Modifikatsiooniline muutlikkus

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

GEENID + KESKKOND

Modifikatsiooniline ehk mittepärilik muutlikkus on määratud geenide ning keskkonna koosmõjuga ning viib konkreetsete tunnuste avaldumisele (fenotüüp).

 Järglastele päranduvad tunnuste kujunemise piirid. 

Vegetatiivsel paljunemisel on tütartaimed genotüübilt samasugused, tunnuseid mõjutavad keskkonnategurid.

Keskkonnategurid, mis mõjutavad geneetiliselt ühesuguste taimede kasvu – toitained, vesi, päike jm. Alljärgnevalt on muudetud vaid ühte tegurit (toitainete kogust mullas) -  keskkonnamõju taimele on märgatav! 

Toitainete sisaldus normaalne                                                Toitainete sisaldus vähene

Reaktsiooninorm

Reaktsiooninorm – tunnuse (fenotüübilise) muutumise määr.

Variatsioonirida – tunnuse muutumise määra kajastav looduslike objektide järjestatus (näiteks ühe puu erineva suurusega lehed). 

Variatsioonikõver – variatsioonirea graafiline esitus.

Liigi geenifond (liigi kõikide geenialleelide kogum; genofond) määrab ära reaktsiooninormi laiades piirides.

Üksikisendi genotüüp (isendi geenide kogum) aga konkreetse isendi reaktsiooninormi.

Kaksikute meetod

Ühemunakaksikute tunnuste erinevused ja sarnasused võimaldavad eristada pärilikku ja mittepärilikku muutlikkust.

Tunnused sõltuvalt muutlikkuse määrast

Suures ulatuses muutuvad:

Pikkuskasv, kehamass, lihaste treenitus, intellekt (laia reaktsiooninormiga tunnused) 

Vähesel määral:

Silmavärvus, silmade suurus, juuste läbimõõt (kitsa reaktsiooninormiga tunnused) 

Ei muutu üldse:

Silmapõhja muster, sõrmejäljed, sugu (inimesel), vererühmad.

Tunnused sõltuvalt kasulikkusest

Kasulikud:

tingitud refleksid ehk omandatud  käitumisharjumused, kaitsevärvus loomadel.

Kahjulikud:

päriliku eelsoodumusega haigused, arenguhäired, jäävvigastused.

Kopsuvähki haigestumine on seotud geenide ja keskkonnaga (tubakasuits).

Tunnused sõltuvalt kestvusest

Pöörduvad:

Kaovad mõni aeg peale põhjustava teguri kadumist. Päevitus, mälu, lihaste treenitus.

Pöördumatud: 

Säilivad elu lõpuni. Väärarengud, jäävigastused, luude deformeerumine. 

Mendeli hübridiseerimiskatses ilmnenud seaduspärasused

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

Sissejuhatus

Tänapäeval ei kujutaks me ette geneetikat ilma DNA uuringuteta. Geneetilised uuringud on muutunud nii lihtsaks ja kättesaadavaks, et igal inimesel on võimalik saata enda DNA laborisse, et saada rohkem teada oma päritolu kohta või uurida pärilike haiguste eelsoodumuse kohta. Kuid kas teadsite, et geenide pärandumise seaduspärad avastati ligikaudu sada aastat enne seda, kui mõisteti DNA rolli päriliku info salvestamisel? 

Õpieesmärgid

Selle peatüki lõpuks: 

• kirjeldate Mendeli katsetes ilmnenud seaduspärasid;
• seostate Mendeli katsetes ilmnenud seaduspärasid nende geneetilise põhjendusega; 
• lahendate Mendeli seadustel põhinevaid ülesandeid; 
• selgitate Mendeli seaduste rakendusvõimalusi. 

 

Mendeli katsed

Esimesed avastused pärilikkuse seaduspärade kohta tegi Tšehhi munk ja kooliõpetaja Gregor Mendel juba 19. sajandi keskel. Enne Mendeli avastusi usuti, et vanemate tunnused segunevad järglastes sarnaselt nagu sinine ja kollane värv annavad segades rohelise. Mendel arvas seevastu, et pärilikkus tuleneb teatud muutumatute pärilikkusüksuste edasi andmisest. Tema teooria kohaselt on organismis igast tunnusest kaks versiooni, mille organism saab oma vanematelt. Oma teooria katsetamiseks ristas ta kloostriaias herneid ning uuris tunnuste pärandumist (joonis 3.3.5.1.). Pärilikkuse uurimist selliste meetoditega, mida kasutati enne DNA rolli avastamist, nimetatakse tänapäeval klassikaliseks geneetikaks. 

Joonis 3.3.5.1. Gregor Mendel selgitas hernetaimi kasvatades ja uurides välja põhilised tunnuste pärandumise seaduspärad. 

Mendeli katsed hernestega

Mendel uuris oma katsetes seitsme tunnuse pärandumist: herneseemnete värv ja kuju, kauna värv ja kuju, õite värv ja asetus ning taime kasv. Esialgu ristas ta taimi, mis erinesid omavahel ainult ühe tunnuse poolest. Esmalt kasvatas ta eri tunnustega taimi eraldi peenardel. Seeläbi selgitas ta välja, et ühest puhtast sordist taimed annavad alati täpselt samasuguseid järglasi, näiteks rohelise herne taimedelt saab alati roheliste seemnetega järglasi (joonis 3.3.5.2.). 

Joonis 3.3.5.2. Mendel ristas erinevate tunnustega herneid ning uuris tunnuste pärandumist. 

Seejärel ristas Mendel omavahel erinevaid hernesorte, näiteks kollaseid herneid rohelistega. Katse tulemusena selgus, et igast tunnuste paarist leidus üks domineeriv tunnus, mis pärast ristamist saadud järglastes avaldus. Puhtasse sorti kuuluvate kollaste ja roheliste herneste ristamisel saadi ainult kollaseid herneid, krobelisi ja siledaid herneid ristates oli tulemuseks aga vaid siledad herned (joonis 3.3.5.3.).

Joonis 3.3.5.3. Mendel avastas oma katsete käigus, et igas tunnustepaaris leidus üks domineeriv tunnus. 

Ristates esimese järglaste põlvkonna herneid omavahel sai Mendel aga hoopis teistsugused tulemused. Roheliste ja kollaste herneste ristamisel saadud kollaseid herneid omavahel uuesti ristates olid järglastest ¾ kollased ning ¼ rohelised (joonis 3.3.5.4.). Sarnased osakaalud olid iseloomulikud kõigi vaadeldud tunnuste puhul. Sellest järeldas Mendel, et teises põlvkonnas tunnused lahknevad uuesti. 

Joonis 3.3.5.4. Kollaste ja roheliste herneste ristamisel saadud järglased on kõik ühetaoliselt kollased. Saadud kollaseid herneid omavahel ristates lahknevad tunnused uuesti ning 1/4 saadud hernestest on rohelised. 

Simulatsiooni abil saate ka ise Mendeli katseid läbi viia proovida. Selleks vajutage esmalt "Breed" ehk rista, et luua kaks juhuslikku vanemat, ja uuesti "Breed", et näha nende vanemate järglasi. Seejärel valige kaks järglast, keda soovite omavahel ristata, ning vajutage taaskord "Breed", et näha järgmise põlvkonna järglasi. Saate protsessi korrata nii mitu korda kui soovite, kuid 6 põlvkonna järel hakkavad vanemad põlvkonnad kaduma. Kui soovite alustada simulatsiooni uuesti uute juhuslike vanematega, siis uuendage lehte või sulgege see ja avage uuesti. Kas oskate simulatsiooni abiga leida samad seaduspärad, mis Mendel oma katsetega tuvastas?

Mendeli seadused

Tänapäeval saame Mendeli avastusi põhjendada teadmistega geenide toimimisest. Teame, et organismi keharakkudes on kahekordne kromosoomistik ning igast geenist on kaks versiooni, millest üks pärineb emalt, teine isalt. Selliseid geenide versioone nimetatakse alleelideks. Kui organismil on mingi geeni mõlemad alleelid ühesugused, nimetatakse seda homosügootsuseks, kui erinevad, siis heterosügootsuseks. Mendeli esimesed katsed olid sordipuhaste taimedega, mis andsid ainult ühesuguste tunnustega järglasi, järelikult oli seal tegemist homosügootsete ehk samasuguste alleelidega taimedega. 

Erinevate tunnustega organismide ristamise tulemusi on kõige parem selgitada skeemi abil. Kokkuleppeliselt tähistatakse sellisel skeemil puhtast sordist vanemaid tähega P (ladina keeles parentes ehk vanemad) ning nende järglasi tähega F (ladina keeles filii ehk lapsed). Seda, mitmenda põlvkonna järglastega on tegemist, tähistatakse numbriga, näiteks F₁  ja F_2. 

Mendeli järgmistes katsetes oli erinevateks alleelideks näiteks seemne kollane või roheline värvus. Tähistades kollast värvust määrava alleeli A tähega ning rohelist värvust määrava alleeli a tähega, ilmneb, et puhtast sordist kollaste herneste alleelid on AA ja roheliste herneste alleelid aa (joonis 3.3.5.5.). Sugurakkude valmimisel jääb igasse sugurakku üks alleel. See tähendab, et kollaste herneste sugurakkudesse jäävad alleelid A ja A, roheliste herneste sugurakkudesse a ja a. Kollase ja rohelise herne sugurakkude liitumisel on seega ainsad võimalikud kombinatsioonid, mis saavad tekkida, Aa, ehk hernes, kus on üks kollast ning üks rohelist värvust määrav alleel.

Joonis 3.3.5.5. Kollaste ja roheliste puhtast sordist herneste ristamisel on tulemuseks herned, millel on üks kollast, üks rohelist värvust määrav geenivariant. Kuna kollane on domineeriv tunnus, siis on välimuselt kõik herned kollased. 

Hoolimata sellest, et kõigil F₁ põlvkonna hernestel on mõlemad alleelid, on kõik herned väliselt ühetaolised ehk kollased. Järelikult avaldab värvusele mõju ainult üks alleelidest. Seda alleeli, mis ristamise järel avaldub, nimetatakse dominantseks alleeliks, ja teist alleeli nimetatakse retsessiivseks. F₁ põlvkonna järglastel on kõigil üks dominantne ja üks retsessiivne alleel ehk nad on heterosügootsed ning kõik järglased on omavahel identsed. Seda järeldust nimetatakse Mendeli esimeseks seaduseks. 

Vaatame nüüd skeemil, mis juhtub, kui ristata omavahel F₁ põlvkonna heterosügootseid järglasi, kellel on Aa alleelid ehk üks kollast, teine rohelist värvust määrav alleel. Sugurakkude valmimisel jääb kummalgi hernel osadesse sugurakkudesse kollast (A) ja teistesse rohelist (a) värvust määrav alleel. Ühe taime sugurakud liituvad teise taime sugurakkudega, järelikult on uues ehk F₂  põlvkonnas võimalik kolm erinevat kombinatsiooni: AA, Aa ning aa (joonis 3.3.5.6.). Kuna domineeriv tunnus ehk kollane värvus avaldub nii AA kui ka Aa kombinatsiooni korral, retsessiivne tunnus ehk roheline värvus aga vaid aa kombinatsiooni korral, on lihtne näha, miks ¾ järglastest on domineeriva ning ¼ retsessiivse tunnusega. Nende tulemuste põhjal on sõnastatud Mendeli teine seadus: F₂  põlvkonnas lahknevad tunnused kindlates suhetes. 

Joonis 3.3.5.6. F₁ põlvkonna ristamisel omavahel lahknevad tunnused kindlas vahekorras. 3/4 järglastest avaldub dominantne tunnus ning 1/4 retsessiivne tunnus. 

Uurides mitme erineva tunnusega herneste lahknemist järeldas Mendel ka seda, et tunnused päranduvad üksteisest sõltumatult. Seda seaduspära nimetatakse Mendeli kolmandaks seaduseks. Tänapäeval teame, et see seadus kehtib ainult tunnuste puhul, mida määravad geenid asuvad erinevates kromosoomides või samas kromosoomis, kuid üksteisest kaugel. Lähedal asuvad geenid päranduvad koos, kuna need antakse sama kromosoomiga järglastele edasi. Seetõttu avalduvad osad tunnused enamasti koos. 

Mendeli seaduste rakendusvõimalused

Kuigi Mendeli katsed tuginesid herneste sihipärasele ristamisele, on tema avastatud seadustel palju laiem rakendus. Mendeli seadused kehtivad ka looduses juhuslikult sündivate järglaste puhul, sealhulgas inimestel. Samas tuleb silmas pidada, et mitte kõik tunnused ei pärandu vastavalt Mendeli seadustele. Inimestel on puhtaid Mendeli seaduste kohaselt päranduvaid tunnuseid küllaltki vähe. Paljud tunnustest on määratud mitme geeni poolt. Selliseid tunnuseid nimetatakse polügeenseteks. Polügeensed tunnused on näiteks silmade värv, kasv, kehakaal ja nahavärv (joonis 3.3.5.7.). 

Joonis 3.3.5.7. Kasv ja silmavärv on polügeensed tunnused ehk nende tunnuste määramisel osaleb rohkem kui üks geen. 

Enamikul tunnustest ei suru üks alleel teist täielikult maha. Olukorda, kus heterosügoodil avaldub kahe homosügoodi vahepealne tunnus, nimetatakse intermediaarsuseks. Näiteks saab sageli punaste ja valgete õitega lillede ristamisel roosade õitega järglased. Mõnikord võivad aga mõlema alleeli poolt määratud tunnused avalduda samaaegselt. Seda nimetatakse kodominantsuseks ning siis saadakse punaste ja valgete õitega lillede ristamisel hoopis punase-valge-kirjud lilled (joonis 3.3.5.8.). 

Joonis 3.3.5.8. Kui punaste ja valgete õitega taimede ristamisel saadakse roosade õitega taim, on tegemist intermediaarsusega, kui aga punase-valgekirjud õied, siis kodominantsusega. 

Mendeli seadused on siiski olulised, kuna võimaldavad leida mitmete haiguste, näiteks daltonismi ehk punarohepimeduse (joonis 3.3.5.9.) ja hemofiilia ehk vere hüübimatuse esinemise tõenäosust järglastel. Selleks on vaja teada, kas vanemad on selle tunnuse suhtes homo- või heterosügootsed. Katseloomade- ja taimede puhul ristatakse selleks dominantsete tunnustega isendit retsessiivsete tunnustega isendiga. Kui järglased on kõik ühesugused, on tegemist homosügootsusega, kui aga toimub lahknemine suhtes 1:3, siis on tegemist heterosügootse vanemaga. Inimeste puhul loomulikult selliseid meetodeid kasutada ei saa, seetõttu tuleb lasta DNA-d analüüsida või uurida oma sugupuud. 

Joonis 3.3.5.9. Daltonismi ehk puna-rohe-pimesuse korral ei suuda inimene eristada punaseid ja rohelisi toone. Sellisel juhul ei ole inimene võimeline pildil olevat numbrit lugema. 

 

Kokkuvõte 

Keharakkudes on igast geenist kaks versiooni ehk alleeli, mis mõjutavad tunnuse avaldumist. Dominatne tunnus avaldub ka heterosügootidel, retsessiivne tunnus ainult homosügootidel. Mendeli seaduste kohaselt päranduvad tunnused üksteisest sõltumatult ning kindla seaduspärasuse alusel. Homosügootsete vanemate ristamisel on F₁ põlvkonna järglased kõik heterosügootsed ning ühetaolised, F₂ põlvkonna järglastel toimub aga tunnuste lahknemine. Kõik tunnused ei pärandu Mendeli seaduste kohaselt, kuid Mendeli seaduste tundmine aitab mõista mitmete haiguste pärandumist ning arvutada haigete järglaste saamise tõenäosust. 

 

Mõisted

alleel
homosügootsus
heterosügootsus
dominantsus
retsessiivsus
polügeensus
intermediaarsus
kodominantsus

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

CRISPR-Cas9 süsteem

Mine navigeerimisribaleMine otsikasti

CRISPRi mehhanismi üldine skeem

CRISPR-Cas9 süsteem on prokarüootide immuunsüsteemi osa, mis annab resistentsuse mitteomaste geneetiliste elementide, näiteks plasmiidide või faagide suhtes. Selle süsteemi kasutamine biotehnoloogias võimaldab väga kiirelt, täpselt ja odavalt DNA-d muuta ning seepärast peetakse selle avastamist ja kasutuselevõttu üheks suuremaks revolutsiooniks selles valdkonnas.^[1][2]

See omandatud immuunsüsteem koosneb CRISPR-kordusjärjestustest ja endonukleaasidest nagu näiteks Cas9. CRISPR on lühikesi nukleotiidseid kordusi sisaldav lookus või piirkond paljude prokarüootide DNAs, kus asuvad eri viiruste lühikesed nukleotiidsete segmentide järjestused ehk protospacer '​id. Cas9 katalüüsib CRISPRi protospacer '​iga seostunud võõra DNA ahela katkemist. Sellega neutraliseeritakse viiruse kahjulik mõju bakterile.^[3][4]

Taolisi süsteeme on leitud umbes 40%-l prokarüootidest ja umbes 90%-l arhedest, kelle genoom on sekveneeritud. Cas9 avastati CRISPRi süsteemi nukleaasidest esimesena. Pärast seda on avastatud veel teisigi sarnase funktsiooniga nukleaase: Cpf, Csn, Cas3, Cas10 jne.^[5]

Kuna CRISPR-Casi süsteem töötab väga spetsiifiliselt ja ei ole väga kallis, on see väga hea biotehnoloogiline vahend genoomi töötlemiseks. Võimalik, et süsteemiga võib tulevikus hakata ravima pea kõiki geneetilisi haigusi. Näiteks on Hiina teadlased seda süsteemi juba rakendanud eluvõimetu inimembrüo genoomil.^[5]

Sisukord

• 1Ajalugu
• 2Mehhanism
• 3Biotehnoloogiline rakendus
• 4Viited

Ajalugu[muuda | muuda lähteteksti]

Esimesed avastused ja vihjed selle süsteemi kohta tulid 1980ndate lõpus, kui üks Jaapani uurimisrühm kloonis kogemata ühe osa CRISPRi segmendist koos oma uuritava geeniga. Selliste korduvate järjestuste klastrid avastati veel sõltumatult kahes kohas: 1993. aastal Hollandis ja samal ajal ka Hispaanias.^[6] 2005. aastal jõudsid kolm uurimisrühma üksteisest sõltumatult järeldusele, et osa CRISPRi lookuses asuvaid spacer'eid on pärit bakteriofaagide DNAst ja/või võõrast plasmiidist. Nende tulemuste järgi on CRISPRi roll bakteris sarnane omandatud immuunsüsteemiga. Esimesed katselised tõendid selle kohta saadi 2007. aastal, kui näidati, et bakteri Staphylococcus thermophilus '​e omandatud spacer '​id on tõesti pärit teda nakatanud bakteriofaagist.^[7][8]

Mehhanism[muuda | muuda lähteteksti]

Kui tundmatu viirus ründab mikroobi, siis esmane immuunvastus sellele on mingi segment (protospacer) viiruse DNAst salvestada CRISPRi lookusesse. See segment on homoloogiline ehk sarnane viiruse selle piirkonna DNAga. Ensüümid, mis aitavad bakteri genoomi viiruse DNAd integreerida, on Cas1 ja Cas2. Valgumutatsiooni katsed on näidanud, et pärast seda ei lülitu enam uued protospacer '​id CRISPRi süsteemi, kuid samas on väga hästi säilinud mikroobi immuunvastus viirustele, mis on juba varem CRISPRi lookusesse lülitatud.^[9]

CRISPRi klaster genoomis

Praeguseks on juba avastatud mitut eri tüüpi CRISPRi süsteemid (tüüp I, tüüp II, tüüp III), mis kõik töötavad teatud erinevustega. Kuna tüüp II on neist kõige enam uuritud ja nii-öelda näidis-CRISPRi süsteem, siis edaspidi tuleb juttu eelkõige just seda tüüpi süsteemist.

Kompleksi seostumine märklaud-DNAga

Võõras geneetiline materjal salvestatakse mikroobi CRISPRi klastrisse nn protospacer '​itena. Nende pikkused varieeruvad tavaliselt umbes 20 nukleotiidi ümber. Eri spacer '​id DNAs on üksteisest eraldatud lühikeste palindroomsete järjestustega. Sellelt transkribeeritud RNA-d nimetatakse CRISPRi RNA-ks ehk crRNAks (vahel mainitud ka kui guide-RNA ehk gRNA). Kuid lisaks crRNA-le on süsteemi toimimiseks vajalik veel üks teine RNA. Selleks on nn transaktiveeriv crRNA ehk tracrRNA. Selle geen on bakteri genoomis nagu Cas9 geengi CRISPRi lookuse lähedal. Sellist asukohta on vaja, et tuttava viiruse rünnaku korral välja valida just see õige, viiruse DNAga homoloogiline crRNA, ja siduda see Cas9 nukleaasiga.^[10][11]

Kui sama viirus uuesti bakterit ründab, siis esmase immuunvastusena transkribeeritakse bakteri CRISPRi lookusest transkript pre-crRNA. See sisaldab veel paljusid eri protospacer '​eid ja nendega koos tulnud palindroomseid järjestusi, sellest ka eesliide pre. Samal ajal toimub ka tracrRNA süntees. See RNA sisaldab samuti palindroomset järjestust, mis on komplementaarne CRISPRis olevate korduvate järjestustega. Seejärel toimub tracrRNA hübridisatsioon just selle crRNA kõrval oleva palindroomse järjestusega, mis on homoloogiline sissetunginud viiruse DNAga. Korduste kohast tekib seega kaheahelaline ehk dsRNA (double-stranded), mis initseerib ensüümi RNase III lõikama tracrRNAga seostunud crRNAd. Pre-crRNA ja tracrRNA kompleks initseerib veel ka Cas9 ensüümi, mis seostub sellega ja alles siis muutub aktiivseks endonukleaasiks. Moodustub crRNA-tracrRNA-Cas9 kompleks, mis on nüüd valmis seostuma märklaud-DNAga. Kompleks hübridiseerub viiruse DNA selle osaga, mis sisaldab crRNAga homoloogilist järjestust, aga lisaks sellele on väga oluline veel üks järjestus, mis jääb homoloogilise järjestuse 3 otsa. Selleks on nn PAMi (protospacer adjacent motif) ala ehk protospacer '​iga külgnev järjestus, mis on ainult mõni nukleotiid pikk (3–5 aluspaar). See on väga oluline osa süsteemist, sest just see ala takistab CRISPRi süsteemil lagundada enda geneetilist infot, sest taolisi ~20 aluspaaripikkuseid spacer '​iga identseid järjestusi võib juhuslikult esineda ka bakteri enda genoomis. PAMi ala annab bakterile mõista, et tegemist on võõra geneetilise materjaliga, mis võib minna lagundamisele. Tundnud ära selle ala, hübridiseerub crRNA viiruse DNA-le, kusjuures palindroomse kordusega ala hübridiseerub just PAMi alale. Endonukleaas Cas9 katalüüsib nüüd dsDNA fosfodiestersideme katkemist. See toimub samuti PAM ala kõrval. Pärast kaheahelalist katket eemaldub kompleks märklaualt.^[12]

Biotehnoloogiline rakendus[muuda | muuda lähteteksti]

CRISPR-Cas9 süsteem on oma olemuselt küllaltki lihtne, sest süsteemi toimumiseks on vaja ainult kolme komponenti: crRNA, tracrRNA ja Cas9. Teine väga oluline aspekt on, et erinevalt varasematest genoomi töötlemise tehnoloogiatest võimaldab see süsteem bioloogilisi süsteeme töödelda palju täpsemalt, kiiremalt ja odavamalt. 2011.–2012. aastal näitasid Virginijus Šikšnysi ja Emmanuelle Charpentieri juhitud uurimisrühmad, et manipuleerides RNAd Cas9 ensüümis, võivad nad ise valida märklaud-DNA ahela, mida töödelda. Näiteks valida huvipakkuv ala genoomis, tekitada seal kaheahelaline katke ja integreerida katkenud ahelate vahele uus geen. Charpentieri meeskond ühendas Cas9 ensüümis oleva RNA üheksainsaks pikemaks RNAks – guide-RNA ehk gRNAks.

Praeguseks on CRISPR-Cas9 süsteemi rakendatud sellistele organismidele nagu pagaripärm (Saccharomyces cerevisiae), sebrakala (D. rerio), äädikakärbes (Drosophila melanogaster), akselot (A. mexicanum) ja varbuss (C. elegans). Ka hiirtel, taimedel ning ahvide ja inimeste embrüotel.^[13] Lisaks gRNA-le ja Cas9-le läheb vaja ka nn parandusmatriitsahelat, mille järgi DNA poolikud ahelad ära parandatakse. DNA poolikud ahelad tekivad, kui katkenud ahelate vahele on integreeritud huvipakkuv geen. Pärast huvipakkuva geeni integreerumist parandatakse need poolikud ahelad, aga tihtipeale võib nendes nukleotiidne järjestus muutuda. Selle vältimiseks ongi vaja nn parandusmatriitsahelat, et huvipakkuva geeni ümber säiliks sama nukleotiidne järjestus.^[13] CRISPRit on kasutatud korraga kuni 62 geeni lõikamiseks. Et seda teha, oleks vaja just nii palju erinevaid gRNAsid, mis seostuks Cas9 nukleaasiga ja juhiks ensüümi gRNA järgi määratud kohta DNA-l.^[13]

Kui Cas9 ensüümilt kõrvaldada selle nukleaasne aktiivsus, siis – kuigi kogu kompleks seostub määratud kohale DNA-l – ei lõigata seda ahelat, vaid kompleks jääb lihtsalt seotuks selle kohaga. Sellist tehnikat kasutades on huvipakkuvaid geene n-ö välja lülitatud, et uurida eri geenide funktsiooni ja mõju organismidele.^[13] 2005. aastal avaldati artikkel, milles USA evolutsioonibioloogid tegid katse, kus nad kasutasid CRISPRit, et tekitada nn mutageenne ahelreaktsioon. See kandis teatud pigmentatsioonitunnuse 97% efektiivsusega järgmisesse põlvkonda. Teine uurimisrühm kasutas samuti CRISPRit ja tekitas malaariat kandnud sääskedes geenilülituse, mis aitas takistada malaariaviirust kandvate geenide levitamist. Sellest veidi hiljem andis üks uurimisgrupp teada, et oli laboritingimustes teinud teise geenilülituse, mis muutis emased sääsed viljatuks. Selle tulemusel suri terve populatsioon kiiresti välja.^[

CRISPR

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige. CRISPR Mine navigeerimisribaleMine otsikasti CRISPR valk koos DNA fragmendiga CRISPR valk CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; hääldatakse "crisper") ehk klasterdatud regulaarsete vahedega lühikesed palindroomsed kordused on prokarüootide DNA-s esinevad lühikesed kordusjärjestused, mis vahelduvad sissetungivatelt viirustelt või plasmiididelt omandatud ja genoomi sisestatud mittekodeerivate DNA lõikudega. CRISPR järjestustes asuvate viirustelt või plasmiididelt omandatud lõikude pealt transkribeeritakse sissetungiva võõr-DNA-ga komplementaarsed RNA lõigud, mille vahendusel prokarüoodi immuunsüsteem tunneb ära võõr-DNA ning lagundab selle.[1] CRISPR järjestused mängivad olulist rolli bakterite kaitsesüsteemis ning annab aluse genoomi editeerimise tehnoloogiale CRISPR-Cas9 süsteem, mida kasutades on võimalik erinevatesse organismidesse sisse viia püsivaid geenimodifikatsioone.[2] CRISPR/Cas on prokarüootide immuunsüsteemi osa, mis annab resistentsuse mitteomaste geneetiliste elementide, näiteks plasmiidide või faagide suhtes[3] [4] [5].RNA lisab vahejärjestusi, mis aitavad Cas valkudel ära tunda ning seejärel lõigata eksogeense päritoluga DNA-d. Võõr-RNA-d suunavad lõikama Cas valgud[6]. CRISPR järjestused esinevad ligikaudu 40% sekveneeritud bakterigenoomides ning 90% sekveneeritud arhede genoomides[7]. Sisukord 1 Mehhanism 1.1 Kordusjärjestuste omandamine 1.2 Protospeisseri külgnevad motiivid 1.3 Insertsiooni tüübid 2 Biogenees 3 Interferents 4 Viited Mehhanism CRISPR/Cas-i abil omandatud immuunsus on iseloomulik bakteritele ja arhedele. CRIPSR/Cas ennetab bakteriofaagide infektsiooni, konjugatsiooni ning transformatsiooni rakku siseneva võõr-DNA lagundamise kaudu[8]. Kordusjärjestuste omandamine Mikroobidesse tungivate viiruste sissetungil on prokarüoodi esmaseks immuunvastuseks võõr-DNA tabamine ja sisestamine CRISPR lookusesse speisser-järjestusena.[9] Cas1 ja Cas2 valgud on levinud kõikides CRISPR/Cas immuunsüsteemides, mis näitab, et antud valgud on seotud speisserite omandamisega. Mutatsioonidel põhinevad uuringud näitavad, et Cas1 või Cas2 valgu eemaldamisel peatub speisserite omandamine ilma, et häiruks CRISPR-i immuunvastus. [10][11][12][13] Iseloomustatud on mitmeid Cas1 valke, samuti on kokku pandud ka nende struktuur[14][15][16]. Cas1 valkudel on mitmekesine aminohappeline järjestus, kuid kristallstruktuurilt on erinevad valgud sarnased. Kõik eraldatud Cas1 valgud on metalli-ioonist sõltuvad nukleaasid, mis seonduvad DNA-ga sõltumata selle järjestusest[17]. Cas2 valgud omavad kas üksikahelalist ssRNA[18] või kaheahelalist dsDNA endoribonukleaasset aktiivsust.[19][20] Soolekepikese (E. coli) I-E süsteemis moodustavad Cas1 ja Cas2 valgud kompleksi, kus Cas2 valgu dimeer moodustab silla kahe Cas1 dimeeriga. Antud kompleksis täidab Cas2 mitte-ensümaatilise pakkimise rolli[21], seondudes kaheahelalisele võõr-DNA fragmendile. Samal ajal seondub Cas1 DNA üheahelalisele osale ning katalüüsib selle integratsiooni CRISPR kompleksi järjestusse[22][23][24]. Uusi speissereid lisatakse alati CRISPR järjestuse algusse (põhijärjestuse kõvale), mille tulemusena moodustub kronoloogiline loend viirusinfektsioonidest[25]. Integratsiooni täpsuse eest vastutab E. colis histooni sarnane valk, mida nimetatakse integreeritud peremeesfaktoriks ehk IHF (integration host factor)[26]. Protospeisseri külgnevad motiivid Bioinformaatilised analüüsid on näidanud, et protospeisserite külgnevaid järjestusi ei valita juhuslikult, vaid sobituvad lühikeste (3–5-aluspaariliste) DNA lõikudega, mida nimetatakse protospeisseriga külgnevateks motiivideks ehk PAM-ideks. CRISPR/Cas süsteemide analüüsid näitavad, et PAM-id on olulised I ja II tüüpi, kuid mitte III tüüpi omandamissüsteemidele[27][28][29][30][31][32]. I ja II tüüpi süsteemide puhul jäetakse protospeisserid välja positsioonis, kus PAM on järjestuse kõrval ning teisel pool speisserit tehakse lõige joonlauamehhanismi abil. Selle tulemusena säilitatakse konstantne speisser-järjestuse suurus CRISPR-is[33][34]. PAM järjestuse konserveeritus erineb CRISPR/Cas süsteemide vahel, mis annab põhjuse oletada, et see on evolutsiooniliselt seotud Cas1 valgu ning CRISPR-i põhijärjestusega[32][35]. PAM järjestus on oluline speisseri insertsioonil I-E süsteemides. Antud järjestus sisaldab tugevalt konserveerunud lõpp-nukleotiidi, mis on protospeisseri esimese nukleotiidi kõrval. Viimasest nukleotiidiist saab lõpliku järjestuse esimeseks otseseks korduseks[13][36][37]. Antud nähtus viitab sellele, et speisseri omandamise süsteem toodab üheahelalisi DNA üleulatuvaid otsi kordusmotiivis. PAM-is tekivad üleulatuvad otsad teisest kuni viimase positsioonini speisseri insertsiooni tulemusena. Siiski ei ole seesugune mehhanism levinud kõikides CRISPR/Cas süsteemides, kuna PAM-id ei ole teistes organismides viimases positsioonis samaväärsel tasemel konserveerunud. Tõenäoliselt genereeritakse teistes süsteemides kordusjärjestuse lõppu ja protospeisseri omandamise käigus tömp ots.[35] Insertsiooni tüübid Sulfolobus solfataricus'e CRISPR järjestuse analüüsi tulemusel on selgunud, et kanoonilised speisseri insertsioonid on oluliselt kompleksemad – üks kuuest CRISPR lookusest inserteerib uued speisserid juhuslikult üle kogu CRISPR järjestuse.[34] Paljud CRISPR järjestused sisaldavad mitmeid speissereid, mis pärinevad ühest ja samast faagist. Mehhanism, mis on selle fenomeni taga, avastati I-E tüüpi E. coli süsteemis. Märgatavat suurenemist speisserite omandamisel täheldati kohtades, kus speisserid omasid juba eelneva sihtmärgina faagi, olenemata protospeisseri mittekattuvusest. Taoline seondumine nõuab Cas valkude olemasolu nii omandamise kui ka omavahelise suhtluse protsessides. Uued speisserid omandatakse alati sellele ahelale, kus on ühilduv speisser-järjestus[13][36][37]. Kirjeldatud nähtus tõestatas hüpoteesi, et speisserite omastamise kompleks liigub pärast seondumist võõr-DNA-l, et leida uus protospeisseri järjestus[37]. Biogenees CRISPR-RNA (crRNA), mis juhatab võõr-DNAga kokkupuute ajal Cas nukleaasi sihtmärgini, peab olema sünteesitud CRISPR järjestuse alusel. crRNA transkribeeritakse algselt ühe osana suurest transkriptist, mis sisaldab mitmesuguseid CRISPR-järjestusi. Cas valgud lõikavad algset transkripti ning moodustuvad crRNA-d. crRNA-de tootmise mehhanism varieerub erinevates CRISPR/Cas süsteemides.[38] I-E ja I-F tüüpi süsteemides tunnevad Cas6e ja Cas6f valgud ära DNA lingud, mis on moodustunud indetsete korduste seondumise tulemusena ning mis moodustavad crRNA. Antud Cas valgud lagundavad algse transkripti paardunud regiooni otstest, mille tulemusena jääb alles üks crRNA ning väikesed lõigud paardunud kordusjärjestuste regioonist.[39] III tüüpi süsteemid kasutavad ka Cas6 valku, kuigi kordusjärjestused ei tooda DNA linge. Algne transkript keeratakse ümber Cas6 valgu, millega lubatakse DNA lõikamist kordusjärjestusest ainult ülesvoolu[40][41][42]. II tüüpi süsteemides puudub Cas6 valku kodeeriv geen, mistõttu kasutatakse DNA lõikamiseks RNaasIII. Funktsionaalsed tüüp II süsteemid kodeerivad eriti väikseid RNA-si ehk transaktiveerivaid crRNA-si (tracrRNA), mis on komplementaarsed kordusjärjestusele. TracrRNA transkriptsioon ja primaarne CRISPR transkript toovad endaga kaasa aluspaaride paardumise ning dsRNA moodustumise, mis on RNAasIII sihtmärgiks ning mille käigus toodetakse crRNA-si.[10] CRISPR immuunsuse kolm tüüpi. Cas1 ja Cas2 valgud tunnevad protospeisseite abil ära rakku tunginud võõr-DNA (1). Protospeisser ligeeritakse kordusjärjestusele, mis asuvad põhijärjestuse kõrval (2). Üheahelaline pikendamine parandab CRISPR järjestuse ja duplitseerib kordusjärjestust. crRNA protsessimise ning interferentsi staadiumites esinevad erinevused, mis jagab CRISPR süsteemid kolmeks (3). Cas geenid lõikavad esmast CRISPR transkripti, mille tulemusena saadakse crRNA-d (4). I tüüpi süsteemis lõikavad Cas6e/Cas6f valgud ssRNA ja dsRNA molekule, mis moodustavad juuksenõela struktuure. II tüüpi süsteemis kasutatakse dsRNA moodustamiseks tracrRNA-d; lõikamine toimub Cas9 ja RNaasIII abil. Tüüp III süsteemis kasutatakse Cas6 homoloogi, mis ei vaja lõikamiseks juuksenõela struktuuri olemasolu (5). II ja III tüüpi süsteemides lõigatakse molekule lisaks veel kas 5´ või 3´ otsest, mille tulemusena saadakse küps crRNA (6). Saadud crRNA-d seonduvad Cas valguga, moodustuvad interferentsi kompleksid (7). Tüüp I ja II süsteemides on valgu ja PAM järjestuse interaktsioon kriitilise tähtsusega võõr-DNA lagundamiseks. Tüüp III süsteemis pole seesugune interaktsioon vajalik (8). Erinevalt teistest süsteemidest ei sisalda crRNA täispikkuses speisserit, vaid lühendatud otsaga speisserjärjestust[43]. crRNA-d moodustab Cas valkudega seostudes ribonukleotiidide kompleksid, mis suudavad ära tunda võõr-DNA-d. crRNA-d ei eelista kodeerivat ega ka mittekodeerivat järjestust, mis viitab RNA-suunatud sihtmärk-DNA süsteemile[44]. I-E tüüpi kompleksid vajavad ühe crRNA-ga seondumiseks viit Cas valku[45][46]. Interferents Interferentsi staadiumis tunnevad I tüüpi süsteemides PAM järjestuse ära crRNA-ga komplementaarsed järjestused, mis on vajalikud ka crRNA-ga kokkusulamisel. I tüüpi süsteemides toimub aluspaaride seondumine crRNA-ga ja protospeisseri signaaline konformatsioonilised muutusted. Käivitatud kaskaad toob endaga kaasa Cas3 valgu ja DNA degradatsiooni.[43] II tüüpi süsteemides tuginetakse interferentsil vaid ühele multifunktsionaalsele Cas9 valgule. Cas9 vajab nii crRNA-d ja tracrRNA-d. DNA lõikamiseks kasutatakse kahekordseid HNH ja Ruvc/RNaasH-sarnaseid endonukleaasseid domeene. Vajalik on ka PAM-i ja faagi genoomi nukleotiidide vaheline seondumine. Antud süsteemides tuntakse PAM järjestusi ära samal ahelal, kus asub ka crRNA (mis on vastupidine ahel tüüp I süsteemides).[47] Sarnaselt tüüp I süsteemidega kasutatakse ka III tüüpi süsteemides crRNA-ga seostumiseks kuut või seitset Cas valku[48] . Tüüp III süsteeme analüüsiti bakteritel S. solfataricus ja P. furiosus ning selgus, et sihtmärkmolekuliks on faagi DNA asemel mRNA[49][48], mis teeb antud süsteemi ainulaadseks RNA genoomiga faagide tabamiseks[17]. Mehhanismid, mis eristavad inteferentsi käigus organismile omast DNA-d võõr-DNA-st, on kodeeritud crRNA-des ning on seetõttu kõigis kolmes tüübis sarnased. Erinevat tüüpi protsesside jooksul sisaldavad kõik crRNA-d speisser-järjestusi ning teatud hulka kordusjärjestusi mõlemast protospeisseri otsast. Osaline kattuvus järjestuste vahel ei luba CRISPR/Cas süsteemil võtta sihtmärgiks kromosoomi nukleotiidide paardumist väljaspool speisser-järjestuse signaale, hoides sellega ära enda DNA lõikamise[50].

Morgani seadus

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

Morgani seadus

Geenide aheldatuse ja geenivahetuse avastas Thomas Hunt Morgan (1866 - 1945) 20. sajandi algul. Morgani uuringute lemmikobjektideks oli äädikakärbes. Äädikakärbsed sobivad geneetilisteks uuringuteks sest:

• neil on vähe kromosoome
• paljunevad kiiresti
• neid on odav pidada
• neil on palju järglasi
• tunnused avalduvad selgelt.
• äädikakärbse geenid on kaardistatud
• äädikakärbes on bioloogiliselt üks läbiuurituimaid organisme

Morgan lõi pärilikkuse kromosoomiteooria:

• Geenid asuvad kromosoomides.
• Geenid on kromosoomide lineaarselt järjestatud (geenidel on kromosoomides kindel järjekord).
• Ühes kromosoomis asetsevad geenid päranduvad enamasti koos ehk aheldunult.
• Geenide aheldatus pole absoluutne, see võib muutuda geenivahetuse käigus.
• Geenivahetus ja aheldunud pärandumine sõltub geenide omavahelisest kaugusest kromosoomis:
• mida lähemal on geenid üksteisele, seda suurem on tõenäosus, et nad päranduvad koos;
• Mida kaugemal on geenid üksteisest, seda suurem on võimalus, et nad lahknevad geenivahetuse käigus.

Geenivahetuse olemus:

• toimub meioosi esimeses profaasis
• homoloogilised kromosoomid vahetavad vastastikku osasid
• toimub DNA molekulide katkemine ja osade vahetus

Geenivahetuse tähtsus:

• tekivad uued geenikombinatsioonid
• tagatakse pärilik muutlikkus
• moodustub materjal loodusliku valiku jaoks populatsioonides
• tekivad rekombinantsed isendid (geenivahetuse tagajärjel moodustunud isendid)

Aheldunud geenide pärandumise olemus ja tähtsus:

• Põhineb faktil, et ühes kromosoomis lähestikku asuvad geenid päranduvad koos.
• Tagab selle, et evolutsioonis ennast õigustanud geenikombinatsioonid jäävad muutumatuks.
• Välditakse kõikvõimalike kahjulike geenikombinatsioonide teket.
• Sarnase toimega geenid (geeniperekonnad) peksid päranduma koos.

Mendeli seadused

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

Mendeli seadused

Gregor Mendel (1822-1884) oli Brno kloostri munk ja kohaliku reaalgümnaasiumi loodusloo õpetaja, kes:

• Teostas katseid erinevate taimehübriididega st. ristas erinevate tunnustega taimi.
• Võttis kasutusele geneetika ülesannete ja skeemide sümbolid (kasutusel tänapäevani).
• P - parentes (vanemad)
• F - filia, filialis (tütar ja poeg)
• X - ristamine
• 0-> - isane
• +0 - emane
• F₁, F₂, F₃ - põlvkonnad
• Rakendas statistikat tulemuste töötlemiseks s.t. kõik Mendeli seadused on statistilise iseloomuga.
• Mendel avastas ja sõnastas pärilikkuse üldised seaduspärasused ning neid tuntakse tänapäeval Mendeli seaduste ehk mendelismi nime all.
• Mendel teostas katseid aedhernega (hea valik).
• seemnete värvus (kollane – dominantne, roheline – retsessiivne)
• seemnete kuju (sile – dominantne, krobeline – retsessiivne)

Mendel ristas alguses ainult ühe tunnuse poolest erinevaid hernesorte ning jälgis selle tunnusepaari esinemist hünriidsetes põlvkondades. Hiljem uuris Mendel ka kahe ja mitme tnnuse samaaegset pärandumist.

Monohübriidne ristamine kus vaadeldakse ühe tunnuse kujunemist järglastel.

Mendeli esimene seadus (ühetaolisuse seadus) – homosügootide omavahelisel ristamisel on moodustunud esimene järglaspõlvkond geno- ja fenotüübiliselt ühtne.
Mendeli teine ehk lahknemisseadus – heterosügootide omavahelisel ristamisel toimub järglaspõlvkonnas lahknemine fenotüübilise suhtega 3:1 või 1:2:1 ja genotüübilise suhtega 1:2:1.

Erandid :

• Intermediaarsus ehk tunnuste vahepealne avaldumine.
• Kodominantsus ehk üheaegselt avalduvad mõlema vanema tunnused.

Dihübriidne ristamine:

• vaadeldakse kahe tunnuse kujunemist järglastel;
• dihübriidne ristamine on võrreldav kahe sõltumatu monohübriidse ristamisena.

Mendeli kolmas seadus – di(polü)hübriidsel ristamisel moodustuvad F₂ põlvkonnas vanemate tunnuste kõikvõimalikud kombinatsioonid. Kusjuures ühe alleelipaari lahknemine ei mõjuta teise alleelipaari lahknemist.

NB! Mendeli seaduste kehtimiseks peavad geenid asuma eri kromosoomides.

Inimese dominantsed ja retsessiivsed tunnused:

Tunnus	Dominantne	Retsessiivne
Tedretähnid	On	Ei
Huuled	Paksud	Kitsad
Silmad	Suured	Väikesed
Juuksekasvupiir	Kolmnurkne	Sirge
Keel	Võime rulli keerata	Suutmatus rulli keerata
Kõrvanibu	Lahtine	Kokku kasvanud
Nina	Kongus	Sirge
Karvakasv	Tugev	Nõrk
Kiilanemine	Varajane	Ei
Käe kasutamine	Parem	Vasak
Sõrmed	Kõverad	Sirged

Mendeli seaduste kehtivuse eeldused:

• vanemorganismid peavad uuritavate alleelide suhtes olema homosügoodid;
• kõikide genotüüpidega indiviidid peavad olema võrdse eluvusega;
• järglaste arv peab olema piisavalt suur;
• Mendeli seaduste kehtimiseks peab arvestama ka tegureid, mis mõjutavad geenide avaldumist.

Mendelismi põhiseisukohad:

• Mendelism eitab kromosoomide ristsiiret ehk krossingoveri.
• Uued tunnuskombinatsioonid tekivad tänu kromosoomide sõltumatule lahknemisele ja sugurakkude ühinemisele viljastumisel.