromosoomis on tsentromeeri ala jälgitav kokkusurutud piirkonnana. Erinevate kromosoomide tsentromeeri regioonid - CEN regioonid on konserveerunud. Katsetes S. cerevisiae CEN regioonidega on näidatud, et ühe kromosoomi CEN regiooni asendamine teise kromosoomi CEN regiooniga ei mõjuta rakkude normaalset jagunemist. S. cerevisiae tsentromeer on 110-120 aluspaari pikkune ja sisaldab 3 olulist regiooni. Regioonid I ja III on lühikesed konserveerunud alad, mis piiritlevad regiooni II. Neile seonduvad spetsiifilised valgud, võimaldades kääviniitide kinnitumist tsentromeeridele. Regioon II on ~90 aluspaari pikkune, väga A-T-rikas järjestus (A:T sisaldus >90%).

Telomeeridel on 3 olulist funktsiooni:

1)        Takistavad DNA molekulide otste lagundamist nukleaaside poolt.

2)        Takistavad erinevate DNA molekulide otste kleepumist.

3)        Võimaldavad lineaarsete DNA molekulide otste replitseerumist, ilma et DNA molekulid kaotaksid replikatsiooni käigus otstest geneetilist materjali.

Telomeeridel on unikaalne struktuur, mis sisaldab tandeemsetes kordustes lühikesi nukleotiidseid järjestusi. Kuigi liigiti need järjestused mõnevõrra varieeruvad, on leitud konserveerunud motiivid  järjestusega 5'-T_1-4A_0-1G_1-8-3'. Selgroogsetel on selleks järjestuseks TTAGGG, mille koopiaarv varieerub nii liigiti kui ka liigisiselt sõltuvalt kromosoomist ja ka rakutüübist. Inimese somaatilistes rakkudes sisaldavad telomeerid 500-3000 TTAGGG kordust. Organismi vananedes telomeerid lühenevad. Samal ajal ei toimu telomeeride lühenemist tüvirakkudes ega vähirakkudes.

DNA kordusjärjestused.

Eukarüootne DNA jaotatakse vastavalt korduste olemasolule 3 klassi:

1.         Unikaalsed või ühe koopiana esinevad DNA järjestused - 1 kuni 10 koopiat genoomi kohta.

2.         Mõõdukalt korduvad DNA järjestused - 10 kuni 10⁵ koopiat genoomi kohta.

3.         Kõrgelt korduvad DNA järjestused - enam kui 10⁵ koopiat genoomi kohta.

Esimesse klassi kuulub enamus geene, mis on mõnituhat kuni mõnikümmend tuhat nukleotiidi pikad.

Suur osa genoomist sisaldab mõõdukalt korduvaid DNA järjestusi ning ainult vähestel juhtudel (geenid, mis kodeerivad histoone, ribosomaalset RNA-d ja ribosoomivalke, mida vajatakse rakus palju) on tegemist sama geeni kordustega. Enamasti on mõõdukalt korduvate DNA järjestuste rolliks geeniregulatsioon. Kuna eukarüootse DNA replikatsioon algab paljudelt spetsiifilistelt järjestustelt, mida nimetatakse ori-järjestusteks (origin of replication), paigutuvad ka need mõõdukalt korduvate DNA järjestuste klassi. Siia klassi kuuluvad ka transponeeruvad geneetilised elemendid, mis on olulised geneetilise materjali evolutsioneerumise seisukohalt, kuna nende liikumisega genoomi ühest piirkonnast teise kaasnevad mutatsioonid ja geneetilised ümberkorraldused. Inimesel on kirjeldatud näiteks LINE (Long Interspersed Nuclear Element) ja SINE (Short Interspersed Nuclear Element) perekonda kuuluvad transponeeruvad elemendid. LINE perekonnast on enamtuntud L1 element (6500 aluspaari pikk), mida on genoomi kohta 20000-50000 koopiat, seega ligi 5% kogu inimese DNA-st. SINE elemendid on 150 kuni 300 aluspaari pikad. Kõige detailsemalt on uuritud Alu elementi, mida on 500 000 koopiat genoomi kohta. Nimetus Alu tuleneb sellest, et seda järjestust tunneb ära ja "lõikab" spetsiifiliselt endonuleaas nimetusega AluI.

Kõrgelt korduvad järjestused asuvad enamasti geneetiliselt inaktiivses heterokromatiini piirkonnas, näiteks tsentromeeri lähedal. Kõrgelt korduvatele DNA järjestustele omistatakse mitmeid funktsioone:

1)        Struktuurne või organisatoorne roll kromosoomides;

2)        Osalemine kromosoomide paardumisel meioosis;

3)        Osalemine ristsiirdes (krossingover) või rekombinatsioonis;

4)        Tähtsate struktuurgeenide (histoonide, rRNA, ribosoomivalkude geenide kaitsmine);

5)        Alusmaterjal evolutsiooniks;

6)        Lihtsalt "rämps-DNA", mis on aja jooksul kuhjunud.

Kordusjärjestuste isoleerimine ja identifitseerimine ja lokaliseerimine.

Kõige täpsemat informatsiooni kordusjärjestuste arvu ja iseloomu kohta saadakse genoomi nukleotiidse järjestuse määramisel e. sekveneerimisel. Selleks aga, et lokaliseerida kordusjärjestusi kromosoomis, kasutatakse kromosoomide in situ (kohapeal) hübridiseerimist eelnevalt isoleeritud ja märgistatud kordusjärjestusega. Metafaasikromosoomid kantakse klaasplaadile, viiakse läbi DNA denaturatsioon, nii et DNA muutub üksikahelaliseks ja renatureeritakse üksikahelalise, näiteks fluorestseeruva värviga märgistatud kordusjärjestusega. Fluorestsentsvärvidega märgitud hübridisatsiooniproovide kasutamise puhul nimetatakse protseduuri FISH-iks (Fluorescent In Situ Hybridization). Renaturatsiooni käigus paarduvad DNA ahelad komplementaarsusprintsiibil ning märgistatud üksikahelaline DNA hübridiseerub talle homoloogiliste piirkondadega kromosoomis. FISH-i abil on demonstreeritud näiteks kordusjärjestuse TTAGGG paiknemine telomeerides.

DNA tsentrifuugimisel CsCl gradiendis on võetud kasutusele mõiste "satelliit-DNA". Satelliit-DNA puhul on tegemist kordusjärjestustega, mille A:T ja G:C paaride suhe erineb oluliselt ülejäänud genoomi A:T ja G:C paaride suhtest. Sellised DNA-d sukelduvad võrreldes ülejäänud genoomse DNA fragmentidega CsCl gradienti erinevalt (A:T paaride-rikas DNA on väiksema tihedusega kui G:C paaride-rikas DNA) ning seetõttu on tsentrifuugitopsis lisaks põhilisele DNA fraktsioonile eristatavad veel diskreetsed minoorsed fraktsioonid. Neis sisalduvat DNA nimetatakse satelliit-DNA-ks. Näiteks hiirel on isoleeritud satelliit-DNA, mis hiljem in situ hübridisatsiooni abil lokaliseeriti heterokromatiini regiooni tsentromeeride kõrvale. Hiire genoomis on seda ligi 400 aluspaari pikkust kordusjärjestust 10⁶ koopiat, mis moodustab ~10% genoomist. Ka teiste liikide satelliit-DNA-de puhul on leitud, et need lokaliseeruvad valdavalt tsentromeeri läheduses heterokromatiinis või siis telomeerides.

 

 

10. DNA replikatsioon.

Replikatsioonist üldiselt.

Nukleiinhappe (DNA või RNA) ahel kasvab 5’®3’ suunas. Fosfodiesterside moodustub kasvava nukleiinhappe ahelas oleva viimase nukleotiidi suhkrujäägi 3’-OH rühma ja lisanduva nukleotiidi suhkrujäägi 5’ C-ga seotud fosfaadi vahel. Nukleiinhappe sünteesil lülituvad sünteesitavasse ahelasse nukleotiidid, mis on komplementaarsed matriitsahela nukleotiididega. Sünteesi viivad läbi polümeraasid.

Matriitsina toimib üksikahelaline nukleiinhape. Seega peab kaksikahelaline DNA replikatsiooni initsiatsioonisaidist olema eelnevalt viidud üksikahelaliseks. DNA ahelate eraldumist teineteisest katalüüsib DNA helikaas.

Nukleiinhapete sünteesi läbiviivad polümeraasid:

1.       DNA polümeraas – ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Toimub DNA replikatsioon. Vajab sünteesil praimerit, mis on paardunud matriitsahelaga. Praimeriks on lühike oligonukleotiid (DNA või RNA ahel)

2.       RNA polümeraas – ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela. Toimub transkriptsioon. Transkriptsiooni initsiatsiooniks seondub RNA polümeraas spetsiifiliselt promootorjärjestusega ning seejärel katkevad promootrorpiirkonnas DNA ahelate vahelised vesiniksidemed. Ei vaja initsiatsiooniks praimerit.

3.       Pöördtranskriptaas e. revertaas – ensüüm, mis sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Vajab sünteesil paimerit.

Nukleaasid

Ensüümid, mis degradeerivad nukleiinhapet, lõhkudes fosfodiestersidemeid.

1.       Eksonukleaasid – lagundavad nukleiinhappe ahelat kas 5’ või 3’ otsast.

5’eksonukleaasid

3’eksonukleaasid

2.       Endonukleaasid – lagundavad nukleiinhapet, lõhkudes fosfodiestersidemeid ahelasiseselt

Restriktsioonilised endonukleaasid e. restriktaasid

DNA ligaas – ensüüm, mis liidab DNA ahelate otsad, katalüüsides fosfodiestersideme moodustumist 5’ fosfaadi ja 3’-OH rühma vahel.

DNA replikatsiooni käigus lülitatakse kasvavasse DNA ahelasse inimesel 3000 nukleotiidi minutis, bakteril 30000 nukleotiidi minutis. DNA sünteesil eristatakse 3 etappi - initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon. Replikatsioonil käituvad matriitsina mõlemad DNA ahelad ning replikatsiooni lõpp-produktideks on kaksikheeliksid, milles üks ahel on uus ja teine vana. Seega toimub DNA replikatsioon semikonservatiivse mudeli alusel. DNA replikatsiooni puhul on käsitletud aga ka teisi mudeleid. !950-ndatel aastatel konkureerisid omavahel 3 mudelit.

DNA replikatsiooni mudelid.

1)      Konservatiivne mudel - algselt kaksikheeliksilt sünteesitakse uus kaksikheeliks. Tulemuseks on 2 DNA molekuli, millest ühes on koos vanad ahelad ja teises uued.

2)      Semikonservatiivne mudel - mudel, mis leidis hiljem ka tõestust.

3)      Dispersiivne mudel - mõlemad tütarahelad sisaldavad segu vanadest ja uuesti sünteesitud lõikudest.

Semikonservatiivse mudeli tõestamine.

1958. a. näitasid Matthew Meselson ja Franklin Stahl, et E. coli rakkudes toimub DNA replikatsioon semikonservatiivse mudeli alusel. Lämmastikul on olemas kerge (¹⁴N) ja raske (¹⁵N) isotoop. Normaalne on kerge isotoop. DNA-sse saab lülitada rasket isotoopi sel viisil, et kasvatatakse baktereid söötmel, milles on ¹⁴N asemel ¹⁵N. Saadakse n.ö. rasked DNA ahelad. DNA lahuse tsentrifuugimisel CsCl tihedusgradiendis liiguvad DNA molekulid gradiendi sellesse osasse, mis vastab nende tihedusele. Kui mõlemad DNA ahelad on kerged, jäävad DNA molekulid CsCl gradiendis tsentrifuugitopsis kõrgemale, kus CsCl lahus on väiksema tihedusega. Kui mõlemad ahelad on rasked, on DNA kontsentreerunud allapoole, suurema tihedusega alasse. Kui üks ahel on kerge ja teine raske, kontsentreerub DNA tsentrifuugimisel eelmiste variantidega võrreldes vahepealsesse alasse. Meselson ja Stahl kasvatasid baktereid mitmete põlvkondade vältel ¹⁵N isotoopi sisaldaval söötmel, mille tulemusena olid kõik DNA ahelad rasked. Seejärel viidi rakud jälle kerge isotoobiga söötmesse ja tsentrifuugiti DNA-d, mis oli eraldatud 1, 2 ja 3 põlvkonda kasvanud rakkudest. Esimese põlvkonna rakkude DNA kontsentreerus CsCl tihedusgradiendis ainult ühte, vahepealse tihedusega fraktsiooni. Seega olid kõik DNA molekulid hübriidsed, sisaldades kerget ja rasket ahelat. Teise põlvkonna rakkudest isoleeritud DNA puhul saadi kerge ja vahepealne fraktsioon suhtes 1:1. Kolmanda põlvkonna rakkudest eraldatud DNA puhul oli kerget fraktsiooni 3/4 ja vahepealset ¼. Nii konservatiivse kui ka dispersiivse mudeli puhul oleksid tulemused olnud teistsugused.

Eukarüootse DNA replikatsiooni toimumist semikonservatiivse mudeli alusel näitasid J. Herbert Taylor, Philip Wood ja Walter Hughes oa juurte otste rakkudest eraldatud kromosoomide analüüsil. Rakke kasvatati ³H-tümidiini söötmel, et märgistada DNA radioaktiivselt. Seejärel töödeldi rakke kolhitsiiniga, mis takistab funktsionaalse mitoosikäävi moodustumist. Selle tagajärjel ei toimu mitoosi anafaasis tütarkromatiidide lahknemist. Nii sai visuaalselt jälgida, kuidas radioaktiivsus märgistamisele järgnenud rakkude kasvatamisel mitteradioaktiivsel söötmel põlvkondade jooksul tütarkromatiididesse jaotus. Esimese põlvkonna rakkude puhul oli kõigil kromatiididel radioaktiivne signaal. Teise põlvkonna rakkudes oli ainult üks kromatiididest tütarkromatiidide paaris radioaktiivne.

DNA replikatsiooni visualiseerimine autoradiograafia abil.

1963. a. kirjeldas John Cairns replitseeruva bakterikromosoomi struktuuri. Ta kasvatas baktereid radioaktiivset tümidiini sisaldaval söötmel, eraldas rakkudest võimalikult terved DNA molekulid ning kandis need membraanfiltritele. Membraanfiltritelt tehtud autoradiograafiatel oli näha, et E. coli kromosoom on tsirkulaarne. Replitseeruva DNA puhul ilmnes q-struktuur. DNA replikatsioonil eraldusid DNA ahelad teineteisest spetsiifilises kohas ning mõlemale ahelale sünteesiti komplementaarne ahel. Ka see katse kinnitas DNA replikatsiooni toimumist semikonservatiivse mudeli alusel. Algul arvati, et kromosoomi replikatsioon toimub replikatsiooni alguspunktist ainult ühes suunas.

Hiljem leidis kinnitust kahesuunaline replikatsiooni mudel, mille alusel liiguvad Y-kujulised replikatsioonikahvlid mööda tsirkulaarset kromosoomi vastassuundades. Kahesuunalise replikatsiooni tõestamiseks kasutati meetodit, mis põhines DNA denatureerunud alade kaardistamisel. Katsed viidi läbi bakteriofaag lambda replitseeruva DNA-ga. Kui DNA molekule kuumutada 100°C juures või viia keskkonna pH aluseliseks (pH 11,4), katkevad komplementaarsete DNA ahelate vahel vesiniksidemed. Kuna A:T-paaridel on võrreldes G:C-paaridega üks vesinikside vähem, denatureeruvad A:T-rikkad piirkonnad kiiremini ja neid regioone on võimalik elektronmikroskoobis näha. Faag lambda kromosoomis on A:T-rikkaid järjestusi ainult teatud kohtades ning seetõttu saab neid kohti kasutada füüsiliste markeritena. Schnös ja Inman uurisid elektronmikroskoopia abil faag lambda DNA hargnemiskohtade (Y-kujuliste replikatsioonikahvlite) liikumist denatureerunud piirkondade suhtes ja nägid, et replikatsioonikahvlid eemaldusid teineteisest.  

 

DNA replikatsiooni alguspunkt.

DNA replikatsiooni initsiatsioon on limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide - ori regioonide olemasoluga. Nimetus ori tuleneb inglisekeelsest terminist “origin of replication”. Replikatsiooni initsiatsiooniks on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. Praimerit on vaja selleks, et sünteesitaval polünukleotiidahelal oleks vaba 3'-OH ots, kuhu DNA polümeraas saab liita nukleotiide (vt. fosfodiestersidemete moodustumine DNA ahelas!). Erinevate DNA molekulide replikatsiooni puhul võib praimeriks olla kas DNA või RNA, samuti valguga seondunud nukleotiid. Praimeri sünteesib kas RNA polümeraas või primaas (ingl. k. primase). DNA dupleksi avamine võib toimuda kas transkriptsiooni toimel (faagid T4, T7, mõned ColE1 replikoni sisaldavad plasmiidid E. coli´s) või spetsiifiliste initsiaatorvalkude seondumise tulemusena (DnaA oriC puhul, O oril puhul). Kuna DNA dupleksi avamine on lihtsam A-T rikastest regioonidest, on ori regioonid alati A-T rikkad. Bakterikromosoomi replikatsioon toimub rakutsükli teatud etapil.

DNA replikatsiooni alguspunkt bakteritel.

oriC on 245 aluspaari pikkune ning eubakterites tugevalt konserveerunud. Funktsionaalne oriC sisaldab kindlaid DNA järjestusi, mis esinevad kordustes:

1) DnaA boksid initsiaatorvalgu DnaA seondumiseks (4 koopiat)

                     5’-TTAT(C/A)CA(C/A)A-3’

  

2) 11 koopiat Dam metülaasi poolt äratuntavat järjestust 5’-GATC-3’, nendest 8 asukoht on tugevalt konserveerunud. DNA metülatsiooni kaudu reguleeritakse replikatsiooni initsiatsiooni toimumist rakus.

3) DnaA boksidest vasakule jääb 3 A:T-rikast 13 nukleotiidi pikkust järjestust, mis on määrava tähtsusega DNA ahelate lokaalsel lahtisulamisel. DNA ahelate lahtisulamise tulemusena ilmneb struktuur, mida nimetatakse replikatsiooni mulliks.

Lisaks seonduvad oriC-le mitmed DNA-d painutavad valgud (HU, IHF).

DNA replikatsiooni alguspunktid eukarüootidel.

Erinevalt bakterikromosoomist on eukarüoodi kromosoomidel palju replikatsiooni alguspunkte. Need on jaotunud üle kromosoomi, paiknedes keskeltläbi iga 100 000 aluspaari tagant. Pärmil S. cerevisiae on isoleeritud ARS elemendid (Autonomously Replicating Sequences), mille olemasolu korral on tsirkulaarne DNA pärmis võimeline autonoomselt replitseeruma. ARS elemendid on ~50 aluspaari pikkused A:T-rikkad järjestused.

DNA polümeraasid.

Bakterirakus on 3 DNA polümeraasi – DNA polümeraasid I, II ja III. Polümeraasid I ja II osalevad DNA vigade parandusel (reparatsioonil), DNA polümeraas III on põhiline DNA replikatsiooni ensüüm. Hiljuti (1999-ndal aastal publitseeritud artiklites) on viidatud ka DNA polümeraasidele IV (DinB) ja V (UmuD´₂C). Need ensüümid on seotud vigaderohke DNA sünteesiga olukorras, kus DNA polümeraasi III poolt läbiviidav replikatsioon on blokeerunud DNA kahjustuste tõttu.

Eukarüootsetes rakkudes on samuti mitmeid DNA polümeraase. Imetaja rakkudes on vähemalt 5 erinevat polümeraasi: a, b, d, e, ja g. a ja d töötavad koos ning on seotud tuuma DNA replikatsiooniga ning g mitokondriaalse DNA replikatsiooniga. b ja e osalevad tuuma DNA reparatsioonil.

E. coli DNA polümeraas I.

    

Esimene DNA in vitro süntees viidi läbi 1957. a. Arthur Kornbergi laboris, kasutades E. coli DNA polümeraasi I. DNA polümeraasi I (Pol I) on seetõttu nimetatud ka Kornbergi ensüümiks. DNA replikatsioon toimus keskkonnas, kuhu olid lisatud desoksüribonukleosiid trifosfaadid, Mg²⁺ ioonid, paljundatav DNA ja vaba 3'-OH otsaga oligonukleotiid - praimer, mis oli komplementaarne piirkonnaga matriitsina kasutavast DNA ahelast. DNA polümeraas I katalüüsis fosfodiestersideme moodustumise praimeri 3'-OH rühma ja DNA ahelasse lülitatava nukleotiidi 5'-fosfaadi vahel. Nukleotiidide lülitumist DNA ahelasse testiti sel viisil, et kasutati ³²P-ga märgistatud nukleotiide ja pärast reaktsioonisegu inkubeerimist 30 minutit 37°C juures sadestati nukleiinhape happelises keskkonnas, (mis saavutati perkloorhappe lisamisega) ning mõõdeti radioaktiivsust DNA sademes ja supernatandis. Radioaktiivne märge oli nii supernatandis kui ka DNA sademes. Kuna nukleotiidid antud tingimustes sadeneda ei saanud, näitasid katsetulemused radioaktiivselt märgistatud nukleotiidide lülitumist DNA ahelasse, seega DNA sünteesi toimumist.

Lisaks 5' ®  3'  polümeraassele aktiivsusele on Pol I-el ka 5' ® 3' ja 3´® 5' eksonukleaasne aktiivsus. DNA polümeraas I deletsioonvarianti, millel puudub  5' ®  3'  eksonukleaasne aktiivsus, nimetatakse Klenowi fragmendiks.  

E. coli DNA polümeraas III.

DNA polümeraas III on põhiline bakteri DNA replikatsioonil osalev ensüüm Ta koosneb mitmetest subühikutest. Multiensüümkompleks on V-kujuline, sisaldab 2 apoensüümi. Ülejäänud subühikutes on erinevusi. Apoensüümi moodustavad subühikud a, e ja q. Kuna DNA replikatsioon saab toimuda ainult ühes suunas, 5' ® 3' suunaliselt, replikatsioonikahvlis toimub süntees aga mõlemalt ahelalt korraga, on teine ahel replikatsioonikompleksis linguna kaasas ning sealt toimub süntees Okazaki fragmentidena. Polümeraasi õlad sünteesivad erinevaid ahelaid - vasak õlg pidevalt sünteesitavat  juhtivat ahelat (leading strand) ning parem õlg Okazaki fragmentidena sünteesitavat mahajäävat ahelat (lagging strand).

Selleks, et DNA replikatsiooni läbiviiv ensüümkompleks koos püsiks, on Okazaki fragmentidena sünteesitav DNA ahel linguna replikatsioonikahvlis. g-kompleks võimaldab ensüümikompleksi liikumist valmissünteesitud Okazaki fragmendi otsast järgmise praimeri 3’ OH otsa.  Mutatsioonisagedus Okazaki fragmentidena sünteesitavas DNA ahelas on 20 korda suurem kui pidevalt sünteesitavas ahelas – ensüümkompleks liigub kahjustustest kõrgema sagedusega üle.

DNA polümeraas III subühik e (epsilon) vastutab DNA replikatsiooni täpsuse eest, tal on 3’ ® 5’ eksonukleaasne aktiivsus, mis võimaldab valesti DNA ahelasse lülitatud nukleotiide kõrvaldada (lisab DNA polümeraasile “proofreading” aktiivsuse). b-dimeerid suurendavad polümeraasi protsessiivsust 20 nt/sek kuni 750 nt/sek.

DNA polümeraaside "proofreading" e. korrigeeriv aktiivsus.

DNA sünteesil tekib vigu sagedusega on 10^-4 kuni 10^-6 lülitatava nukleotiidi kohta. Selleks, et geneetilise materjali reprodutseerimise käigus ei toimuks vigade kuhjumist, on DNA polümeraasil korrigeeriv aktiivsus, mille tulemusena ensüümi töö täpsus tõuseb mitu suurusjärku (vigade teke sagedusega 10^-8). Nagu juba eelpool mainitud, vastutab DNA polümeraasi III korrigeeriva aktiivsuse eest subühik e (epsilon). Eukarüootsete DNA polümeraaside puhul on korrigeeriv aktiivsus leitud 3-l polümeraasil (d, e, ja g). a ja d puhul on selleks vaja abistavaid valke.

DNA replikatsioon toimub mõlemalt DNA ahelalt korraga.

DNA süntees toimub ainult 5'® 3' suunaliselt. Samas pikendatakse replikatsioonikahvlis mõlemat DNA ahelt. 5'® 3' suunas kasvava DNA ahela puhul toimub pidev DNA süntees. Seda DNA ahelat nimetatakse juhtivaks ahelaks (leading strand). Teise ahela puhul, mis pikeneb 3’ ® 5’ suunas, toimub tegelikult samuti 5'® 3' suunaline süntees, kuid katkendlikult, lühikeste fragmentidena, mida nimetatakse Okazaki fragmentideks. Seda DNA ahelat nimetatakse mahajäävaks ahelaks (lagging strand).

DNA sünteesi alustamiseks on vaja vaba 3'-OH otsaga praimerit. Juhtiva ahela süntees vajab praimerit ainult replikatsiooni alguspunktis. E. coli puhul sünteesib praimeri DNA primaas (primase) DnaG. Sünteesitav RNA praimer on tavaliselt 10-60 nukleotiidi pikk. Eukarüootide puhul on praimerid lühemad, ligikaudu 10 nukleotiidi pikkused. Okazaki fragmentide puhul on iga fragmendi sünteesiks vaja uut praimerit. Okazaki fragmentide sünteesi initsiatsiooniks on vaja valkkompleksi, mida nimetatakse praimosoomiks. Praimosoom koosneb DNA helikaasist ja primaasist. Praimosoom liigub mööda DNA molekuli, kasutades ATP energiat. DNA helikaas keerab lahti DNA kaksikahela ja DNA primaas sünteesib praimeri. RNA praimeritelt jätkab sünteesi DNA polümeraas III. DNA topoisomeraasid teevad DNA ahelatesse ajutisi katkeid, et soodustada DNA ahelate lahtikeeramist. Üksikahelalist DNA-d stabiliseerivad sellele seonduvad SSB (single strand binding protein) valgud. RNA praimerid asendatakse hiljem DNA-ga DNA polümeraas I poolt ning DNA ahelad ühendatakse fosfodiestersidemete kaudu DNA ligaasi poolt. DNA polümeraas I lagundab RNA praimeri 5'® 3' eksonukleaasse aktiivsusega ja sünteesib asemele DNA ahela 5'® 3' polümeraasse aktiivsusega.

DNA süntees Okazaki fragmentidena avastati 1960-ndatel aastatel Reiji ja Tuneko Okazaki poolt. Nad pulss-märkisid kasvavaid E. coli rakke väga lühikese aja vältel (15 sekundit) radioaktiivse ³H-tümidiiniga (pulse-labeling experiments). Seejärel eraldasid nad märgitud DNA, denatureerisid selle ja lahutasid tsenrtrifuugimisega sahharoosi gradiendis. Enamus märget oli lülitunud lühikestesse, 1000 kuni 2000 nukleotiidi pikkustesse DNA fragmentidesse. Kui teha pulss-märkimist pikema aja jooksul, on märge liikunud fraktsiooni, kus on pikad, E. coli kromosoomile vastavad DNA molekulid. Radioaktiivne tümidiin lülitatakse kromosoomi-suurustesse DNA molekulidesse ka siis, kui esmalt märgitakse rakke lühiajaliselt ³H-tümidiiniga ning seejärel kasvatatakse pikemat aega mitteradioaktiivsel söötmel (pulse-chase experiments). Need katsed kinnitavad, et Okazaki fragmendid on DNA replikatsiooni vaheproduktiks.

Juhtiva ja mahajääva DNA ahela süntees on väga täpselt koordineeritud protsess. Kogu replikatsiooniaparaati, mis liigub mööda DNA molekuli replikatsioonikahvlina, nimetatakse replisoomiks. Replisoom koosneb DNA polümeraas III holoensüümist, mille üks apoensüüm sünteesib juhtivat ahelat ja teine mahajäävat ahelat ning praimosoomist.   

DNA replikatsiooni initsiatsioon oriC-lt bakteris E. coli.

Algne initsiatsioonikompleks moodustub 20-30 DnaA monomeeri sidumisel. ATP juuresolekul toimub avatud kompleksi moodustumine, kusjuures DNA ahelate lahtikeerdumine algab kõige parempoolsemast 13-meerist. Seejärel moodustavad DnaB helikaas ja DnaC denatureerunud DNA-ga prepraimingkompleksi. SSB (üksikahelalise DNA-ga seonduv valk) ja güraasi (topoisomeraas II) juuresolekul jätkub DNA ahelate lahtikeerdumine mõlemas suunas. Järgneb praimeri süntees primaasi DnaG poolt, DNA polümeraas III moodustab replikatsioonikahvli ning edasi toimub oriC-st lähtuv tütarmolekulide süntees mõlemas suunas.

 

DNA ahelate lahtikeeramisel osalevad valgud.

1.       DNA helikaas keerab DNA ahelaid lahti, kasutades ATP energiat. Bakteris E. coli toimub DNA replikatsioon kiirusega 30000 nukleotiidi minutis. Seega peavad DNA ahelad lahti keerduma kiirusega 3000 pööret minutis. E. coli põhiline DNA helikaas on DnaB.

2.       Üksikahelalise DNA-ga seonduvad SSB valgud (single-strand DNA-binding proteins) ei lase üksikahelalisel DNA-l moodustada juuksenõelastruktuure. Viimased takistaksid DNA replikatsiooni toimumist. SSB seondumine on kooperatiivne - ühe monomeeri seondumine stimuleerib järgmiste monomeeride seondumist. Seetõttu kaetakse kogu üksikahelaline DNA kiiresti SSB molekulidega.

3.       DNA topoisomeraasid katalüüsivad DNA ahelatesse ajutisi katkeid, kuid jäävad ise lõigatud molekulide otstega kovalentselt seotuks.

1)      Topoisomeraas I tüüpi ensüümid viivad DNA molekuli üksikahelalise katke ja kõrvaldavad ühe superspiraali. Nad konserveerivad energia, mis vabaneb fosfodiestersideme lõikamisest ning kasutavad seda hiljem sideme taastamiseks. Sellesse klassi kuuluvad ensüümid võivad kõrvaldada nii positiivseid kui ka negatiivseid supersiraale. E. coli topoisomeraas I (geeni topA produkt) kõrvaldab ühe katkega ühe negatiivse superspiraali.

2)      Topoisomeraas II tüüpi ensüümid viivad DNA molekuli ajutiselt kaksikahelalise katke ja lisavad või kõrvaldavad ühe ataki käigus ATP energiat kasutades 2 superspiraali. Nad jäävad DNA otstega kovalentselt seotuks ning hiljem taastavad fosfodiestersidemed.  Kõige paremini on uuritud E. coli ensüümi DNA güraas, mis on tetrameerne valk (koosneb kahest subühikust GyrA ja GyrB). DNA güraasi on vaja E. coli DNA replikatsioonil. Kromosomaalne DNA on negatiivselt superspiraliseeritud. Negatiivseid superspiraale toob DNA molekuli DNA güraas. Negatiivne superspiralisatsioon soodustab liikuva replikatsioonikahvli ees olles DNA ahelate lahtikeerdumist. Kui güraas on inhibeeritud näiteks nalidiksiinhappe või koumermütsiini poolt, bakterites DNA replikatsiooni ei toimu.

Veereva ratta replikatsiooni mudel.

Veereva ratta mudeli alusel toimub paljude viiruste genoomi replikatsioon, geneetilise informatsiooni ülekanne rakust rakku bakterite konjugatsioonil ning ribosomaalse RNA ekstrakromosomaalne amplifikatsioon amfiibide oogeneesis. Nagu juba nimi vihjab, replitseeruvad selle mudeli alusel tsirkulaarsed DNA molekulid. Üks algse DNA ahelatest jääb rõngaks ja on matriitsiks sünteesitavale komplementaarsele DNA ahelale. Replikatsioon algab, kui järjestuse-spetsiifiline nukleaas tekitab replikatsiooni alguspunktis ühte DNA ahelasse katke. DNA ahela pikenemine algab vabast 3'-OH otsast ning 5'-fosfaadiga lõppev ahela ots eemaldub rõngast DNA sünteesi käigus. See ots nagu "veereks" rõngalt maha. Sünteesiproduktideks võivad olla pikad üksik-või kaksikahelalised DNA molekulid, milles võib lineaarsetes kordustes sisalduda mitu koopiat algsest DNA järjestusest. Kui sünteesitakse kaksikahelaline DNA, toimub teise ahela süntees Okazaki fragmentidena. Üksikahela paljundamisel lõigatakse replitseerunud DNA ahel saitspetsiifiliselt replikatsiooni alguspunkti kohal katki ning viiakse rõngasmolekuliks. Ensüümid, mis osalevad DNA replikatsioonil veereva ratta mudeli alusel, on oma põhiolemuselt samad nagu eelpoolkirjeldatud DNA replikatsioonil, kus olid jälgitavad q-struktuurid.

Eukarüootse kromosoomi replikatsioon.

Enamus informatsiooni DNA replikatsiooni kohta on saadud E. coli ja tema viiruste replikatsiooni uuringutest. Eukarüootse DNA replikatsiooni kohta on vähem teavet, kuid ka selle põhjal võib öelda, et nii eukarüoodi kui ka prokarüoodi DNA replikatsiooni põhimehhanismid on samad. Mõlemal juhul toimub replikatsioon semikonservatiivse mudeli alusel, ühelt DNA ahelalt pidevalt, teiselt Okazaki fragmentidena. Siiski on eukarüoodi DNA replikatsioonil ka unikaalseid aspekte.

1)      Eukarüootses rakus toimub DNA süntees ainult rakutsükli ühel etapil, mitte pidevalt nagu see sageli on prokarüootse raku korral, kus bakterid poolduvad kiiremini kui kulub aega kogu kromosoomi replikatsiooniks. Kuna eukarüoodi kromosoomid on võrreldes prokarüoodi kromosoomidega oluliselt suuremad, on neil palju replikatsiooni alguspunkte. Vastasel juhul, kui replikatsioon algaks ainult ühest kohast, kuluks kogu kromosoomi replikatsiooniks liiga palju aega. Näiteks äädikakärbse kõige suurema kromosoomi replikatsiooniks 3,5 minuti jooksul on vaja, et tööd alustaksid korraga 7000 replikatsioonikahvlit. Kiire DNA süntees on vajalik siis, kui rakutuumad poolduvad embrüo varajases arengus iga 9-10 minuti tagant. DNA segmenti, mille replikatsiooni kontrollitakse ühe replikatsiooni alguspunkti ja 2 termineeriva järjestuse poolt, nimetatakse replikoniks. Eukarüoodi kromosoomil on palju replikone. Prokarüoodil võib replikoniks olla terve kromosoom.

2)      Eukarüootidel on juhtiva ja mahajääva DNA ahela sünteesiks 2 erinevat DNA polümeraasi, d juhtiva ahela sünteesiks, a, millel on ka primaasi aktiivsus, viib läbi mahajääva ahela sünteesi. Lisaks osaleb protsessis terve rida abistavaid valke. Näiteks PCNA (proliferating cell nuclear antigen) on polümeraasi d kofaktoriks, mis kiirendab replikatsiooni.

3)      Eukarüootne DNA on koos histoonidega nukleosoomideks organiseeritud. Replikatsiooni ajal nukleosoomi struktuur muutub. Replikatsioonikahvli läbiminekul jaotub nukleosoom ajutiselt kaheks alaosaks. Koos DNA replikatsiooniga S faasis tõuseb hüppeliselt ka histoonide süntees. Seda selleks, et pakkida sünteesitud DNA nukleosoomideks.

4)      Kromosoomid on lineaarsed DNA molekulid. Selleks, et replikatsiooni käigus geneetilist materjali kromosoomide otstest kaotsi ei läheks, on välja kujunenud spetsiifiline mehhanism, mis põhineb telomeeride struktuuri omapäral. Telomeeride pikendamisel osaleb RNA-d sisaldav ensüüm telomeraas. Inimese telomeerid sisaldavad tandeemselt korduvat järjestust TTAGGG. Telomeraas tunneb ära G-rikka järjestuse telomeeri 3’ üksikahelalisest otsast ja pikendab seda 5’® 3’ suunas, kasutades matriitsina kaasas olevat RNA-d. Kui telomeraas on telomeeri otsa piisavalt pikendanud, olles sünteesinud sinna kordusjärjestust, sünteesib DNA polümeraas pikendatud ahelale komplementaarse ahela.

Telomeeride pikkus ja vananemine.

Erinevalt idurakkudest inimese somaatilistes rakkudes telomeraasi aktiivsus enamasti puudub. Kui inimese rakke kasvatada kultuuris, poolduvad nad teatud arvu põlvkondi (tavaliselt 20 – 70 rakujagunemist) ja siis surevad. Rakkude vananedes telomeerid lühenevad. Rakud, kus telomeerid on pikemad, jagunevad rohkem arv kordi kui need, kus telomeerid on lühemad. Kuna somaatilistes rakkudes telomeraas ei avaldu, ongi see põhjuseks, miks telomeerid iga replikatsioonitsükli järel lühenevad. Telomeraas on aktiveerunud vähirakkudes, kus rakujagunemine on väljunud kontrolli alt. Vähirakud on koekultuuris võimelised lõpmatult paljunema, teisisõnu on nad saavutanud surematuse.

Inimestel on kirjeldatud pärilik haigus progeeria, kus indiviidid vananevad enneaegselt. Eriti raske haigusvormi puhul (Hutchinson-Gilfordi sündroom) hakkavad vananemise sümptomid (kortsude teke, kiilaspealisus) ilmnema juba sünnijärgselt ja sellised lapsed surevad teismeliselt. Leebema haigusvormi korral (Weberi sündroom) algab vananemine teismelistel ja haiged surevad 40-ndates eluaastates. Progeeriat põdevatel haigetel on telomeerid lühemad kui normaalsetel indiviididel.