Molekulaargeneetika, mitokondrite ja kloroplastide geneetika 17-20

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

17. Transponeeruvad geneetilised elemendid.

 

Geneetiline rekombinatsioon võib toimuda ka DNA homoloogia puudumisel. Sellises protsessis osalevad mobiilsed DNA elemendid - transposoonid ja IS elemendid ning vastavat sündmust nimetatakse transpositsiooniks. Transpositsiooni toimumiseks pole vaja ei RecA valku ega homoloogiat retsipiendi ning doonori DNA vahel. Transposooni või IS elemendi transponeerumist võimaldab mobiilse DNA elemendi poolt kodeeritud transposaas.

 

Transponeeruvate DNA elementide olemasolu leidis esmalt kinnitust Barbara McClintock’i geneetilistes katsetes maisiga 40-ndatel – 50-ndatel aastatel. Alles uute meetodite kasutuselevõtmisel 60-ndatel ja 70-ndatel aastatel saadi kinitavaid tõendeid mobiilsete DNA elementide esinemise kohta ka teistes organismides.

 

Transponeeruvad elemendid bakterites.

 

IS elemendid on väikesed, 800-2000 bp pikkused DNA elemendid, mis kodeerivad ainult transpositsiooniks vajalikke valke. IS elementide otstes on pöördkordusjärjestused (inverted repeats, IR). Tavaliselt on need 16-40 nukleotiidi pikkused. Mutatsioonid IR-des muudavad elemendi transpositsiooniliselt inaktiivseks. Mõlemale poole IS elemendist jäävad lühikesed, enamasti mitte üle 10 nukleotiidi pikkused otsekordusjärjestused (direct repeats, DR), mis tekivad märklaud-DNA duplitseerumise käigus. Bakterikromosoomis võib sama IS elementi olla mitu koopiat. Näiteks IS1 esineb E. coli kromosoomis 6 – 10 koopiana. IS elemendid IS2 ja IS3 asuvad nii F plasmiidis kui ka kromosoomis. See võimaldab F plasmiidil homoloogilise rekombinatsiooni teel integreeruda E. coli kromosoomi.

 

Transposoonid (Tn) on IS elementidest suuremad ning kodeerivad lisaks transpositsiooniga seotud valkudele ka teisi valke, näiteks ensüüme, mis tagavad resistentsuse antibiootikumidele või raskemetallidele. Tn-id võivad olla komplekssed, sisaldades mõlemas otsas IS elementi. Näiteks Tn5, mis kannab kanamütsiini resistentsusgeene, sisaldab mõlemas otsas IS elementi IS50. Tn3 perekonda kuuluvad transposoonid IS elemente ei sisalda. Sarnaselt IS-dele on nende otstes lühikesed, 38 bp pikkused IR-id.

 

Otsekordusjärjestused (DR-id) esinevad nii transposoonide kui ka IS elementide puhul. Transpositsiooni käigus lõhutakse fosfodiestersidemed märklaud-DNA-s nii, et tekivad lühikesed üksikahelalised otsad. Mobiilne DNA element lülitub lõikekoha vahele ning üksikahelalistele märklaud-DNA lõikudele sünteesitakse komplementaarsed DNA ahelad. See seletabki, miks märklaud-DNA järjestus transpositsiooni käigus duplitseerub.

 

Transpositsioon võib toimuda kas replikatiivselt, nagu näiteks Tn3 tüüpi elementidel, kus transpositsiooni käigus toimub transponeeruva elemendi replikatsioon, nii et lõpptulemusena jääb koopia transposoonist nii doonori  kui ka retsipiendi molekuli, või siis lõika ja kleebi (cut and paste) printsiibil, kus Tn või IS lõigatakse doonormolekulist välja. Tn-de ja IS-de inserteerumine põhjustab sisenemiskohas paiknevete geenide inaktivatsiooni. Mobiilsete DNA elementide transponeerumine võib põhjustada ka suuremaid geneetilisi ümberkorraldusi, mille tulemuseks on inserteerunud elemendile külgnevate DNA lõikude ümberpöördumine (inverteerumine) või väljalangemine (deleteerumine). Mõnede mobiilsete DNA elementide otstes on otsast väljapoole suunatud promootorjärjestused, mis võivad aktiveerida mobiilse DNA elemendiga külgnevate geenide transkriptsiooni.

 

Komplekssed transposoonid.

 

Komplekssed transposoonid, nagu juba eelpool mainitud, sisaldavad mõlemas otsas IS elementi. Tn9 (kodeerib resistentsust klooramfenikoolile) sisaldab elemendi mõlemas otsas samas orientatsioonis elementi IS1. Tn5 puhul (kodeerib resistentsust kanamütsiinile, streptomütsiinile ning bleomütsiinile) on IS50 transposooni otstes erinevates orientatsioonides. Tn10 kodeerib resistentsust tetratsükliinile ning ka tema puhul on IS elemendid (IS10) otstes vastassuunaliselt orienteeritud. Tn5 puhul on otstes paiknevad IS elemendid funktsionaalselt erinevad - transpositsiooniliselt aktiivne on ainult IS50R. IS50L ei kodeeri aktiivset transposaasi, kuna sisaldab transposaasi geenis mutatsiooni.

 

Mobiilsete elementide transponeerumine toimub bakterirakus tavaliselt väga madala sagedusega. Vastasel korral suureneks rakkudes transpositsiooniga kaasnevate geneetiliste ümberkorralduste sagedus, mille tulemusena võivad inaktiveeruda rakule eluliselt tähtsad geenid. Tn5 kodeerib repressorvalku, mis pärsib Tn5 transpositsiooni toimumist. Repressori translatsioon algab transposaasi geeni seest ja seetõttu puudub tal täispika transposaasi N-terminaalne järjestus.

 

Tn3 perekonna transposoonid.

 

Tn3 perekonna transposoonid sarnanevad oma ülesehituselt IS elementidele, kuid kodeerivad lisaks transpositsioonil osalevatele valkudele ka muid funktsioone. Tn3 sisaldab 3 geeni:

                     tnpA – transposaas

                     tnpR – resolvaas

                     bla - b-laktamaas (resistentsus ampitsilliinile).

 

Tn3 transpositsioon toimub 2-etapilselt:

 

1.         Kointegraadi moodustumine transposooni ja märklaud-DNA vahel. Vajalik on aktiivse transposaasi TnpA olemasolu. Transposaas lõikab doonormolekuli transposooni otste kõrvalt, nii et vabanevad transposooni DNA 3'-OH otsad. Need 3'-OH otsad atakeerivad fosfodiestersidemeid märklaud-DNA-s, tekitades  insertsioonisaiti üksikahelalised katked ning järgnevalt viiakse kokku transposooni ja märklaud-DNA otsad. Seejärel transposoon replitseerub ning tekib struktuur, kus mõlemad samas orientatsioonis asuvad transposooni koopiad on ühenduses nii doonori kui ka märklaud-DNA-ga.

 

2.         Kointegraadi lagunemine resolvaasi TnpR toimel. Toimub sait-spetsiifiline rekombinatsioon kahe Tn3 koopia vahel res saidis. Kuna res sait paikneb tnpA ja tnpR geenide vahel nende promootoralas, takistab resolvaasi seondumine sellesse saiti nende geenide transkriptsiooni. Seega on valgul TnpR lisaks resolvaasi funktsioonile ka repressori funktsioon.

 

Multiresistentsed bakteritüved.

 

Kuna enamus transposoone kannavad antibiootikumide resistentsusgeene, soodustab transposoonide hüppamine ühest DNA molekulist teise (näit. plasmiidist kromosoomi ja vastupidi) resistentsuse kiiret levikut bakteripopulatsioonis. Meditsiinis on suur probleem patogeensete bakteritega, mis on endale hankinud erinevaid resistentsusgeene, olles sel viisil resistentsed mitmele antibiootikumile korraga. Multiresistentsus levib näiteks R plasmiidide abil. R plasmiidid on 2-komponendilised, koosnedes ülekandefaktorist RTF (resistance transfer factor), mis annab plasmiidile võime konjugatsiooni teel üle kanduda, ja R-determinandist, mis sisaldab resistentsusgeene. Enamasti paiknevad resistentsusgeenid IS elementides ja transposoonides, mis on läinud R plasmiidi koosseisu. Kuna R plasmiidid pole liigispetsiifilised, võivad nad üle kanduda väga erinevatesse bakteriliikidesse. 

 

Transponeeruvad elemendid eukarüootides.

 

Sarnaselt bakterite mobiilsetele DNA elementidele on ka eukarüootsetel transponeeruvatel elementidel otstes pöördkordusjärjestused ning elemendi inserteerumine märklaud-DNA-sse põhjustab insertsioonisaidi järjestuse duplitseerumist. Osa eukarüootsetest transponeeruvatest elementidest kodeerivad ka transposaasi.

 

Maisi Ac ja Ds elemendid.

 

Maisi Ac ja Ds elemendid avastas Barbara McClintock, teostades maisiterade värvuse ja mustri geneetilist analüüsi. Nende elementide molekulaarne struktuur kirjeldati alles aastaid hiljem. McClintock analüüsis maisi kromosoomide katkeid. Üks geneetiline marker, mille avaldumist ta jälgis, paiknes 9-nda kromosoomi lühikeses õlas. Selleks oli maisiterade värvust kontrolliv lookus C. Alleel C^I on dominantne, põhjustades pigmendi puudumist. McClintock ristas C^IC^I genotüübiga tolmukatega CC genotüübiga emasõisi ja sai maisiterad, mille triploidne endosperm on genotüübiga C^ICC  (triploidne endosperm saab 2 alleeli emalt ja ühe alleeli isalt!). Kuigi enamus teri olid värvusetu kestaga, ilmnes mõnedel pruunikas-punaseid pigmendilaike. McClintoc oletas, et rakud pigmenteerusid seetõttu, et endospermi arengu käigus oli koe mõnedes piirkondades alleel C^I kaotsi läinud. Alleel C^I läks kaotsi 9-nda kromosoomi lühikese õla otsmise fragmendi murdumise tõttu. Murdekoht asus spetsiifilises kohas ning katke tekkimist kontrollis faktor tähistusega Ds (“dissociation”). Faktor Ds indutseeris kromosoomi katkeid teise faktori, Ac (“activator”) olemasolul. Ac esines ainult mõnedel maisisortidel. Erinevate sortide ristamisel saadi variandid, mis sisaldasid nii Ds kui ka Ac faktorit. 9-nda kromosoomi katkeid oli võimalik jälgida ainult mõlema faktori koosesinemisel. Edasiste katsete käigus leidis McClintock kromosoomikatkeid ka teistes maisi genoomi piirkondades nii kromosoomis 9 kui ka teistes kromosoomides ning kõik need katked sõltusid Ac faktori olemasolust. McClintock oletas, et Ds element võib esineda maisi genoomi erinevates kohtades ja võib liikuda genoomi ühest piirkonnast teise. Geneetilise analüüsi tulemuste põhjal väitis McClintock, et mõlemad elemendid, nii Ds kui ka Ac võivad transponeeruda. Kui üks neist elementidest inserteerus mõnda geeni, siis geeni funktsioon kas muutus või geen inaktiveerus. Kuna Ds ja Ac elemendid indutseerisid genoomi ühest piirkonnast teise liikumisel mutatsioone, nimetas McClintok nad kontrollelementideks.

 

Hilisem Ac elementide nukleotiidse järjestuse analüüs näitas, et need elemendid on 4563 bp pikkused, sisaldades mõlemas otsas 11 bp pikkuseid pöördkordusjärjestusi. Kõigi Ac elementide otsad külgnevad otsekordusjärjestustega, mis on 8 bp pikkused ja tekivad märklaudjärjestuse duplitseerumisel transpositsiooni käigus. Erinevalt Ac elementidest on Ds elemendid struktuurselt heterogeensed. Nende otsmised pöördkordusjärjestused on identsed Ac elementide omadega, kuid nad erinevad oma sisemistelt järjestustelt. Osa Ds elemente on Ac elementide derivaadid deletsioonidega sisemistest järjestustest. Mõnede Ds elementide puhul on pöördkordusjärjestuste vahele sattunud võõras DNA. Selliseid Ds elemente nimetatakse aberrantseteks Ds elementideks. Kolmas klass Ds elemente on nn. kaksik-Ds elemendid, kus üks Ds element on inserteerunud teise vastupidise orientatsiooniga. Just see klass elemente põhjustab kromosoomi õlgade katkeid, mida jälgis Barbara McClintock.

 

Ac/Ds elementide väljatulekut, transponeerumist ja sellega kaasnevaid geneetilisi ümberkorraldusi (geenide inaktivatsioon, kromosoomide katkemised) aitab läbi viia Ac elemendi poolt kodeeritud transposaas. Ac transposaas interakteerub DNA järjestustega Ac ja Ds elementide otstes ja otste läheduses. Kuna Ds elemendid ise ei kodeeri aktiivset transposaasi, vajavad nad geneetiliste ümberkorralduste indutseerimiseks transposaasi, mis on kodeeritud Ac elemendi poolt. Ac elemendi transposaas on trans-aktiveeriv valk, mis difundeerumine tuumas võimaldab tema seondumist Ds elemendile ja selle elemendi  transponeerumist.

 

Äädikakärbse P elemendid.

 

1977-ndal aastal leidsid Margaret ja James Kidwell ning John Sved, et teatud äädikakärbse liinide M ja P ristamisel tekib järglaskond, mille puhul ilmnevad katked kromosoomides ning kõrgenenud mutatsioonisagedus. Sündroomi hakati nimetama hübriidseks düsgeneesiks (“hybrid dysgenesis”). Kui omavahel ristati erinevaid P liine või M liine, sündroom järglaskonnas ei avaldunud. Seetõttu oletati, et P liini kärbeste genoomis peab olema mingi transponeeruv element, mis pärast munaraku viljastamist aktiveerub, indutseerides mutatsioone ja kromosoomi katkeid. Kinnitust transposooni olemasolule saadi katsetega, kus analüüsiti düsgeneesi sündroomiga hübriidide geeni white mutatsioone DNA tasemel. Kõigil juhtudel oli geeni inserteerunud DNA element, mis oli P liini kärbeste genoomi erinevates kohtades kõrge koopiaarvuga esindatud. Samas ei õnnestunud seda elementi leida M liini kärbeste genoomist. Kuna transponeeruv DNA element esines ainult P tüves, hakati seda nimetama P elemendiks.

 

P elementide suurus on varieeruv. Kõige suurem element on 2907 bp pikkune ning sisaldab 31 bp pikkuseid pöördkordusjärjestusi. Täispikk P element kodeerib funktsionaalset transposaasi elemendi transponeerumiseks. Osa P elemente on sisemiste deletsioonidega, mistõttu nende transponeerumine osutub võimalikuks üksnes siis, kui genoomis sisaldub ka funktsionaalset transposaasi kodeeriv P element.

 

Äädikakärbse loodusliku populatsiooni iseloomustamisel selgus, et mõnede kärbeste kromosoomis sisaldus kuni 50 P elementi, teiste puhul aga leiti ainult üksikuid. Üllatav oli see, et kärbsed, kes pärinesid liinidest, mis olid loodusest isoleeritud enne 1950-ndat aastat, ei sisaldanud genoomis ühtegi P elementi. Järelikult on P elemendid hakanud äädikakärbse looduslikus populatsioonis levima alles hiljuti. Arvatavasti on nad sattunud äädikakärbse genoomi teistest Drosophila liikidest viiruste abil.

 

P elementi sisaldavate äädikakärbeste populatsioonis on välja kujunenud mehhanism, mis kontrollib nende elementide liikumist. Kui emaseid P liini kärbseid ristati isaste M liini kärbestega, saadi normaalsed järglased, kuid vastupidi, emaste M liini kärbeste ristamisel P liini isastega saadi düsgeensed järglased. Seega on P elementide regulatsioonitüüp määratud munaraku tsütoplasma poolt e. sõltub tsütotüübist ("cytotype"). P tsütotüüp pärsib P elemendi transponeerumist ja on iseloomulik liinidele, mis sisaldavad genoomis P elemente, M tsütotüüp aga võimaldab nende elementide transponeerumist. M tsütotüüp on iseloomulik liinidele, mille kromosoomides P elemendid puuduvad. See on ka põhjuseks, miks P liinide ristamisel M liinidega saadakse järglased, kelle genoomis P elemendid ringi hüppavad. P tsütotüüpi põhjustavad P elementide endi poolt kodeeritud polüpeptiidid.

 

P ja M liinide ristamisel saadud düsgeensed järglased on elujõulised. Põhjus on selles, et P elemendid transponeeruvad ainult idurakkudes. Somaatilistes rakkudes on nende elementide liikumine takistatud, kuna transposaasi mRNA alternatiivse splaissingu tõttu sünteesitakse defektne valk.

 

Düsgeenseid hübriide kasutatakse laboris P elementide ringihüppamisest põhjustatud mutatsioonide identifitseerimiseks. Et mutatsioonid avalduda saaksid, hübriide ristatakse.  Düsgeensete hübriidide eelis traditsiooniliste mutantide ees seisneb selles, et mutantsed geenid on P elemendi poolt märgistatud, lihtsustades sellega nende geenide isoleerimist ja identifitseerimist.   

 

Mariner elemendid.

 

Äädikakärbsele Drosophila melanogaster lähedastest liikidest D. simulans ja D. mauritiana on leitud mariner element. See väike transposoon on 1286 bp pikkune ning sisaldab otstes 28 bp pikkuseid pöördkordusjärjestusi. Mariner elemente pole leitud äädikakärbsest, samas on need laialt levinud teistes organismides – nematoodides, seentes ja isegi inimesel. Mariner elementide lai levik fülogeneetiliselt kaugetes organismides viitab sellele, et nad on tekkinud väga ammu. Erinevatest organismidest isoleeritud mariner elementide DNA järjestuse analüüs näitab, et näiteks putukate puhul on fülogeneetiliselt kaugematest liikidest isoleeritud elemendid sageli sarnasemad kui enam suguluses olevate liikide puhul. Ka siin oletatakse, et transponeeruv element on liikide vahel horisontaalselt üle kandunud, kasutades kandjana viirust.

 

Mariner elementidega on suguluses Tc1 elemendid, mis on veidi suuremad (1600-1700 bp) ja mille pöördkordusjärjestused on pikemad. Element Tc1 on leitud nematoodist C. elegans, kuid temale sarnaseid elemente on kirjeldatud ka putukates.

 

Retrotransposoonid.

 

Eukarüootsete organismide genoomidest on leitud elemente, mille transponeerumiseks on vaja pöördtranskriptsiooni – DNA sünteesi RNA-lt. Vastavaid elemente on hakatud nimetama retrotransposoonideks. Retrotransposoone klassifitseeritakse retroviiruse-laadseteks elementideks ja retroposoonideks. 

 

Retroviiruse-laadsed elemendid.

 

Retroviiruse-laadseid elemente on leitud väga erinevatest organismidest, nii pärmidest, taimedest kui ka loomadest. Nende ehitus sarnaneb retroviiruste genoomile. Retroviiruse-laadsete elementide mõlemas otsas on LTR järjestused (long terminal repeats), mis on orienteeritud samasuunaliselt ja mõnisada nukleotiidi pikad. LTR-id on tavaliselt omakorda lühikeste pöördkordusjärjestuste vahel. Elemendi keskel on kodeerivad järjestused, mis on homoloogilised retroviiruste gag ja pol geenidele. Retroviirustel kodeerib gag viiruse kapsiidi struktuurvalku ning pol pöördtranskriptaasi/integraasi. Retroviiruse-laadsetel elementidel on need valgud olulised elemendi transpositsioonil.

 

Üks paremini iseloomustatud retroviiruse-laadseid elemente on Ty element, mis on leitud pagaripärmist Saccharomyces cerevisiae. Ty element on 5,9 kb pikkune, sisaldab 340 bp pikkuseid LTR-e ning tekitab transpositsioonil 5 bp pikkuseid otsekordusjärjestusi. Pärmi genoomis on leitud 35 koopiat Ty elementi. TyA ja TyB on gag ja pol geenide homoloogid. TyB kodeerib pöördtranskriptaasi (revertaasi), mis sünteesib Ty elemendi RNA-lt dsDNA molekuli. DNA molekul inserteerub genoomi, tekitades sel viisil Ty elemendi koopia genoomi teises piirkonnas.

 

Retroviiruse-laadseid elemente on leitud ka äädikakärbsel. Esimest sedatüüpi elementi hakati nimetama copia elemendiks, kuna sellelt sünteesitud RNA koopiaarv raku kohta oli väga kõrge. Järgmine element nimetati gypsy elemendiks, kuna ta rändas genoomis ringi (“gypsy” tähendab tõlkes mustlast). Mõlemad transposoonid moodustavad rakus viiruse-laadseid partikleid ning kuna gypsy elemendi puhul on näidatud ka tema liikumist läbi rakumembraani, võiks seda elementi pidada retroviiruseks.

 

Retroposoonid.

 

Äädikakärbses on kirjeldatud F, G ja I retroposoonid ning imetajatel LINE-d (Long Interspersed Nuclear elements). Ka nende transponeerumine käib üle RNA molekulilt sünteesitava DNA. Pöördtranskriptaas on elemendi enda poolt kodeeritud. Retroposoonide otstes pole pöördkordusjärjestusi, kuid nende ühes otsas on homogeenne A:T aluspaaridest koosnev järjestus. See järjestus liitub retroposooni koostisesse pöördtranskriptsiooni käigus, kuna revertaas kasutab matriitsina RNA molekuli, mille 3’ otsa on lisatud poly-A saba.

 

LINE-1 retroposoon L1 on inimese retroposoon. L1 transpositsioonist teatati 1988-ndal aastal, kui hemofiiliat põdeval patsiendil kirjeldati transponeeruva elemendi  inserteerumist X kromosoomi lookusesse, mis kodeerib verehüübimisfaktorit VIII. Inserteerunud element pärines algselt kromosoomist 22. Kuna sama element on leitud ka gorillal 22-s kromosoomis, pidi ta seal olemas olema juba enne, kui inimese ja gorilla eellased lahknesid.

 

L1 elementide pikkus varieerub. Enamus elemente sisaldavad deletsioone 5’ otsast, mis viitab sellele, et DNA süntees RNA molekulilt ei toimu alati lõpuni. L1 elemendid on inimese genoomis esindatud 50000 – 100000 koopiana, mis moodustab 5% kogu genoomist.

 

Äädikakärbsel on kirjeldatud telomeeriga assotsieerunud retroposoone nagu näiteks HeT-A ja TART, millel on oluline roll kromosoomi otste regenereerimisel. Kromosoomide otstes on telomeersed järjestused. Nende replikatsioon pole täielik. Kromosoomid jäävad otstest replikatsiooni käigus järjest lühemaks. DNA polümeraas on võimeline DNA ahelat sünteesima ainult ühes suunas, lisades nukleotiide praimeri 3’ otsa. Praimeriks on RNA, mis hiljem kõrvaldatakse ja nii jääb kromosoomi otsas üks DNA ahel teisest lühemaks. Kromosoomi otste lühenemine jätkub läbi järgmiste replikatsioonitsüklite. Kromosoomi otstes olevad telomeersed järjestused on märklauaks retroposoonidele HeT-A ja TART. Retroposoonide transponeerumise tulemusena telomeeridesse pikenevad need mitme kb võrra, vältides sel viisil kromosoomide kulumist. Kui transponeerunud elementide järjestused järgmiste replikatsioonitsüklite käigus mittetäieliku replikatsiooni tõttu kaduma hakkavad, transponeeruvad sinna uued retroposoonid.

 

Transponeeruvate elementide tähtsus genoomi evolutsioonis.

 

Transponeeruvaid elemente on kirjeldatud kõigis uuritud organismides. Nad võtvad enda alla märkimisväärse osa genoomist – äädikakärbsel näiteks 15-20% kogu genoomist. Transponeeruvatel elementidel on oluline roll mutatsioonide tekitamisel. Ligi pooled äädikakärbsel kirjeldatud spontaansetest mutatsioonidest on põhjustatud mobiilsete elementide poolt. Äädikakärbse genoomi uurimisel selgus, et transponeeruvate elementide järjestusi esineb kõige sagedamini heterokromatiinis ning enamus neist seal on defektsed. Seega kujutab heterokromatiin endast transponeeruvate elementide “surnuaeda”. Mobiilseid elemente leidub ka eukromatiinis. Äädikakärbsel on identifitseeritud üle 40 erineva mobiilse elemendi perekonna. Igasse perekonda kuulub keskmiselt 20 – 80 erinevat elementi, kuid nende arv võib ulatuda ka paarisajani.

 

Transponeeruvad elemendid põhjustavad ümberkorraldusi kromosoomide struktuuris. Sageli viib kromosoomisiseste ümberkorraldusteni homoloogilise rekombinatsiooni toimumine kromosoomi erinevates osades paiknevate homoloogiliste elementide vahel. Kui 2 rekombineeruvat transposooni on kromosoomis vastupidises orientatsioonis, siis toimub nende vahele jääva segmendi inversioon, kui samasuunaliselt, segment deleteerub. Mobiilsed elemendid võivad indutseerida ka kromosoomidevahelisi ümberkorraldusi (nii homoloogiliste kui ka mittehomoloogiliste kromosoomide puhul). Sel juhul tekib tütarkromatiidide vahelise ristsiirde tulemusena 2 produkti: kromosoom, milles transposoonidevaheline ala on duplitseerunud ja kromosoom, millest see on kaotsi läinud.

 

Enamus transposoone on avastatud insertsioonidena mutantsetesse geenidesse. Ka äädikakärbse white geeni mutatsioonid on sageli põhjustatud transposoonide insertsioonidest. Geeni white on inserteerunud nii P elemendid kui ka retroviiruse-laadsed elemendid ja retroposoonid. Kuigi mutantsete organismide analüüs näitab, et sageli on pahanduse tekitajaks transposoon, on uute insertsiooniliste mutatsioonide tekkesagedus väga madal. Transpositsioonisagedus võib olla maha reguleeritud paljude erinevate mehhanismidega. Kui regulatsioon on rikutud, vallandub transposoonide insertsioonidest põhjustatud mutagenees. Selle protsessi ilmekaks näiteks on äädikakärbse düsgeensed hübriidid.

 

Kas transponeeruvad elemendid on organismile kasulikud või kahjulikud? Kuidas nad on tekkinud? Nendele küsimustele vastamiseks on esitatud mitmeid hüpoteese. Ühelt poolt on mobiilsed elemendid kui looduslik tööriist geneetilise materjali ümberkujundamiseks. Osadel ümberkorraldustel võib organismile olla positiivne selektiivne väärtus. Teisalt on need elemendid ka kui parasiidid, mis paljunevad organismis raku sisemiste ressursside arvelt ja kutsuvad genoomis esile enamasti kahjulikke muutusi. Transposoonide tekke kohta on samuti mitmeid hüpoteese. Nancy Kleckner arvas, et transposoonid võivad olla tekkinud geenidest, mis kodeerivad DNA ahelates katkeid tekitavaid ja parandavaid ensüüme. Juhul, kui mõnel sellisel ensüümil kujunes välja spetsiifilisus lühikestele DNA järjestustele, mis esinesid pöördkordustena mõlemal pool ensüümi kodeerivat geeni, oligi esimene transposoon valmis. Modifitseeritud ensüüm võis geeni koos tema poolt spetsiifiliselt äratuntavate järjestustega “lõika ja kleebi” põhimõttel genoomi ühest piirkonnast teise toimetada.

 

Palju on diskuteeritud ka selle üle, kas retroviiruste-laadsed transponeeruvad elemendid on evolutsioneerunud retroviirustest või vastupidi.

 

 

 

 

 

18. Mitokondrite ja kloroplastide geneetika.

 

Nii mitokondrid kui ka kloroplastid arvatakse olevat tekkinud endosümbioosi teel eukarüoodi rakku sattunud prokarüootsetest organismidest. Mitokondritel ja kloroplastidel on säilunud oma genoom, mis on evolutsiooni käigus küll tunduvalt lihtsustunud, kuid sisaldab spetsiifilisi geene oksüdatiivseks metabolismiks (ATP süntees) ja fotosünteesiks.

 

Taimedel (kuid ka mõnedel vetikatel ja seentel) on kirjeldatud tunnuseid, mille lahknemine järglaskonnas toimub Mendeli printsiipidest erinevalt. Teatud juhtudel ilmneb tuumaväline pärilikkus, kus vanemate alleelid päranduvad järgalastele ebavõrdselt. Järgnevalt käsitleme mõningaid näiteid lähemalt.

 

Lehtede mitmevärvilisus taimedel.

 

Taimelehed võivad olla mõnikord kirjud, sisaldades valgeid laike. Pigmendi puudumine mõnes leheosas on põhjustatud erinevat tüüpi kloroplastide ebavõrdsest jaotumisest raku jagunemisel – osadesse rakkudesse satuvad kloroplastid, mis ei ole võimelised pigmenti tootma. Kahte tüüpi organellide esinemist rakus nimetatakse heteroplasmiaks, ühetüübiliste organellide esinemist homoplasmiaks. Heteroplasmilise taimeraku jagunemise tulemusena tekkinud valged sektorid taimelehes on erineva suuruse, kuju ja asukohaga. Kuigi mõnedel taimedel on lehed mosaiiksed, kindla värvusmustriga, pole sel juhul tegemist mitte kloroplastide ebavõrdse jaotumisega tütarrakkudesse, vaid hoopis lehesiseselt toimiva füsioloogilise süsteemiga, mis reguleerib pigmendi tootmist lehes nii ajaliselt kui ka ruumiliselt.

 

Taimelehtede värvust kontrolliva emapoolse pärilikkuse avastasid saksa botaanikud Carl Correns ja Erwin Baur. Mirabilis’e roheliste ja kirjuleheliste taimede ristamisel selgus, et järglaste värvus sõltus emataimede gameetide värvusest. Kui järglaste saamiseks tolmutati “valge sektori” õisi tolmukatega, mis pärinesid “rohelisest sektorist”, saadi pigmenditud taimed, kui vastupidi, siis ainult roheliste lehtedega. Need retsiprooksed ristamiskatsed näitasid, et faktor, mis määrab lehe pigmentatsiooni, kandub järglastele üle ainult emaliini pidi. Juhul, kui taim päris emalt segu pigmenteeruvaid ja pigmendivabu kloroplaste, avaldus tal lehtede kirjusus. Katsetes pelargooniumiga oli taimede värvuse lahknemine järglaskonnas keerulisem, sõltudes nii ema kui ka isa kloroplastidest. Retsiprooksetel ristamistel, mis olid analoogilised eelpooltoodud katseskeemile, saadi seekord mõlemal juhul järglaskonnas nii rohelisi, laigulisi kui ka pigmendivabu taimi. Samas ei vastanud lahknemissuhted lehtede värvuse osas Mendeli seadustele.

 

Maisi tsütoplasmaatiline isasteriilsus.

 

Maisil paiknevad emasõied isasõitest eraldi. Emasõisikud asuvad taime lehekaenlates ning isasõisikud arenevad sama taime ladvas. Mõnedel maisisortidel isasõisikud ei arene, kuigi emasõisikud on viljakad. 1930-ndatel aastatel näitas Marcus Rhoades, et maisi isasteriilsus on põhjustatud emalt päritud faktori poolt. Ta tolmutas isasteriilse maisi emasõisi fertiilsete tolmukatega ning tulemuseks oli isasteriilne järglaskond. Kuna järglased olid alati isasteriilsed ning see fenotüüp säilus ka korduvatel tagasiristamistel viljakaid isasõisi kandvate taimede tolmukatega, viitasid need tulemused sellele, et tegemist oli tsütoplasmaatilise pärilikkusega, mis kandus edasi emaliini pidi. Ristamiskatsete käigus ilmnesid ka dominantsed mutatsioonid tuumas, mis supresseerisid tsütoplasmaatilise faktori toime. Sel juhul saadi viljakate isasõitega taimed. Need katsed näitasid, et isasteriilsus avaldub tuumageenide ning tsütoplasmaatilise faktori koostoimena. Kuni 1970-ndate aastateni polnud teada, kas maisi isasteriilsus on põhjustatud mitokondrite või kloroplastide poolt. Alles siis, kui olid välja töötatud molekulaarsed meetodid organellide DNA isoleerimiseks ja geneetiliseks manipuleerimiseks, selgus, et isasteriilsust põhjustavad mitokondriaalse päritoluga geenid. Mõnede isasteriilsete maisisortide puhul on mitokondritest leitud väikeseid DNA molekule. Teistel juhtudel on kirjeldatud mutatsioone mitokondriaalses DNA-s.

 

Chlamydomonas’e rakkude antibiootikumiresistentsus.

 

Chlamydomonas reinhardtii on fotosünteesiv rohevetikas, mida on geneetiliselt põhjalikult uuritud. Tegemist on üherakulise organismiga, mille paljunemises on kirjeldatud haploidne ja diploidne staadium. Haploidsed rakud võivad olla kas + või – tüüpi. Erinevat tüüpi haploidsed rakud moodustavad diploidse sügoodi. Seejärel jaguneb sügoot meioosi teel, andes 4 haploidset järglast. Järglased jagunevad mitoosi teel ja nii saadakse vegetatiivsete rakkude kloonid. Kloonide analüüsist on selgunud, et see, kas tegemist on + või – tüüpi rakkidega, on kontrollitud ühe tuumageeni alleelide mt⁺ (määrab raku + tüübi) ja mt^- poolt. Sügoodi jagunemisel tekib kaks mt⁺ rakku ja kaks mt^- rakku. Iga Chlamydomonase rakk sisaldab mitu mitokondrit ning ühe suure kloroplasti. 1954-ndal aastal näitas Ruth Sager, et Chlamydomonase rakkude antibiootikumi-resistentsus ei pärandu järglastele Mendeli seaduspärasuste alusel. Streptomütsiinile resistentsete mt⁺ rakkude ristamisel streptomütsiini-tundlike mt^- rakkudega olid kõik järgalased streptomütsiini-resistentsed hoolimata sellest, et alleelid peaksid tütarrakkude vahel lahknema 1:1-le. Ristates resistentseid mt^- rakke antibiootikumi-tundlike mt⁺ rakkudega ei saadud ühtegi resistentset järglast. Seega määras resistentsuse mt⁺ rakkude tsütoplasma. Hiljem selgus, et resistentsusdeterminant paiknes mt⁺ rakkude kloroplastis. Sügoodi moodustumisel degradeerivad nukleaasid mt^- rakust pärineva kloroplasti DNA ja nii pärib järglaskond ainult mt⁺ rakkude kloroplasti genoomi.

 

Pärmirakkude metaboolsed defektid.

 

Osa pärmi mutantseid tüvesid moodustab glükoosi sisaldaval rikkal söötmel tavapärasest väiksemaid kolooniaid. Neid mutante nimetatakse petite mutantideks. Nimetus “petite” tuleneb prantsuse keelest ja tähendab väikest. Petite mutandid on defektsed glükoosi metabolismi suhtes. Nad sisaldavad deletsioone mitokondriaalsest DNA-st. Petite mutante on kahesuguseid – neutraalseid ja supresseerivaid. Neutraalsete mutantide ristamisel metsiktüüpi rakkudega on kõik järglased metsiktüüpi, moodustades glükoosil suuri kolooniaid. Supresseerivate mutantide ristamisel metsiktüübiga moodustavad aga kõik järglased glükoosi söötmel väikeseid kolooniaid. Neutraalsetel petit mutantidel puudub mitokondriaalne DNA. Sügoodi jagunemisel satuvad spooridesse metsiktüüpi tüve mitokondrid. Supresseerivatel mutantidel on mitokondriaalne DNA defektne. Mitokondri genoomi replikatsioonil on defektsetel genoomidel võrreldes algse genoomiga eeliseid. Supresseeriva mutandi ristamisel metsiktüübiga tekib sügoot, mis sisaldab nii mutantseid kui ka algtüüpi mitokondreid. Kui sügoot seejärel koheselt sporuleerub (jaguneb meioosi teel), sisaldavad askospoorid ainult mutantseid mitokondreid ja moodustavad glükoosi sisaldaval söötmel väikeseid kolooniaid. Kui sügoot paljuneb enne meiootilist jagunemist mitoosi teel ja moodustab spoore alles seejärel, on selleks ajaks replitseerunud ka metsiktüüpi mitokondrite genoom ja spooridest kasvavad suured kolooniad.

 

Mitokondrite molekulaargeneetika.

 

Mitokondritel on oma replikatsiooni-, transkriptsiooni- ja translatsiooniaparaat. Nad sisaldavad valgusünteesiks ribosoome. Osa mitokondrites sisalduvaid valke on kodeeritud mitokondri, osa aga tuumas paiknevate geenide poolt.

 

Mitokondriaalne DNA.

 

Mitokondriaalset DNA mtDNA kirjeldati esmakordselt 1960-ndatel aastatel elektronmikroskoopiliselt. Praeguseks on määratud mtDNA primaarstruktuur mitmetest erinevatest organismidest. mtDNA genoomi suurus varieerub organismiti. Selgroogsetel on see 16-17 kb, mõnedel õistaimedel aga kuni 2500 kb suurune. Mitokondrite genoomi koopiaarv raku kohta on kõrge – selgroogsete somaatilistes rakkudes on alla 1000 koopia, kuid ootsüütides 10⁸ mtDNA koopiat raku kohta. Enamasti on mtDNA molekulid tsirkulaarsed. Ripsloomal Paramecium aurelia ja vetikal Chlamydomonas reinhardtii on mtDNA genoom lineaarne.

 

Selgroogsete mtDNA on kompaktne ning geenid paiknevad üksteisele lähestikku. Inimese mtDNA on 16659 bp pikkune, sisaldab 37 geeni, millest 2 kodeerivad ribosomaalset RNA-d, 22 tRNA-sid ja 13 oksüdatiivsel fosforüleerimisel osalevaid ensüüme. Ka hiire, sõraliste ja konnade mtDNA ülesehitus on sarnane inimese omale. Selgrootute mtDNA genoom on küll sama suur kui selgroogsetel, kuid geenide järjekord on erinev.

 

Kõige komplekssem mitokondri genoomi ülesehitus on õistaimedel, kus seniteadmata arv geene asuvad kuni mitmetuhande kb suuruses rõngasmolekulis. Genoomis on palju mittekodeerivaid järjestusi ning geenide asukoht võib olla väga erinev isegi lähedaste liikide puhul. Õistaimede mtDNA genoom sisaldab kordusjärjestusi mis on aluseks geneetilistele rekombinatsioonidele, mille tulemusena võib algne molekul dissotseeruda väiksemateks ja need omakorda üheks suureks tagasi. Maisi mtDNA on näiteks 570 kb suurune ja arbuusil 300 kb suurune.

 

Seente mtDNA on võrreldes loomade mtDNA-ga suurem. Pärmi mitokondri genoom on näiteks 78 kb suurune, kuid sisaldab vähem geene kui loomade mtDNA – 33 geeni, millest 2 kodeerivad ribosomaalset RNA-d, 23 kuni 25 erinevaid tRNA-sid, 1 geen ribosoomi valku ja 7 geeni oksüdatiivsel fosforüleerimisel (ATP süntees) osalevaid ensüüme. Erinevalt loomade mtDNA-st sisaldab pärmide mtDNA introneid ning mõned geenid on üksteisest lahutatud pikkade mittekodeerivate DNA järjestustega. 

 

Mitokondriaalsete geenide regulatsioon.

 

Selgroogsete mtDNA genoomis on 2 transkriptsioonilist üksust H ja L, mis on vastassuunaliselt transkribeeritavad. Täispikk RNA lõigatakse tRNA, ribosomaalse RNA ja mRNA molekulideks. mRNA molekulid polüadenüleeritakse ja transleeritakse mitokondriaalsetel ribosoomidel. Translatsioonimehhanismid mitokondrites ja tsütosoolis on põhimõtteliselt sarnased. Erinevus on koodonkasutuses. Koodonid AGA ja AGG vastavad tsütosoolis arginiinile, mitokondris põhjustavad nad aga translatsiooni termineerumist. UGA, mis on stop koodoniks tsütosoolis, vastab mitokondris trüptofaanile. AUA on isoleutsiini koodon tsütosoolis, mitokondris vastab see aga metioniini initsiaatorkoodonile.

 

Seentes ja taimedes on mtDNA jaotunud paljudeks erinevateks transkriptsioonilisteks üksusteks. Pärmides on mitokondris töötav RNA polümeraas ühekomponendiline ja kodeeritud tuuma geeni poolt.

 

Taimede mtDNA geenide avaldumise regulatsiooni puhul on kirjeldatud protsess, mida tuntakse nimetuse all RNA editing (tõlkes “redigeerimine, korrigeerimine”). Sünteesitud RNA molekulis asendatakse osa nukleotiide. Kõige sagedasem on C®U asendus, kuid kirjeldatud on ka vastupidist, U ®C asendust. Asendused muudavad  näiteks koodoneid, mille algne järjestus oli signaaliks translatsiooni termineerumisele, võimaldades selle tulemusena funktsionaalsete polüpeptiidide sünteesi. RNA editing on iseloomulik ainult kõrgematele taimedele. Samas on RNA järjestuse muutmist kirjeldatud ka algloomades, näiteks trüpanosoomides. Algloomades on leitud väikeseid RNA molekule gRNA-sid (guide RNAs), mis on osaliselt komplementaarsed mtDNA transkriptidele ja “juhivad” RNA järjestuse korrigeerimist.

 

Taimede mtDNA-lt sünteesitud RNA-de puhul on kirjeldatud trans-splaissingut, mille puhul võivad mRNA erinevad segmendid olla transkribeeritud mtDNA erinevatelt piirkondadelt, üksteisest sõltumatult. Erinevate transkriptide eksonid viiakse kokku intronitevaheliste interaktsioonide tulemusena. Üle genoomi hajutatuna esineb näiteks nisu geen nad1, mille 4 erinevat segmenti kodeerivad NADH reduktaasi.

 

Mitokondris ja rakutuumas asuvate geenide produktide vaheline interaktsioon.

 

Enamus mitokondriaalsete geenide produkte toimivad mitokondris. Neist üksi aga mitokondrite elutegevuseks ei piisa. Mitokondrite ribosoomid koosnevad mitokondriaalse päritoluga RNA-st ja rakutuuma poolt kodeeritud valkudest. Ribosoomivalgud sünteesitakse tsütosoolis ja transporditakse mitokondritesse. Ka paljud mitokondrites toimuvas aeroobses metabolismis osalevad polüpeptiidest on oma päritolult tuumavalgud. Näiteks ATPaasi osa subühikuid on kodeeritud tuuma geenide, osa aga mtDNA poolt.

 

 

 

Mitokondriaalsed haigused.

 

Viimaste aastate uuringud on näidanud, et mitmed inimesel kirjeldatud haigused on seotud mutatsioonidega mtDNA genoomis. Üheks selliseks näiteks on nägemisnärvi kahjustus LHON (Leber’s hereditary optic neuropathy), mis avaldub täiskasvanutel ja lõpeb haigete pimedaksjäämisega. mtDNA-s on kirjeldatud mutatsioone, mis muudavad oksüdatiivses fosforüleerimises osalevate ensüümide aminohappelist järjestust. Kui mitokondrite energiatootlikkus väheneb, viib see nägemisnärvi kärbumiseni.  LHON pärandub edasi emaliini pidi.

 

Pearsoni luuüdi-pankrease (marrow-pancreas) sündroom avaldub lastel ja on tavaliselt surmaga lõppev. Haiguse süvenedes väheneb luuüdi rakkude arv. Pearsoni sündroomi põhjustab suur deletsioon mtDNA-st. Kuna sündroomi pole kunagi kirjeldatud vanematel, peavad muutused mtDNA-s olema toimunud kas ema sugurakkude oogeneesis või lapse varajase arengu käigus. Pearsoni sündroomiga haigetel on rakkudes segu normaalse ja mutantse genoomiga mitokondritest. Kunagi pole leitud haigeid, kelle mitokondrid oleksid kõik deletsiooniga. Ilmselt hukkuvad sellise genotüübiga looted juba väga varajases staadiumis.

 

Kloroplastide molekulaargeneetika.

 

Plastiidid on taimeorganellid, mis on botaanikute poolt jagatud 3 rühma: kromoplastid (sisaldavad pigmenti), amüloplastid (sisaldavad tärklist) ja elaioplastid (sisaldavad õlisid ja lipiide). Kõik need 3 tüüpi plastiide arenevad väikestest membraan-seoselistest proplastidest ja sisaldavad sama geneetilist materjali. Vastavat DNA-d on hakatud tähistama cpDNA (chloroplast DNA).

 

cpDNA.

 

Kõrgematel taimedel on cpDNA 120 kb suurune rõngasmolekul. Vetikatel on cpDNA suurus varieeruvam, jäädes tavaliselt vahemikku 85 - 292 kb. Erandiks on rohevetikas perekonnast Acetabularia, mille cpDNA on üle 2000 kb. cpDNA molekulide arv raku kohta sõltub kloroplastide arvust ja cpDNA molekulide koopiaarvust kloroplasti kohta. Näiteks üherakulisel vetikal Chlamydomonas on ainult üks kloroplast ja see sisaldab 100 koopiat cpDNA-d. Ainuraksel Euglena gracilis on raku kohta 15 kloroplasti, mis kõik sisaldavad 40 koopiat cpDNA-d. Põhimõtteliselt sisaldavad kõik cpDNA molekulid sama geneetilist informatsiooni, kuid erinevatel liikidel on geenid erinevalt organiseeritud. Nad kannavad informatsiooni ribosomaalse RNA, tRNA, mõnede ribosoomivalkude ja mitmete polüpeptiidide kohta, mis sisalduvad fotosüsteemis (näit. ribuloos 1,5-bifosfaadi karboksülaasi katalüütiliselt aktiivne subühik). cpDNA kodeerib ka kloroplasti-spetsiifilise RNA polümeraasi 4 subühikut.

 

Mõnede taimede cpDNA on täielikult sekveneeritud. Näiteks Marchantia polymorpha cpDNA on 121024 bp suurune, kodeerib 136 geeni, millest kõigi funktsioon pole praeguseks veel teada. Tubaka Nicotiana tobacum cpDNA on suurem (155844 bp), sisaldades ligikaudu 150 geeni. Enamus cpDNA molekule sisaldavad pikki pöördkordusjärjestusi (10 – 76 kb), milles asuvad ribosomaalse RNA geenid.

 

Kloroplastide biogenees.

 

Nagu juba eelpool mainitud, arenevad kõik plastid proplastidest. Kloroplastide puhul on nende areng stimuleeritud valguse poolt ning sellesse on kaasatud paljude erinevate geenide transkriptsioon. Mõned neist geenidest paiknevad ka rakutuumas. Vastavat protsessi nimetatakse biogeneesiks. Biogeneesi molekulaarne mehhanism pole praeguseks veel täielikult välja selgitatud. On teada, et valguse mõjul aktiveerub tuumas asuv geen, mis kodeerib ribuloos 1,5-bifosfaadi karboksülaasi subühikut. Samuti ekspresseeruvad mitmed pigmenteerunud valgud fütokroomid. Nad on võimelised valguseenergiat absorbeerides aktiveerima teisi valke, mis omakorda käivitavad järgmiste kloroplastide biogeneesis osalevate geenide töö.

 

Mitokondrite ja kloroplastide päritolu.

 

Esimesed rakulised organismid Maal olid arvatavasti prokarüoodid. Neil puudusid nii rakutuum kui ka tsütoplasma organellid. Samuti olid nad heterotroofid, olles võimelised paljunema toitainete varal, mida said ümbritsevast keskkonnast. CO₂ akumuleerumisel atmosfääri tekkis võimalus fotosünteesivate organismide evolutsioneerumiseks. Esimesed fotosünteesijad olid arvatavasti tsüanobakterid.  Fotosünteesi tagajärjel hakkas atmosfääri kogunema hapnikku ja see omakorda andis võimaluse aeroobse metabolismi väljakujunemiseks 1 – 2 miljardit aastat tagasi. Ka esimesed aeroobsed organismid olid eeltuumsed. Eukarüootsed organismid ilmusid 1 – 1,5 miljardit aastat tagasi. Esimesed teadaolevad eukarüoodid olid filamentsed rohevetikad. Tõenäoliselt sisaldasid nad nii kloroplaste kui ka mitokondreid, kuna olid võimelised fotosünteesima ja sünteesisid ATP-d. Arvatakse, et eukarüootsed organellid on välja kujunenud endosümbioosi teel, kus üks sümbioosi partneritest elab teise sees. Mitokondrite ja kloroplastide eellasteks peetakse baktereid. Nagu bakterid, sisaldavad ka mõlemad organellid tsirkulaarset kromosoomi. Neil on oma ribosoomid ja näiteks kloroplastide RNA polümeraas sarnaneb bakterite RNA polümeraasile. Osa mitokondrite ja kloroplastide geene on sarnased bakterite geenidele. Mitokondrite ribosomaalse RNA geenid on kõige lähedasemas suguluses purpursete fotosünteesivate bakterite vastavate geenidega.  Kloroplastide ribosoomivalkude geenid on samuti sarnased bakterite ribosoomivalkude geenidega. Kõik need faktid viitavad sellele, et mõned bakterid kolisid elama primitiivsetesse eukarüoodi rakkudesse, leides endale sel viisil stabiilsema elukeskkonna, kus toituda ja paljuneda. Eukarüoodirakk sai omalt poolt vastutasuks võimaluse kasutada bakteri poolt talletatud energiat. Ajajooksul genoomid spetsialiseerusid ning organellide geneetiline materjal lihtsustus.

 

Kaasaegsed kloroplastid ja mitokondrid poleks võimelised rakuväliselt toime tulema. Nii DNA kui ka RNA polümeraasid, samuti osa tRNA-sid ja enamus ribosoomivalke on kodeeritud rakutuumas asuvate geenide poolt. Evolutsiooni käigus toimus ka geneetilise materjali segunemine erinevate genoomide vahel. Näiteks mõnede kõrgemate taimede mtDNA sisaldab cpDNA tRNA geeni ja ühel liigil on leitud mtDNA koostises ka kloroplasti geen, mis kodeerib ribuloos 1,5-bifosfaadi karboksülaasi suurt subühikut. Sama ensüümi väikest subühikut kodeeriv geen paikneb tavaliselt rakutuumas, kuid mõnedel vetikaliikidel on ta kloroplastide genoomis.

 

Võrreldes tuumageenide evolutsioneerumise kiirusega toimub mitokondrionaalsete geenide evolutsioneerumine kuni 10 korda kiiremini. Seda on olnud varmad ära kasutama molekulaarse evolutsiooni uurijad, kuna mtDNA-s tekkinud mutatsioonide analüüs võimaldab dateerida evolutsioonilisi sündmusi täpsemalt kui tuumageenides toimunud mutatsioonide analüüs. mtDNA analüüs võimaldab rekonstrueerida ka sündmusi, mis eluslooduse evolutsiooni seisukohalt on toimunud alles suhteliselt hiljuti, nii 10000 - 15000 aastat tagasi.

 

 

 

19. - 20.  Molekulaargeneetika meetodid. Genoomi uuringud. Geenide ja geeniproduktide molekulaarne analüüs.

 

Kaasajal kasutatakse geenide molekulaarseks analüüsiks rekombinantse DNA tehnoloogiat. Tehnoloogia põhineb DNA fragmentide isoleerimisel genoomist ning viimisel väikestesse replitseeruvatesse DNA molekulidesse – kloneerimisvektoritesse, mis võimaldavad rekombinantset DNA-d amplifitseerida, saada selle paljundamisel koopiaid e. kloone. Vastavat protseduuri nimetatakse geenide kloneerimiseks. Kloneerimisel on mitmeid rakendusi:

          1) DNA primaarjärjestuse määramine

          2) geeni(de) avaldumise regulatsiooni uurimine

          3) geeniproduktide funktsioonide uurimine

          4) geenitehnoloogia

 

Paljude kloneerimisvektorite konstrueerimisel on kasutatud bakteriofaagide genoomi ja bakterite ekstrakromosomaalseid elemente - plasmiide. Need võimaldavad DNA fragmenti amplifitseerida ja selles sisalduva geneetilise informatsiooni avaldumist uurida bakterirakus. Lisaks on konstrueeritud hulgaliselt ka eukarüootseid vektoreid, mis põhinevad enamasti eukarüoodi viiruste genoomidel.

 

Rekombinantse DNA tehnoloogia muutis võimalikuks restriktsiooniliste endonukleaaside e. restriktaaside kasutuselevõtmine. Restriktaaside olemasolu ilmnes Werner Arber’i poolt 1960-ndatel aastatel teostatud katsetes bakteriofaagidega, kus selgus, et bakteriofaagide paljunemine oli teatud bakteritüvedes piiratud. Restriktsioonilised endonukleaasid avastati 1970-ndal aastal Hamilton Smith’i ja Daniel Nathans’I poolt. Rekombinantse DNA tehnoloogias kasutatakse tüüp II restriktaase. Need ensüümid lõikavad DNA fragmentideks (lõhuvad DNA ahela fosfodeestersidemed) spetsiifilistest palindroomsetest järjestustest. Sageli lõikavad nad DNA vastasahelaid erinevatest kohtadest, produtseerides sel juhul “kleepuvate otstega” DNA fragmente (DNA üksikahelalised otsad on omavahel komplementaarsed). Sama restriktaasi poolt äratuntavaid DNA järjestusi on genoomis palju. Rekombinantse DNA konstrueerimiseks kasutatakse kloneerimisvektoreid. Kui nii kloneerimisvektori DNA-d kui ka kloneeritavat DNA-d on lõigatud ühe ja sama restriktaasiga, saame kloneerimisvektori otste vahele “kleepida” uuritava DNA lõigu. Fosfodiestersidemete moodustumiseks kloneerimisvektori DNA ja uuritava DNA lõigu otste vahele kasutatakse ensüümi DNA ligaas. Esimene rekombinantne DNA molekul konstrueeriti Stanfordi Ülikoolis Paul Berg’i laboris, kus faag lambda geenid olid viidud ahviviiruse SV40 genoomi. SV40 genoom on dsDNA rõngasmolekul. Veidi hiljem viisid Stanley Cohen ja tema kolleegid EcoRI-ga lõigatud DNA fragmendi bakteri plasmiidi ja näitasid rekombinantse DNA replitseerumist E. coli rakkudes. Võrreldes varasemate geneetiliste katsetega avas rekombinantse DNA tehnoloogia täiesti uued perspektiivid molekulaargeneetikas.

 

Rekombinantse DNA isoleerimiseks ja amplifitseerimiseks peavad kloneerimisvektoril olema järgmised omadused:

1.         Võime iseseisvalt replitseeruda (sisaldab ori piirkonda (DNA replikatsiooni alguspunkt) ja replikatsiooni initsiaatorvalgu geeni).

2.         Sisaldab dominantset selektiivset markergeeni. Tavaliselt on selleks antibiootikumi resistentsusgeen.

3.         Sisaldab unikaalseid restriktaaside lõikesaite. Selleks, et saaks kombineeritult kasutada erinevaid restriktaase, on paljudesse vektoritesse viidud sünteetiline DNA järjestus, mis sisaldab unikaalseid lõikesaite erinevatele restriktaasidele. Seda DNA järjestust nimetatakse polülinkeriks e. multikloneerimissaidiks.

 

Plasmiidsed vektorid.

 

Plasmiidsed vektorid võimaldavad kloneerida väikeseid DNA fragmente. Kõige esimesena kasutati kloneerimisvektorina plasmiidi nimetusega pSC101, mis kodeerib resistentsust tetratsükliinile ja sisaldab unikaalset EcoRI saiti. Seejärel võeti laialt kasutusele plasmiid pBR322 ning praegu kasutatavatest vektoritest on suur osa pBR322 derivaadid, mis sisaldavad pBR322 ori piirkonda.

 

1. Üldise funktsiooniga vektorid

 

a)         Insertsioonilise inaktivatsiooniga vektorid - sel juhul on kloneerimissaidid viidud vektoris olevasse geeni, mille avaldumist on lihtne testida (näiteks ravimiresistentsusgeenid - pBR322-s asuva tet geeni inaktivatsioon; värvusreaktsiooni kaudu testitav lacZ geeni inaktivatsioon pUC18 ja pUC19 vektorites).

 

 E. coli’s olev lacZ geen kodeerib b-galaktosidaasi, mis lagundab laktoosi glükoosiks ja galaktoosiks. Funktsionaalse b-galaktosidaasi olemasolu rakkudes saab testida värvusreaktsiooni abil. See ensüüm on võimeline lagundama substraati X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolüül-b-galaktosiid), mille tulemusena tekib sinist värvi produkt bromokloroindool. Seetõttu on aktiivset b-galaktosidaasi sisaldavate rakkude kolooniad X-gal-i sisaldavatel söötmetel sinist värvi. Rakud, milles b-galaktosidaas on inaktiivne, moodustavad X-gal-i söötmetel aga valgeid kolooniaid. Geenide kloneerimisel värvusreaktsiooni testimisel põhinevatesse vektoritesse kasutatakse E. coli tüvesid, kus lacZ geen on defektne. Defektne geen kodeerib valku, mille N-terminaalsest järjestusest on deleteerunud aminohapped 11-st kuni 14-nda positsioonini. Deletsiooni tõttu ei moodusta polüpeptiidid ensümaatiliselt funktsionaalset tetrameeri. Kloneerimisvektorisse on viidud on lacZ geeni järjestus, mis kodeerib b-galaktosidaasi N-terminaalset segmenti. See segment komplementeerib bakteriraku kromosoomis või F plasmiidis oleva lacZ geeni mutatsiooni. Kloneerimisvektoris oleva lacZ geeni algusossa on konstrueeritud kloneerimissaidid.  Kui kloneerimissaitidesse inserteerida võõrast DNA-d, inaktiveerub lacZ geeni järjestus ja komplementatsiooni ei toimu. Rakud, mis sisaldavad rekombinantset plasmiidi, moodustavad X-gal söötmetel valgeid kolooniaid.

 

 

b) Positiivse selektsiooniga vektorid - fragmendi inserteerimine vektorisse derepresseerib seal teatud geneetilise markeri. Näit. vektoris pUN121 on kloneerimissaidid viidud tet repressorisse. Fragmendi inserteerumise tulemusena avaldub tetratsükliini resistentsus.

 

2. Ekspressioonivektorid.

 

Insereerunud DNA-s sisalduvaid geene transkribeeritakse vektoris oleva promootori alt. Näit. pUC18 & pUC19 sisaldavad lac geenide (laktoosi metabolism) promootorit. Enamasti on transkriptsioon promootoritelt reguleeritav induktori lisamisega bakterite kasvukeskkonda.

 

3. Promootorite või transkriptsiooni terminaatorjärjestuste testimine.

 

Võimaldavad isoleerida DNA fragmente, mis sisaldavad promootorit või transkripsiooni terminaatorit. Jälgitakse vastavalt kas testgeeni transkriptsiooni aktivatsiooni või terminatsiooni.

 

 

Kosmiidid.

 

Kosmiidid on 4 - 6 kb suurused plasmiidid, mis sisaldavad faag lambda cos järjestusi. Lisaks sellele sisaldavad nad antibiootikumi resistentsusgeeni plasmiidi sisaldavate bakterirakkude selektsiooniks, järjestusi plasmiidi replikatsiooniks ja unikaalseid restriktsioonisaite kloneerimiseks. cos järjestused (cohesive ends) tuntakse ära faag lambda pakkimisaparaadi poolt, lõikamisel cos saidist tekivad 12-bp ssDNA otsad.

 

Kosmiidid võimaldavad kloneerida suuri, kuni 45 kb pikkusi DNA fragmente. Seetõttu kasutatakse kosmiide sageli ka genoomsete DNA raamatukogude tegemiseks. Rekombinantse DNA molekulid pakitakse in vitro faagi kapsiidi. Kuna pakkimisel on olulised ainult cos saidid ja DNA molekuli pikkus, pakitakse ainult rekombinantsed DNA molekulid kindla insertsiooni pikkusega. Nakatatud rakkudes replitseerub vektor nagu plasmiid, selektsiooniks on ravimi resistentsusgeeni avaldumine.

 

Fagemiidid.

 

Sisaldavad plasmiidi replikatsiooni initsiatsiooniks vajalikke järjestusi, selektsioonimarkerit ning filamentse faagi genoomi. DNA fragmente kloneeritakse fagemiididesse ja rekombinantset DNA-d paljundatakse samal viisil nagu plasmiidide puhul. Rakkude nakatamisel sobiva helperfaagiga toimub ümberlülitumine plasmiidi replikatsioonilt üksikahelalise DNA replikatsioonile. Fagemiidide puhul on võimalik eraldada nii dsDNA-d kui ka ssDNA-d. ssDNA-d eraldatakse faagipartiklitest ja sellel on mitu kasutust:

          DNA nukleotiidse järjestuse määramine

          DNA koht-suunatud mutagenees

          ahela-spetsiifiliste DNA proovide valmistamine nukleiinhapete hübridisatsiooniks

 

 

 

 

Vektorid bakteriofaagide DNA-st.

 

Kasutatakse nii ssDNA kui ka dsDNA faagide genoome.

 

1. ssDNA faagid (filamentsed) f1, M13.

 

Filamentsed faagid nakatavad rakke F-pilide kaudu. Seetõttu peavad nakatatavad rakud olema “isased”, s. t. sisaldama F-plasmiidi. Filamentsete faagide genoomiks on ssDNA, mis on kodeeriv ahel e. (+) ahel. ssDNA genoomi paljundamine toimub üle dsDNA vahevormi, mida nimetatakse replikatiivseks vormiks RF.

 

M13 genoomi baasil on konstrueeritud vektorid M13mp18 ja M13mp19. Nad sisaldavad sama multikloneerimissaiti nagu pUC19 ja pUC18 ja lacZ geeni järjestust. Rekombinantsete plasmiidide teket testitakse värvusreaktsiooni kaudu. Faagipartiklisse pakitakse alati (+) ahel. Sõltuvalt fragmendi orientatsioonist vektori replikatsiooni alguspunkti suhtes on võimalik ssDNA-na amplifitseerida valikuliselt kas ühte või teist kloneeritud DNA  ahelatest. ssDNA isoleeritakse faagipartiklitest, dsDNA (RF) isoleerimine toimub aga rakkudest.

 

2. dsDNA faagid.

 

Enamus kloneerimisvektoreid on konstrueeritud faag lambda DNA põhjal. Need võimaldavad kloneerida suuri DNA fragmente. Välja on töötatud süsteemid, mis takistavad mitterekombinantide paljunemist. Erinevad rekombinantsed molekulid katavad kogu genoomi. Rekombinantsete molekulide panka nimetatakse ka DNA raamatukoguks. Rekombinantseid DNA molekule sisaldavaid faagipartikleid sisaldavat lüsaati säilitatakse 4° C juures 0,3% kloroformi juuresolekul.

 

Eukarüootsed kloneerimisvektorid

 

Eukarüootseid vektoreid on konstrueeritud rekombinantse DNA amplifitseerimiseks ja ekspressiooni uurimiseks nii pärmi S. cerevisiae, äädikakärbse D. melanogaster kui ka imetajate, taimede ja teiste organismide rakkudes. Nende üldpõhimõte on sama, mis bakterite kloneerimisvektoritelgi. Loodud on ka vektoreid, mis on korraga võimelised replitseeruma erinevates organismides, näiteks bakteris ja pärmis. Sel juhul sisaldab vektor replikatsiooniks nii bakteri kui ka eukarüoodi ori järjestusi.

 

Kunstlikud kromosoomid

 

Plasmiidide või viiruste baasil konstrueeritud vektorid ei võimalda kloneerida üle 45 kb pikkuseid DNA fragmente. Mõned eukarüootsed geenid on aga liiga suured, et neid sellistesse vektoritesse viia. Näiteks inimese düstrofiini kodeeriv geen asub 2000 kb pikkuses alas. Suuemate DNA segmentide kloneerimiseks kasutatakse pärmi kunstlikke kromosoome YAC-e (yeast artificial chromosomes), mis lubavad kloneerida 200 – 500 kb suuruseid fragmente. YAC-id sisaldavad pärmi replikatsiooni ori piirkonda, pärmi tsentromeeri, kahte pärmikromosoomi telomeeri molekuli mõlemas otsas, selektiivset markerit ja multikloneerimissaiti. Pärmi replikatsiooni ori järjestust nimetatakse ARS (autonomously replicating sequence) elemendiks. Selektiivseks markeriks on tavaliselt metsiktüüpi geen, mis taastab peremeesraku prototroofsuse. Näiteks markerit URA3⁺ kasutatakse URA3^- auksotroofide (ei ole võimelised kasvama minimaalsöötmel, kuhu pole lisatud uratsiili) transformatsiooniks. YAC vektoreid on palju kasutatud inimese genoomi projekti HUGO raames.

 

Suurte DNA fragmentide kloneerimisel on hiljuti kasutusele võetud ka bakterite kunstlikud kromosoomid BAC-id (bacterial artificial chromosomes), millel on eeliseid YAC-ide ees. BAC-id on konstrueeritud F plasmiidi baasil ja on YAC-idega võrreldes vähem komplekssed. Nad replitseeruvad E. coli rakkudes sarnaselt plasmiididega.  

 

DNA raamatukogude konstrueerimine ja analüüs.

 

Mingi geeni kloneerimine organismi genoomist algab tavaliselt genoomse DNA raamatukogu (ingl. k. library) konstrueerimisest. Genoomne DNA raamatukogu sisaldab erinevaid DNA kloone, mis katavad summaarselt kogu genoomi. Võimalik on konstrueerida ka kromosoomi-spetsiifilisi DNA raamatukogusid. Alternatiivne võimalus geenide kloneerimiseks on lähtuda rakkudest isoleeritud mRNA-st. Sel juhul sünteesitakse mRNA-lt pöördtranskriptaasiga komplementaarne DNA ahel cDNA (complementary DNA). cDNA viiakse kaksikahelaliseks DNA polümeraasi abil ja kloneeritakse seejärel plasmiidi või viiruse genoomil põhinevasse vektorisse. cDNA raamatukogu sisaldab ainult ekspresseeruvate geenide kodeerivaid järjestusi.

 

Genoomse raamatukogu konstrueerimine.

 

Genoomse raamatukogu konstrueerimisel eraldatakse totaalne DNA, lõigatakse seda restriktaasidega ning DNA fragmendid inserteeritakse kloneerimisvektorisse. DNA fragmentide ja vektori DNA molekuli kleepuvad otsad võivad olla tekitatud kas restriktaasi poolt või on nad molekulide tömpidele otstele lisatud. Kui DNA-d on lõigatud restriktaasiga, mis genereerib tömbid otsad, töödeldakse nii vektorit kui fragmente esmalt faag lambda eksonukleaasiga (DNA “süüakse” ahelate 5’ otstest lühemaks) ning seejärel lisatakse 3’ üksikahelalistele otstele terminaalse transferaasi abil nukleotiide. Tavaliselt lisatakse vektori DNA-le polü-A sabad ja genoomse DNA fragmentidele polü-T sabad. Järgnevalt liidetakse genoomse DNA fragmendid vektoriga DNA-ga. Kuna sünteesitud polü-A ja polü-T järjestused ei pruugi ühepikkused olla, lisatakse reaktsioonisegusse ka E. coli eksonukleaas III, mis lagundab rekombinantsetest rõngasmolekulidest väljaulatuvad üksikahelalised otsad. DNA polümeraasi I abil sünteesitakse üksikahelalistele DNA piirkondadele komplementaarne järjestus ning T4 DNA ligaas ühendab vektori ja inserteeritava DNA otsad, moodustades otste vahele fosfodiestersidemd. Rekombinantsete DNA molekulide paljundamiseks transformeeritakse nende seguga E. coli rakke. Transformante selekteeritakse vektoris sisalduva antibiootikumi resistentsusmarkeri järgi. Selleks, et genoomses raamatukogus sisalduksid kõik genoomi järjestused, on vaja produtseerida teatav arv rekombinantseid kloone. Rekombinantsete kloonide arv N sõltub genoomi suurusest. Kui me eeldame, et kõigil DNA fragmentidel on võrdne võimalus saada inserteeritud kloneerimisvektorisse, saame arvutada kloonide hulga, mis on vajalik, et antud tõenäosusega P isoleerida meid huvitav rekombinantse DNA kloon.

 

        ln (1 – P)

N = ^{_____________}

        ln (1 – f)

 

f näitab seda, kui suure fraktsiooni genoomist võtab enda alla keskmise pikkusega DNA fragment DNA raamatukogus.

 

Arvutame näiteks kloonide arvu, mis on vajalik selleks, et äädikakärbse genoomses raamatukogus oleksid 99% tõenäosusega esindatud kõik genoomi järjestused. Drosophila  genoom on suurusega 10⁵ kb. Juhul, kui kasutame vektorina kosmiidi, kloneeruvad keskmiselt 40 kb suurused DNA fragmendid.  

 

        ln (1 – 0,99)

N = ^{______________________}     =  11513

        ln (1 – 40/100000)

 

 

cDNA raamatukogu konstrueerimine.

 

Kõrgemate loomade ja taimede genoomis on palju DNA järjestusi, mis on geneetiliselt inaktiivsed. Funktsionaalsete DNA järjestuste kloneerimiseks on otstarbekas sünteesida rakus ekspresseeruvale mRNA-le komplementaarne DNA. Kuna enamus eukarüootseid mRNA molekule sisaldavad 3’ otsas polü-A saba, kasutatakse DNA sünteesil praimerina polü-T oligomeere. cDNA sünteesil ja kloneerimisel kasutatakse mitmeid erinevaid ensüüme. Kõigepealt sünteesib pöördtranskriptaas e. revertaas mRNA-le komplementaarse DNA ahela. Seejärel konverteeritakse RNA-DNA dupleks dsDNA molekuliks ribonukleaas H, DNA polümeraas I ja ligaasi abil. Ribonukleaas H degradeerib RNA ahela. RNA degradatsioonil tekkinud lühikesed fragmendid on praimeriteks DNA sünteesil. DNA teise ahela sünteesib DNA polümeraas I, mis ühtlasi kõrvaldab molekulist ka RNA praimerid, asendades RNA järjestuse DNA järjestusega. Seejärel parandab DNA ligaas sünteesitud DNA molekulis üksikahelalised katked. Kaksikahelalised cDNA molekulid inserteeritakse vektorisse eelpool kirjeldatud strateegia alusel, kus oli vaja kasutada kleepuvate otste tekitamiseks terminaalset transferaasi.

 

Huvipakkuva geeni isoleerimine DNA raamatukogust.

 

Inimese genoom on 3 x 10⁹ bp suurune. Seega tuleb konkreetse DNA fragmendi ülesleidmiseks inimese DNA raamatukogust läbi testida ligi miljon klooni. Geenide isoleerimiseks DNA raamatukogust kasutatakse einevaid meetodeid. Kõige võimsam meetod huvipakkuva DNA järjestuse isoleerimiseks on metsiktüüpi fenotüübi taastamine komplementatsiooni tulemusena. Kui geneetilist selektsiooni ei ole võimalik rakendada, tulevad appi nukleiinhapete hübridisatsiooni meetodid ja immunoloogilised meetodid.

 

Geneetiline selektsioon.

 

Geneetilist selektsiooni on rakendatud näiteks Salmonella typhimurium’i puhul penitsilliini resistentsusgeeni isoleerimisel. Kõigepealt konstrueeriti penitsilliini resistentse S. typhimuriumi bakteritüve genoomne raamatukogu ja seejärel transformeeriti penitsilliini-tundlikke E. coli rakke rekombinantsete DNA molekulidega, selekteerides baktereid penitsilliini sisaldavatel söötmetel. Bakterid, mis selektiivsöötmel kasvama hakkasid, sisaldasid rekombinantses plasmiidis huvipakkuvat DNA järjestust. Geneetilisel selektsioonil kasutatakse sageli mutantide komplementeerimist. Mõnede geenide osas on võimalik E. coli mutante komplementeerida ka eukarüootsete DNA järjestustega. Näiteks E. coli His^- auksotroofsed mutandid on komplementeeritavad pärmi S. cerevisiae histidiini biosünteesi kodeerivate geenide poolt. Maisist isoleeritud glutamiini süntetaasi kodeeriv geen on samuti võimeline komplementeerima E. coli vastavat mutanti. Kuna eukarüootsed geenid sisaldavad introneid, kuid bakterites RNA splaissingut ei toimu, on komplementatsioonikatsed E. coli mutantidega piiratud cDNA kasutamisega (cDNA on sünteesitud eukarüoodi rakus mRNA-lt, milles splaissing on juba toimunud). Kuna geenide avaldumise regulatsioon bakterirakus ja eukarüoodis on siiski erinev, eelistatakse eukarüootsete DNA raamatukogude analüüsimisel komplementeerida S. cerevisiae mutante.

 

Molekulaarne hübridisatsioon.

 

Kui genoomse raamatukogu koostamisel on kasutatud plasmiidseid vektoreid, hübridiseeritakse in situ transformantide kolooniaid, kui kosmiide, siis faagilaike. Hübridisatsiooniprotseduur on mõlemal juhul sama. Vaatleme järgnevalt detailsemalt kolooniahübridisatsiooni. Transformantide kolooniatest tehakse jäljendid nitrotselluloos- või nailonfiltritele, filtrile kandunud rakud lüüsitakse kohapeal, nukleiinhape immobiliseeritakse filtrile ning seejärel hübridiseeritakse filtril olevaid DNA-sid radioaktiivse DNA või RNA sondiga, mis sisaldab homoloogilisi järjestusi meile huvitavale geenile. Seejärel pestakse filtreid puhverlahustega, et kõrvaldada mittehübridiseerunud radioaktiivne materjal ning filtreid eksponeeritakse röntgenfilmile. Filmid ilmutatakse. Need kohad filtril, kuhu on kinnitunud radioaktiivne märge, ilmuvad filmile tumedate plekkidena. Plekkide asukoht filtril võimaldab lokaliseerida söötmel need kolooniad, mis sisaldavad rekombinantses plasmiidis meile huvipakkuvat geeni.

 

DNA, RNA ja valkude molekulaarne analüüs.

 

DNA analüüs “Sothern blot” meetodil.

 

DNA molekulid on negatiivselt laetud. Geelelektroforesil liiguvad DNA fragmendid “-“ elektroodilt “+” elektroodi suunas. Geel valmistatakse kas agaroosist või akrüülamiidist. Mida suuremad on DNA fragmendid, seda enam takerduvad nad geeli graanulite taha ja liiguvad seetõttu võrreldes väiksemate DNA molekulidega geelis aeglasemalt. Kui agaroosgeeli on värvitud etiidiumbromiidiga (etiidiumbromiid seondub DNA kaksikheeliksi väiksesse vakku) on DNA fragmendid geelis UV-lambiga vaadates nähtavad.

 

1975-ndal aastal publitseeris E. M. Southern meetodi, mis võimaldas DNA fragmentide parvest lokaliseerida need fragmendid, mis sisaldasid huvipakkuvat järjestust. Selleks DNA restrikteeriti, DNA fragmendid lahutati geelis elektroforeesil ning voolutati geelist nitrotselluloosfiltrile. “Blotting-paper” tähendab ingl. k. kuivatuspaberit. Geelile asetati nitrotselluloosfilter ja sellele otsa virn filterpabereid, mis imasid vedelikku üles, tõmmates sellega DNA geelist filtrile. Järgnes hübridisatsiooniprotseduur, mis on tuttav juba eelpoolkirjeldatud kolooniahübridisatsioonist. Huvipakkuvate DNA fragmentide pikkust näitas  filtril oleva hübridisatsioonisignaali asukoht. Radioaktiivse sondi (DNA või RNA proovi) valmistamiseks on mitu võimalust:

1)        radioaktiivselt märgitud nukleotiidtrifosfaadi (sisaldab ³²P isotoopi) lisamine DNA molekuli otstesse polünukleotiidi kinaasiga.

2)        dsDNA märkimine “nick-translation” meetodil. Endonukleaas teeb DNA molekuli üksikahelalisi katkeid (ingl. k. “nicks”). Kuna E. coli DNA polümeraasil I on nii 5’® 3’ eksonukleaasne aktiivsus kui ka 5’®3’ polümeraasne aktiivsus, asendab ta märgitavas DNA fragmendis mitteradioaktiivsed nukleotiidid radioaktiivsetega.

3)        Radioaktiivse RNA sünteesimine in vitro.

 

RNA analüüs “Nothern blot” meetodil

 

Järgmine teadlane, kes töötas välja RNA-de identifitseerimise meetodi, mis põhines RNA-de lahutamisel geelelektoforeesil ning nende hübridiseerimisel radioaktiivse prooviga filtritel, ei olnud Nothern, kuid hea algus meetodite nimetamisele oli “Southern bloti” näol juba tehtud. “Nothern blot” meetodi põhimõte ei erine “Southern blot” meetodi põhimõttest. Ainus erinevus on filtrile kantavas nukleiinhappes ja geelelektroforeesi tingimustes. RNA geele lastakse denatureerivas geelis (näiteks formaldehüüdi juuresolekul). Seda tehakse RNA sekundaarstruktuuride vältimiseks. Vastasel juhul liiguks RNA geelis hajusalt ja erinevaid RNA-sid poleks geelis suuruse järgi võimalik lahutada. “Nothern blot” võimaldab analüüsida, kas ja mis tingimustel huvipakkuv geen rakus avaldub.

 

Valkude analüüs “Western blot” meetodil

 

Polüakrüülamiidgeel-geelelektroforeesil on võimalik suuruse järgi lahutada erinevaid polüpeptiide. Paljud funktsionaalsed valgud koosnevad mitmest polüpeptiidist. Polüpeptiidide separeerimiseks geelis kasutatakse naatriumdodetsüül sulfaati (SDS), mis denatureerib valgud. Polüpeptiide saab geelis visualiseerida geeli värvimisel Coomassie sinisega või hõbeda sooladega. Valkude ülekandmist polüakrüülamiidgeelist nitrotselluloosfiltrile teostatakse elektriväljas ning vastavat protseduuri nimetatakse Western blotting’uks. Filtrit töödeldakse lahusega, mis sisaldab analüüsitava valgu vastaseid antikehi. Valguga seondunud antikeha lokaliseeritakse sekundaarse antikehaga, mida on võimalik tuua nähtavaks näiteks ensümaatilise reaktsiooniga.

 

 

Geenide ja kromosoomide molekulaarne analüüs.

 

Genoomi füüsilise kaardistamise lõppetapiks on genoomi nukleotiidse järjestuse määramine. Nukleotiidse järjestuse määramist nimetatakse sekveneerimiseks. Praeguseks on sekveneeritud paljude viiruste ja bakterite genoomid, aga ka mõnede eukarüootide, näiteks S. cereviae ja C. elegans genoomid. Aastal 2000 peaks lõpule jõudma inimese genoomi primaarjärjestuse määramine. Enne genoomi sekveneerimist koostatakse kromosoomide restriktsioonikaart.

 

DNA amplifitseerimine PCR (polymerase chain reaction) meetodil

 

PCR meetod võimaldab genoomist spetsiifiliselt amplifitseerida suvalist DNA järjestust. Meetodi juurutaja Kary Mullis sai selle idee eest 1993-ndal aastal Nobeli preemia. PCR rakendamiseks on vaja teada amplifitseeritavast DNA primaarjärjestust paljundatava DNA piirkonna mõlemas otsas. PCR toimub 3-etapiliselt:

1.         Amplifitseeritava DNA denatureerimine temperatuuri toimel (92°C - 95°C juures).

2.         DNA renatureerimine temperatuuri langetamisel ülehulgas lisatud sünteetiliste oligonukleotiidsete praimerite juuresolekul, millest üks on komplementaarne amplifitseeritava DNA ühele ahelale, teine selle vastasahelale. Selle tulemusena hübridiseeruvad praimerid amplifitseeritava DNA ahelatega.

3.         DNA replikatsioon ahelatele kinnitunud praimerite 3’-OH otstest (temperatuur tõstetakse 72°C juurde).

 

Praimerite vahele jääva DNA amplifitseerimiseks korratakse tsüklit vähemalt 20 korda: peale DNA sünteesi etappi tõstetakse jälle reaktsioonikeskkonna temperatuuri, et DNA ahelaid denatureerida, seejärel langetatakse temperatuuri praimerite kinnitumiseks üksikahelalisele DNA-le ja järgneb DNA replikatsioon. PCR-i läbiviimiseks kasutatakse termostabiilset DNA polümeraasi. Kõige levinum on Taq polümeraas, mis pärineb Thermus aquaticus’est.

 

PCR meetod on oluliselt lihtsustanud DNA kloneerimist ja DNA järjestuse analüüsimist, kuna võimaldab startida väga väikesest DNA hulgast. See meetod on leidnud laialt rakendust diagnostikas ja isikute tuvastamises, võimaldades DNA analüüsiks spetsiifiliselt amplifitseerida DNA-d väga väikesest koematerjali hulgast.

 

DNA molekulide restriktsioonikaardi koostamine

 

Restriktaasid lõikavad DNA-d sait-spetsiifiliselt. Restriktsioonifragmentide suurust on võimalik hinnata geelelektroforeetliselt, kasutades fragmentide suurusmarkeriteks kindla pikkusega DNA fragmente. Kombineerides erinevaid restriktaase ja analüüsides tekkinud fragmentide suurusi on võimalik koostada erinevate genoomide või plasmiidide restriktsioonikaarte. Väiksemate DNA molekulide kaardistamisel tähistatakse restriktaasi lõikamise tulemusena tekkinud fragmendid alfabeetiliselt, alustades kõige suuremast fragmendist. Näiteks 6000 bp DNA molekuli HindIII-ga lõikamise tulemusel tekkinud 3 fragmenti suurustega 4000 bp, 1500 bp ja 500 bp tähistatud fragmentidena A, B ja C. Restriktsioonikaarte kombineeritakse geneetiliste kaartidega. Nii võime näiteks öelda, et teatav geen paikneb HindIII fragmendis B.

 

DNA nukleotiidse järjestuse määramine.

 

1976-ndal aastal sekveneeriti bakteriofaagi FC174 genoom. See oli esimene genoomi primaarjärjestus. Praeguseks on DNA primaarjärjestuse määramine muutunud rutiinseks tegevuseks. DNA sekveneerimise muutsid võimalikuks rekombinantse DNA tehnoloogia, mille tulemusena suudeti genoomi spetsiifilist segmenti paljundada ja geelelektroforeesi kasutamine erineva pikkusega DNA fragmentide lahutamiseks. DNA sekveneerimine põhineb DNA fragmentide populatsiooni analüüsil, kus kõik fragmendid algavad samast nukleotiidist kuid lõpevad sellest statistiliselt erinevatel kaugustel. Korraga analüüsitakse nelja fragmentide segu, millest ühes lõpevad kõik fragmendid suvalisest G nukleotiidist, teises A nukleotiidist, kolmandas T nukleotiidist ja neljandas C nukleotiidist.

 

DNA sekveneerimiseks kasutatakse nii keemilist kui ka ensümaatilist meetodit. Keemilise meetodi töötasid välja Maxam ja Gilbert ja see meetod põhineb keemilistel reaktsioonidel, mis võimaldavad DNA ahelat spetsiifiliselt katkestada kas A, G, C või C + T kohalt. Keemiline meetod oli laiemalt kasutusel DNA sekveneerimise algaastatel.

 

Ensümaatilise meetodi töötasid välja Sanger ja tema kolleegid. Nad viisid läbi DNA in vitro sünteesi, kus reaktsioonisegusse on lisatud DNA polümeraas (tavaliselt on selleks faagi T7 polümeraas või selle modifitseeritud variant), 4 erinevat deoksüribonukleotiidi, radioaktiivselt märgitud deoksüribonukleotiid ja 4 spetsiifilist terminaatornukleotiidi. Selle tulemusena tekivad radioaktiivselt märgistatud DNA fragmendid, mis algavad kõik samast kohast, kuid nende süntees on termineerunud erinevatest kohtadest. Terminaatornukleotiididena kasutatakse dideoksüribonukleotiide (ddNTP), mis blokeerivad DNA ahela edasise sünteesi. ddNTP-d lülituvad sünteesitavatesse DNA ahelatesse statistiliselt. Reaktsioon viiakse läbi 4 paralleelina, kus reaktsioonisegussse, mis sisaldab tavalisi nukleotiide, on lisatud ka kas ddATP, ddGTP, ddCTP või ddTTP. Seejärel reaktsioonisegud denatureeritakse, et vabastada sünteesitud DNA fragmendid matriitsahelalt ja fragmendid lahutatakse polüakrüülamiidgeelis. Neljast erinevast nukleotiidist termineerunud reaktsioonid kantakse geelile eraldi radadena. Geelelektroforeesi tingimused on sellised, et sünteesitud DNA fragmendid eristuvad geelis üksteisest ühenukleotiidse täpsusega. Mida lühem on fragment, seda kiiremini liigub ta geelis. See võimaldab DNA fragmentide mustrist lugeda välja DNA lõigu nukleotiidset järjestust. DNA fragmendid tuuakse nähtavale kas geelist autradiograafa tegemisel või spetsiaalse aparatuuri abil, mis detekteerib radioaktiivset fosforit (PhosphoImager).

 

Praeguseks on DNA sekveneerimisel kasutusel erinevaid Sangeri meetodi modifikatsioone. Mõned neist on kombineeritud PCR meetodiga. Suurte sekveneerimisprojektide puhul kasutatakse automaatsekvenaatoreid. 

 

 

 

 

 

Genoomi uuringud (genomics).

 

Genoomi uuringud võib jaotada kaheks:

 

1.          Struktuuri uuringud (structural genomics) - erinevate organismide genoomi kaardistamine ja primaarstruktuuri määramine.

2.          Funktsiooni uuringud (functional genomics) - uuritakse organismi kõigi geenide avaldumist organismi kasvu ja arengu erinevatel etappidel ning erinevatel keskkonnatingimustel.

 

Kromosoomide geneetilise, tsütoloogilise ja füüsilise kaardi kokkuviimine - geenide positsiooniline kloneerimine.

 

Geenide identifitseerimiseks ja isoleerimiseks tuleb lokaliseerida nende asukoht genoomis. Geeni asukoha määramisel kromosoomis lähtutakse molekulaarsetest markeritest, milleks võib olla teatav DNA järjestus genoomis, mille asukoht on kromosoomis eelnevalt kindlaks tehtud. Esmalt kaardistatakse geen teatud kromosoomi regiooni lähtudes ristamiskatsete geneetilisest analüüsist või inimesel sugupuude analüüsist. Seejärel seostatakse huvipakkuva geeni asukoht teatud molekulaarse markeriga füüsilisel kaardil. Nii metsiktüüpi isendist kui ka tema mutantsest järglasest isoleeritakse DNA segment, mis sisaldab huvipakkuva geeniga seostatud molekulaarset markerit ja sekveneeritakse. Mutatsiooni asukoht peaks viitama huvipakkuvale geenile. Vastavat meetodit nimetatakse geenide positsiooniliseks kloneerimiseks. Sel viisil on inimesel näiteks identifitseeritud Huntingtoni tõbe ja tsüstilist fibroosi põhjustavad alleelid. 

 

Geneetilised kaardid on koostatud lähtudes rekombinatsioonisagedustest. 1 centiMorgan (cM) vastab geenidevahelisele kaugusele, mille puhul geenide rekombinatsioon toimub sagedusega 1%. Füüsiliste kaartide (tavaliselt on selleks restriktsioonikaart) puhul mõõdetakse vahemaid molekulaarselt – aluspaaride (bp), kilobaaside (kilobase, kb) või megabaaside (megabase, mb) kaudu. Kuigi geenide molekulaarne distants üksteisest ei pruugi alati korreleeruda nende geneetilise kaugusega (kuna kõik genoomi piirkonnad pole rekombinatsiooniliselt võrdväärsed) vastab 1 cM inimese kromosoomis eukromatiini sisaldavas alas ligikaudu 1 mb-le e. 1000 kb-le (miljon aluspaari).

 

Lisaks restriktsioonikaardile võib füüsiline kaart olla esitatud ka kontiigi (contigs) kaardina. Erinevate genoomsete kloonide restriktsioonikaartide kompuuteranalüüs võimaldab välja selgitada kattuvad kloonid ja ühendada külgevate DNA järjestuste restriktsioonikaardid. Osaliselt kattuvad kloonid on kontiigid. Nende abil suudetakse lõpuks koostada kogu kromosoomi füüsiline kaart.

 

Molekulaarsed markerid.

 

Kaardistamisel püütakse geneetiline ja füüsiline kaart viia kokku markerite osas, mida leidub genoomis sageli. Üheks selliseks markeriks on restriktsioonifragmentide erinev pikkus RFLP (restriction fragment length polymorphism). Geneetilist ja füüsilist kaarti võrreldakse ka kromosoomide tsütoloogilise kaardiga (triipude muster kromosoomis, kui kromosoome on eelnevalt värvitud). Geenid, mis on isoleeritud, lokaliseeritakse kromosoomi tsütoloogilisel kaardil kohapeal (in situ) hübridisatsiooniga. Hübridisatsioonisignaal lokaliseerub teatavasse kromosoomi piirkonda. Geene, mis on kaardistatud nii füüsiliselt kui ka geneetiliselt, nimetatakse ankurgeenideks. Need geenid seovad füüsilise kaardi geneetilisega ja vastupidi. Ankurgeenist amplifitseeritakse 200-500 bp pikkune DNA segment PCR meetodil, mida kasutatakse proovina kromosoomide in situ hübridisatsioonil. Ankurgeenidest amplifitseeritavaid lühikesi (tavaliselt 200-500 bp) DNA järjestusi nimetatakse STS-deks (sequence tagged sites). Juhul, kui lähtutakse cDNA järjestusest (mRNA-lt sünteesitud DNA), nimetatakse neid järjestusi EST-ideks (expressed sequence tags).

 

RFLP (restriction fragment-length polymorphism) analüüs.

 

Kui mutatsioon DNA-s on tekkinud restriktaasi lõikesaiti, siis seda järjestust restriktaas enam ei lõika. Mutatsioonid võivad muuta DNA järjestust ka nii, et tekivad uued restriktaaside lõikesaidid. Seega põhjustavad mutatsioonid DNA restriktsioonifragmentide mustris erinevusi, kuna võrreldes algse DNA-ga tekib mutatsioone sisaldava DNA lõikamisel mingi kindla restriktaasiga teistsuguse pikkusega fragmente. Nii võib erinevatest isolaatidest pärinev DNA olla DNA restriktsioonanalüüsi põhjal restriktsioonisaitide suhtes polümorfne – erinevate isolaatide puhul tekivad erineva pikkusega restriktsioonifragmendid. Restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfismi RFLP-d on võimalik detekteerida näiteks “Southern blot” analüüsil. DNA restrikteeritakse, fragmendid lahutatakse geelelektroforeesil, kantakse filtrile ja hübridiseeritakse spetsiifilise radioaktiivse DNA prooviga. RFLP-d kasutatakse geneetilise markerina kromosoomide kaardistamisel. Samuti võimaldab RFLP analüüs hinnata, kas ristamisel saadud järglased on vanemtüüpi või rekombinantsed. juhul, kui on tegemist rekombinantidega, saab rekombinatsioonisageduse põhjal arvutada RFLP-de geneetilist distantsi. Sellist analüüsi on rakendatud näiteks taime Arabidopsis geneetilistes katsetes.

 

RFLP markereid kasutatakse ka inimese kromosoomide kaardistamisel. Sel juhul on vaadeldud näiteks markerite segregeerumist suguvõsas. Markerite aheldumise alusel on koostatud kaardid. Nii esitati 1992. aastal esimene inimese kromosoomide RFLP-de kaart, mis baseerus 2000-l RFLP-l.

 

Inimesel on kõige sobivamateks RFLP-deks osutunud lühikesed DNA järjestused, mis paiknevad tandeemsete kordustena. Nende koopiate arv on varieeruv, mistõttu neid kutsutakse VNTR-deks (variable number tandem repeats). VNTR-e sisaldavate restriktsioonifragmentide pikkus varieerub sellepärast, et kordusjärjestuste koopiaarv restriktsioonifragmentide vahel on erinev.

 

Mikrosatelliidid on tandeemsed 2-5 nt kordusjärjestused, mis paiknevad omakorda kõrgeltkorduvas satelliit-DNA-s. Inimesel on leitud näiteks polümorfism tandeemses dinukleotiidses AC/TG (AC ühes, TG teises ahelas) järjestuses. Mikrosatelliite on võimalik samuti kasutada molekulaarsete markeritena. Järjestus (CA)_n, kus n varieerub vahemikus 5-50, esineb inimesel iga 10 000 nt tagant. Mikrosatelliitide esinemist üle kogu genoomi on näidatud DNA hübridisatsioonil, kasutades hübridisatsiooni proovina (GT)_n järjestust. Enamasti külgnevad mikrosatelliidid unikaalsete DNA järjestuste kõrval. Kui kasutada PCR amplifitseerimisel praimeritepaari, milles üks praimeritest on komplementaarne unikaalse DNA järjestusega ning teine unikaalse järjestusega külgneva mikrosatelliidi DNA-ga, on võimalik spetsiifiliselt paljundada just selle mikrosatelliidi DNA-d sisaldavat DNA lõiku. Kuna mikrosatelliitide pikkuses esineb polümorfism, võib PCR-i abil amplifitseeritud DNA fragmendi pikkus indiviiditi varieeruda. Seetõttu on võimalik võrrelda erinevatelt indiviididelt eraldatud ja PCR teel amplifitseeritud mikrosatelliiti ja sellega külgnevat unikaalset DNA järjestust sisaldava fragmendi pikkusi ning kasutada fragmendi pikkusi sugupuude analüüsil.   

 

Geenide positsiooniline kloneerimine kromosoomidel “jalutamisega” ja “hüppamisega”

 

Kui huvipakkuva geeni lähedal (mille mutatsioon põhjustab näiteks mingit haigust) on identifitseeritud RFLP marker, on sellest markerist vaja liikuda edasi huvipakkuva geenini. Kromosoomil “jalutamine” (chromosome walking) näeb välja järgmine: RFLP markerit sisaldava genoomse DNA raamatukogu klooni baasil valmistatakse hübridisatsiooniproov ja identifitseeritakse sellega kloonid, mis sisaldavad radioaktiivselt märgitud DNA-ga  kattuvaid järjestusi. Seejärel koostatakse hübrisiseeruvate kloonide restriktsioonikaart ning valmistatakse järgmine hübridisatsiooniproov restriktsiooni-fragmendist, mille järjestus asub algse proovi järjestusest kõige kaugemal. Identifitseeritakse uue DNA proovi järjestustega kattuvaid järjestusi sisaldavad kloonid ja nii võidakse protseduuri korrata mitu korda, enne kui jõutakse välja huvipakkuva geeni järjestuseni. Seda, et kätte on saadud huvipakkuva geeni järjestus, on võimalik kontrollida mitmel viisil. Näiteks äädikakärbse puhul on näidatud metsiktüüpi alleeli sisaldava DNA järjestuse viimisel mutanti metsiktüüpi fenotüübi taastumist. Inimese geenide puhul analüüsitakse metsiktüüpi alleeli ja mutantsete alleelide nukleotiidset järjestust ning näidatakse, et mutantsed geenid ei kodeeri funktsionaalset geeniprodukti.

 

Juhul, kui huvipakkuva geeni ja molekulaarse markeri vahemaa on suur, kasutatakse kromosoomil “hüppamise” (chromosomal jumping) meetodit. Iga hüpe võimaldab edasi liikuda veidi üle 100 kb korraga. Stardipunktina lähtutakse jälle kloonist, mis sisaldab RFLP markerit ja mis isoleeriti hübridisatsiooni tulemusena. DNA-le tehakse restriktaasiga osaline lõikus, mille tulemusena saadakse suured DNA fragmendid. Fragmendi ühes otsas on algse prooviga hübridiseeruv DNA ja teises otsas unikaalne järjestus. Fragmendi otsad ligeeritakse, tekib liitjärjestus. Järgmise hübridisatsiooniproovi valmistamisel lähtutakse liitjärjestusest, märkides radioaktiivselt unikaalsed DNA järjestused. Kuna rõngasmolekulid tekitatakse suurtest restriktsioonifragmentidest, võimaldab liitjärjestuste kasutamine hübridisatsiooniproovide valmistamiseks kiiremini huvipakkuva geenini välja jõuda.

 

Genoomide sekveneerimine.

 

Bakterite genoomid.

 

1995. a. avaldati bakteri Haemophilus influenzae genoomi primaarjärjestus. Selle bakteri genoom oli 1830 137 nt pikk. Seisuga november 2000 on sekveneeritud 25 bakteri genoom ning hetkel sekveneerimisel olevate genoomide nimekiri aina pikeneb. Kõige väiksem seni sekveneeritud genoom (580 070 bp = 580 kb) kuulub bakterile Mycoplasma genitalium, kõige suurem (6300 kb) kuulub bakterile Pseudomonas aeruginosa. Sekveneeritud on ka 4640 kb pikkune E. coli genoom ja tuberkuloosi põhjustava Mycobacterium tuberculosis'e 4410 kb pikkune genoom. M. genitalium'i genoom pakub huvi eeskätt seetõttu, et võimaldab uurida, milline minimaalne kogus geene, mis võimaldavad organismil veel iseseisvalt paljuneda.

 

E. coli genoom.

 

E. coli on bakteritest geneetiliselt kõige enam uuritud organism. Tema genoomis identifitseeriti 4288 geeni, mis võiksid valku kodeerida. Ainult 1/3 neist on geenid, mida oli ka varem põhjalikult uuritud. 38% kodeerivatest järjestustest olid tundmatu funktsiooniga. Keskmine geenidevaheline kaugus E. coli genoomis on 118 bp. Valke ja ribosomaalset RNA-d kodeerivad järjestused võtavad enda alla vastavalt 87,8% ja 0,8% genoomist. Mittekodeerivaid kordusjärjestusi on 0,7% genoomist. Jääb üle veel 10,7% genoomist, mis sisaldab regulatoorseid järjestusi, tundmatu funktsiooniga järjestusi ning võimalik, et ka järjestusi, millel funktsioon puudub. Genoomse järjestuse analüüsil leiti 6 uut tRNA geeni, Leiti ka 12 uut geeni, mis on seotud viburite sünteesiga.

 

Seni sekveneeritud genoomidest oli E. coli`l kõige suurem homoloogia Haemophilus influenzae geenidega, 30% arhebakteritega ning pärmiga Saccharomyces cerevisiae 20%.

 

Iga erinevasse liiki kuuluva organismi genoomile on iseloomulik kindel G + C nukleotiidide sisaldus. Organismi tavalisest G + C väärtusest erineva G + C sisaldusega geenid reedavad nende võõrast päritolu. 755 avatud lugemisraami (ORF) 4288-st on E. coli genoomi horisontaalselt üle kandunud. See teeb ligi 18% kogu genoomist. Teoreetiliselt peaks olema toimunud viimase 100 miljoni aasta jooksul (E. coli ja Salmonella lahknesid 100 miljonit aastat tagasi) 234 ülekannet. Suurem osa horisontaalselt üle kandunud materjalist on aja jooksul elimineerunud ja seetõttu on enamus säilunud võõra päritoluga materjalist üle kandunud mitte varem kui 10 miljonit aastat tagasi. Sageli paiknevad horisontaalselt üle kandunud geenid tRNA lookuste lähedal. Kuna paljud E. coli bakteriofaagid inserteeruvad eelistatult just sellistesse kohtadesse, arvatakse neil olevat oluline roll geenide horisontaalses levis. Ka IS elemendid osalevad võõra geneetilise info ülekandel. Nimelt on 68% E. coli genoomis paiknevatest IS elementidest assotsieerunud horisontaalselt ülekantud DNA-ga.

 

Rickettsia prowazekii genoom.

 

1998. a. novembris publitseeriti ajakirjas Nature Rickettsia prowazekii genoom (Andersson et al., 1998. Nature 396:133-140). Seni sekveneeritud genoomidest on R. prowazekii genoom kõige lähedasem mitokondrite sugulane. R. prowazekii tekitab tüüfust ning on rakusisene parasiit. Ta sai oma nimetuse 20. sajandi algul tüüfuse tekitajat uurinud teadlaste H. T. Ricketts ja S. J. Prowazek järgi, kes langesid mõlemad ka ise selle haiguse ohvriks ja surid.

 

Kõige enam sarnaneb mitokondrite genoomidest R. prowazekii genoomiga alglooma Reclinomonas americana mitokondri genoom. See 69034 bp pikkune genoom sisaldab 67 geeni.

 

R.. prowazekii genoom suurusega 1 111 523 bp kodeerib 834 geeni. Nii selle genoomi kui  ka mitokondrite genoomi puhul on tegemist reduktiivse evolutsiooniga. Sedatüüpi evolutsioneerumine on iseloomulik just rakusisestele parasiitidele, kes kaotavad järk-järgult geneetilist informatsiooni. Kaotsiläinud geenide funktsioone komplementeerivad peremeesorganismi rakutuumas paiknevad geenid. R. prowazekii’l puuduvad näiteks anaeroobse glükolüüsi geenid, samuti enamus aminohapete ja nukleotiidide sünteesiks vajalikke geene. Samas kodeerib R. prowazekii genoom trikarboksüülhapete tsükli ja hingamisahela ensüüme. ATP sünteesiaparaati kodeerivad geenid esinevad nii mitokondrite kui ka R. prowazekii genoomi puhul. R. prowazekii genoomis on 24% mittekodeerivat DNA-d, mis on bakterite genoomi kohta erakordselt kõrge protsent. Selline hulk mittekodeerivat DNA-d on säilunud genoomis seetõttu, kuna bakteri parasiitse eluviisi tõttu puudub rakkudele kiirelt toimiv selektsioon. Järk-järgult mittefunktsionaalse DNA kõrvaldumine küll toimub, kuid samal ajal võivad tekkida üha uued inaktiveeriva toimega mutatsioonid järgmistes geenides. Kahjulike mutatsioonide akumuleerumine ei pruugi parasiidile olla letaalne, kuna kadunud funktsiooni komplementeerivad peremeesorganismi geenid. Nii toimubki inaktiveerivate mutatsioonide tulemusena pseudogeenistumine. Pseudogeenidesse tekivad omakorda järgmised mutatsioonid, mille tulemusena pole algne DNA järjestus enam äratuntav. Lõpuks deleteeruvad ka viimased fragmendid geenist. Konkreetne näide pseudogeenistumisest ja sellele järgnevast protsessist on praegu jälgitav S-adenosüülmetioniini süntetaasi kodeeriva geeni metK puhul. See geen ei ole R. prowazekii genoomis funktsionaalne, sest keset geeni paikneb terminatsiooni koodon. Kuigi geen metK on bakterites kõrgelt konserveerunud, on leitud terminatsiooni koodoneid, insertsioone ja väikeseid deletsioone keset geeni ka teistel Riketsiate isolaatidel.    

 

Arhede genoom

 

Praeguseks sekveneeritud arhede genoomide primaarjärjestuste analüüsi põhjal on leitud, et osa nende geene sarnanevad bakteritele, osa aga eukarüootidele. Leitud on ka täiesti unikaalseid geene. 1996-ndal aastal avaldati Methanococcus jannaschii genoomi järjestus (see oli üldse esimene sekveneeritud arhe genoom). Siis arvati, et 56% 1738-st identifitseeritud geenist on unikaalsed. Uute andmete lisandumisel üha uute genoomide sekveneerimisest on see protsent järjest vähenenud. Nii oli juba 1997-nda aasta lõpuks leitud M. jannaschii geenidele 73% homolooge, seda eeskätt bakteriaalsete geenide varal.

M. jannaschii elutseb Vaikse Ookeani sügavustes, kus temperatuur on 48 - 94°C ja rõhk 200 atmosfääri. Tegemist on autotroofse organismiga, kes kasutab elutegevuseks CO₂, N ja H ning produtseerib metaani. Hapnik tapab ta. M. jannaschii genoom koosneb ühest kromosoomist ja kahest ekstrakromosomaalsest DNA elemendist, mille puhul arvatakse, et tegemist on primitiivsete viirustega. Selles oganismis on leitud ka 18 inteini. Inteinid on väikesed elemendid, mis lülituvad valmiva valgu järjestusse ja kõrvaldatakse sealt pärast seda, kui valk on valmis saanud.

 

Praeguseks (seisuga november 2000) on publitseeritud 7 arhe genoomi nukleotiidne järjestus, palju järjestusi on valmimisjärgus. Olemasoleva andmestiku põhjal võib arhede geene nende homoloogia alusel teisete organismide geenidega liigitada järgnevalt:

 

I Arhede geenid, mille järjestused sarnanevad eeskätt eukarüootidele:

1)        RNA polümeraasi ja basaalseid transkriptsioonifaktoreid kodeerivad geenid.

2)        DNA replikatsiooniks vajalike valkude geenid (DNA polümeraas, helikaas, ligaas). Seni pole leitud DNA replikatsiooni initsiatsiooniks vajalikke DNA järjestusi (sarnane eukarüootidele, kus on palju erinevaid initsiatsioonisaite või hoopis unikaalne?).

3)        Translatsiooni initsiatsiooni faktoreid kodeerivad geenid, ribosoomi valkude geenid. Samas on mRNA-del leitud bakteritele iseloomulikku Shine-Dalgarno järjestust ning ribosoomi valkude geenid paiknevad operonidena. rRNA geenid sisaldavad introne.

4)        Histoone kodeerivad geenid (kuigi DNA kokkupakkimise aste ei ole arhede puhul nii kõrge kui eukarüootide puhul).

 

II Arhede geenid, mille puhul on leitud bakteriaalsed homoloogid:

1)        Universaalseid metabolismiradu ja transportsüsteeme kodeerivad geenid.

2)        Raku jagunemisel osalevate valkude geenid (näit.rakujagunemise initsiaatorvalk FtsZ).

 

III Unikaalsed järjestused:

Praktiliselt üldse pole leitud DNA reparatsioonil osalevate valkude homolooge, kuigi DNA reparatsioon toimub ja mutatsioonisagedus arhede rakkudes on sama, mis teistegi organismide rakkudes.

Pärmi Saccharomyce cerevisiae genoom.

 

S. cerevisiae on esimene eukarüootne organism, mille genoom sekveneeriti. Genoomi järjestus avaldati 1996. aastal. Pärmi 12 068 kb pikkune genoom sisaldab 5885 potentsiaalset valku kodeerivat geeni, üle 140 ribosomaalse RNA geeni, 40 snRNA (small nuclear RNA) geeni ja 275 tRNA geeni.

 

Põhiline erinevus pärmi ja bakterite geenide vahel seisneb selles, et pärmigeenidel esineb geneetiline redundantsus. Geenid ja muud DNA järjestused esinevad mitmete peaaegu identsete koopiatena. Selline järjestuste kordistumine on toormaterjaliks evolutsioonile. Kui mutatsioon tekib näiteks ühte koopiasse duplitseerunud geenist, ei mõju see organismile kahjulikult, sest tänu teisele, rikkumata geeni koopiale säilub rakus ka geeni algne funktsioon. Teine geen võib nüüd kodeerida muutunud funktsiooniga valku, mis on organismile vajalik teistes keskkonnatingimustes või teistel elutsükli perioodidel. 

 

Teiseks redundantsuse näiteks on telomeeriga assotsieerunud kodeeriva järjestuse esinemine 19 koopiana pärmi genoomis. Arvatavasti kodeerib see järjestus RNA helikaasi ning võimalik, et järjestus pärineb kunagi telomeeri piirkonda inserteerunud transponeeruvast elemendist.

 

Geneetiline redundantsus on iseloomulik kõigile eukarüootsetele genoomidele ja see on üks põhilisi omadusi, mille poolest eukarüootne genoom erineb prokarüootsest. Võrreldes ainuraksetega on hulkraksetes organismides redundantsuse aste suurem.

 

Inimese genoom.

 

Inimese genoomi projekt HGP (Human Genome Project) käivitus 1990. Aastal. Selle eesmärkideks oli:

1)        Kaardistada kõik inimese 70 000 – 100 000 geeni;

2)        Koostada inimese genoomi füüsiline kaart;

3)        Määrata aastaks 2005 kõigi inimese kromosoomide nukleotiidne järjestus.

 

Tegemist oli teadusprojektiga, kuhu kaasati laborid erinevatest riikidest. Töö koordineerimiseks loodi rahvusvaheline Inimese Genoomi Organisatsioon HUGO (Human Genome Organization). Esimeseks projekti juhiks oli James Watson, kes koos Francis Crick’iga oli kirjeldanud DNA kaksikhelikaalse struktuuri. 1993-ndast aastast juhib projekti Francis Collins. Töö jaotati erinevate teaduslaborite vahel (põhilisedc tegijad 8 laborit USA-st ja Sangeri Keskus Inglismaalt). 1998.

 

Aastal moodustas J. Craig Venter (juhtis enne seda Rockvilli Genoomiuuringute Instituuti Marylandis ja oli seni sekveneerinud mitmete bakterite genoome) firma Celera Inc. Projekti finantseeris Perkin-Elmer korporatsioon. Venter lubas sekveneerida inimese genoomi täielikult kolme aasta jooksul. Võrreldes HGP projektiga on Venteril kasutada uut tüüpi, võimsamad automaatsekvenaatorid. Celera’s pandi tööle 230 uut tüüpi sekvenaatorit, mis võimaldavad ööpäevas sekveneerida kokku 100 miljonit nukleotiidi. Lisaks kasutab Venter ka teistsugust sekveneerimisstrateegiat. Kui HGP osalevad laborid sekveneervad eelnevalt kaardistatud genoomseid kloone (150 000 – 200 000 bp inimese DNA-d sisaldavad BAC-id), siis Celeras viiakse kogu genoom väikesteks DNA fragmentideks, sekveneeritakse juhuslike fragmentide otsad ning superkompuutrite abil ühendatakse kattuvad järjestused terviklikuks DNA järjestuseks. Selle strateegia (whole genome shotgun sequencing) rakendamisel tekitab probleeme DNA kordusjärjestuste esinemine eukarüootses DNA-s.  Kordusjärjestusi sisaldavaid kattuvaid DNA fragmente on kogu genoomi ulatuses raske reastada.

 

Konkurents inimese genoomi sekveneerimisel on kiirendanud ka HGP tegevust: inimese genoomi lõplik järjestus peaks praeguste prognooside alusel olema teada vähemalt aastaks 2003. Praeguseks on täielikult sekveneeritud inimese 21 ja 22 kromosoomi DNA. Kogu genoomi DNA järjestuse mustandvariandi valmissaamisest teatati 2000-nda aasta juunis mõlema konkureeriva projekti poolt.

 

Nematoodi C. elegans genoom.

 

1998. a. lõpul avaldati nematoodi C. elegans 100 Mb suuruse genoomi primaarjärjestus. Genoomis on 19 000 geeni, millest 26%-l on homoloogia pärmi S. cerevisiae genoomiga.

 

Äädikakärbse genoom.

 

2000-nda aasta märtsis avaldati äädikakärbse genoomist (180 Mb) eukromatiini kuuluva DNA 120 Mb pikkune primaarjärjestus koostööna Celera ja Berkeley Drosophila Genoomi Projekti poolt. Tervikliku järjestuse esitamiseks kombineeriti üle genoomi saadud juhuslike fragmentide sekveneerimistulemusi ja iseloomustatud BAC kloonide kaarte ning primaarjärjestusi. Esitatud andmete põhjal on äädikakärbsel ~13 600 geeni.

 

Hiire genoom.

 

Oktoobris 2000 teatas Celera Inc. järgmise eukarüootse genoomi DNA järjestuse mustandist. Sedapuhku hiire omast. Projekt oli käivitatud alles 2000-nda aasta aprillis.

 

Genoomi poolt kodeeritud RNA ja valkude ekspressiooni ja funktsioonide uurimine.

 

Genoomi primaarjärjestuse teadasaamine aitab oluliselt kaasa genoomi funktsioonide uurimisele. Mis funktsioon on ühel või teisel DNA järjestusel, selgub geneetilistest katsetest sama järjestuse mutantidega. Viimastel aastatel leiavad üha enam rakendust ka uued molekulaarsed meetodid.

 

Suurte eukarüootsete genoomide puhul kodeerib valke ainult väike osa genoomist. Näiteks inimese genoomist kodeerib valke ainult 5% DNA-st. Pärmil seevastu kodeerib valke 70% genoomist. Kodeerivate järjestuste analüüsil lähtutakse enamasti mitte genoomsetest vaid cDNA kloonidest, EST-idest, mis sisaldavad eukarüoodi mRNA-le komplementaarset DNA-d.

 

Genoomse materjali samaaegne hübridiseerimine ja “geenikiibid” (Array hybridization and gene chips).

 

Teades genoomi terviklikku järjestust, saab selle põhjal sünteesida kõigile RNA-dele komplementaarsed oligonukleotiidid või amplifitseerida PCR-i abil genoomist kõik valku kodeerivad järjestused ORF-id (avatud lugemisraamid). Selleks, et uurida kogu genoomi või paljude geenide avaldumist, viiakse kandjale (näiteks nailonmembraanile) eraldi punktidena erinevate geenide järjestused ning hübridiseeritakse rakkudest eraldatud ja märgistatud RNA või sellelt sünteesitud cDNA prooviga. Hiljem hinnatakse erinevate täppide hübridisatsioonisignaali tugevust skänneritega. Signaali tugevus viitab geeni avaldumismäärale rakkudes antud arenguetapil või koes või keskkonnatingimustel.

 

Tehnika täiustumisel on võimalik kandjale, milleks võib lisaks membraanile olla ka mõni teine tahke pind, näiteks klaas, paigutada DNA järjestusi üha tihedamalt. Enamasti seotakse kandjale oligonukleotiide, mida võidakse sünteesida ka kohapeal. Saadakse geenikiibid (chips).  Paarile ruutsentimeetrile võib mahutada üle 10 000 oligonukleotiidi.   

 

Geenikiibid organismi paljude või kõigi geenide ekspressiooni uurimiseks samaaegselt on saadaval sekveneeritud genoomiga organismide puhul.

 

Valkude sünteesi uurimine.

 

Selleks, et uurida, kuidas on reguleeritud erinevate mRNA-de transleerimne rakus, on kasutusel mitmeid meetodeid. Eespool oli juttu “Western blot” analüüsist, kus uuritavaid valke detekteeriti nendevastaste antikehadega polüakrüülamiid-SDS-geelelektroforeesil lahutatud ja filtrile kantud totaalvalgust.

 

Selleks, et jälgida valgu ekspressiooni rakus, konstrueeritakse uuritava valgu ja GFP (green fluorescent protein) liitjärjestus, viiakse vastavat liitjärjestust kodeeriv DNA rakku ja mõõdetakse liitvalgu fluorestseerumistaset. GFP on väike valk ning ei mõjuta tavaliselt uuritava valgu aktiivsust ega interaktsioone teiste rakukomponentidega. Fluorestsentsi tuvastamiseks on rakupreparaati vaja eksponeerida kas sinisele valgusele või UV-le. GFP valgu muteerimisel on saadud variante, mis emiteerivad sinist või kollast valgust. Erinevate GFP variantide abil saab samaaegselt uurida erinevate valkude rakusisest lokalisatsiooni ja ekspressioonitaset.

 

Eukarüootsete genoomide evolutsioon.

 

Erinevate teraviljade kromosoomide geneetiliste kaartide koostamisest on selgunud, et hoolimata ulatuslikust kõikumisest erinevate liikide genoomide suuruste vahel ning erinevustest kromosoomide arvus on unikaalsete DNA järjestuste ja teadaolevate geenide aheldatus erinevate liikide vahel tugevalt konserveerunud. Seega annaks ühe teravilja genoomi primaarstruktuuri teadasaamine olulist informatsiooni ka teiste teraviljade sordiaretajatele.

 

Imetajatel on uuritud kromosoomide evolutsiooni kromosoomide värvimisega (chromosome painting, zoo-FISH). See meetod sarnaneb FISH-ile, kus kromosoome  hübridiseeritakse in situ fluorestsentsvärvidega märgistatud nukleiinhappe proovidega, mis on komplementaarsed uuritavate geenidega kromosoomis. Ühe liigi kromosoomidele hübridiseeritakse fluorestsentsmärgisega geeniproovid. Seejärel, teades uuritavate geenide asukohti ühe liigi kromosoomides, värvitakse teise liigi kromosoome. Saadud tulemuste põhjal on võimalik analüüsida samade geenide reastatust kromosoomi piires (ingl. k. synteny) erinevate liikide puhul. Eristatakse 3 klassi:

1)        geenide reastatus on konserveerunud terve kromosoomi ulatuses;

2)        geenide reastatus on konserveerunud kromosoomi suurtes segmentides;

3)        erinevate kromosoomide segmendid on liitnud, mistõttu teise liigi kromosoomis on teistsugune geenide reastatus.   

 

Näiteks inimese 17-nda kromosoomi geenid on reastatud samamoodi ka sea 12-ndas kromosoomis ning veise 19-ndas kromosoomis. Konserveerunud blokke on ka teistes imetajate kromosoomides. Võrreldes inimese kromosoome näiteks giboni kromosoomidega ilmnes, et pärast nende eellaste lahknemist on kromosoomides toimunud 21 translokatsiooni. Lähedaste liikide kromosoomide puhul muutub erinevuste hindamisel olulisemaks kromosoomisiseste geneetiliste ümberkorralduste (näit. inversioonid) detekteerimine. 

 

Haiguste molekulaarne diagnostika.

 

Haiguste molekulaarne diagnostika eeldab konkreetse haigusega seotud geenide nukleotiidse järjestuse ja haigust põhjustavate mutatsioonide teadmist. Kui mutatsioonide kohad on lokaliseeritud, saab vastavat DNA regiooni uuritavate indiviidide genoomist PCR-i teel amplifitseerida ja seejärel juba täpsemalt analüüsida. Nii on võimalik teostada ka sünnieelset diagnostikat.

 

 

SNP-d (single nucleotide polymorphism) on kogu genoomi ulatuses esinevad markerid. Keskmiselt võiks esineda 1 SNP iga 1000 nt tagant. Kuna inimese genoom on 3 miljardit nt pikk, võiks igal inimesel olla teoreetiliselt kuni 3 miljonit SNP-d. Praeguseks on inimese genoomis kirjeldatud üle 100 000 SNP ja 2001. a. lõpuks loodetakse iseloomustada kuni 300 000 SNP-d.

 

SNP-ga on seostatud mitmeid haigusi ja geneetilisi eelsoodumusi haigestumiseks. Teatud SNP-de puhul tuleb kasutada teistsuguseid ravimeetodeid või teistsuguseid ravimidoose. Järgnevalt mõned näited:

 

1)        Verehüübefaktorit IX kodeeriva geeni 6460-ndas positsioonis oleva C asendamine T-ga põhjustab hemofiiliat. Asenduse tulemusena tekib arginiini koodoni CGA asemele stopp-koodon TGA.

 

2)        Kõrgenenud risk südame- ja veresoonkonna haigustele. LDL retseptor (Low Density LIpoprotein Receptor) vastutab kolesterooli hulga vähendamise eest veres. Kui retseptori geenis on ühes kindlas kohas toimunud nukleotiidne asendus, mille tulemusena aspargiini koodon asendub seriini koodoniga, sünteesitakse mutantset LDL retseptorit. Mutantse variandi puhul on kolesterooli tase veres kõrgem ja seega suureneb ka risk haigestuda.

 

3)        Muutused ravimite metabolismis. Vererõhu alandamiseks kasutatakse ravimit debrisokuiin (debrisoquine). See ravim lagundatakse maksas CYP2D6 (tsütokroom P450 perekonna valk) poolt. Kui ensüümi kodeerivas geenis on mutatsioon GGA ® TGA, sünteesitakse lühem, defektne ensüüm. Sel juhul ravimit ei lagundata ning ravimi regulaarsel tarvitamisel see koguneb organismis. Ravimi tarvitamisest tekivad kõrvalnähud, mis on iseloomulikud ravimi üledoseerimisest põhjustatud nähtudele.

 

Teatud haiguste, näiteks sirprakulise aneemia molekulaarsel diagnoosimisel, piisab restrikteeritud DNA “Southern blot” analüüsist. Mutatsiooni tagajärjel on ära kadunud üks restriktaasi MstII lõikesait b-globiini geenist. Kui uuritavate indiviidide genoomset DNA-d lõigata MstII-ga ja hübridiseerida agaroosgeelis lahutatud ja filtrile kantud DNA fragmente radioaktiivse prooviga  b-globiini kodeerivast järjestusest, näeme normaalse DNA järjestuse puhul hübridisatsiooni kahele DNA fragmendile, mutantse puhul aga ainult ühele.

 

 

Huntingtoni tõbi on põhjustatud autosomaalse dominantse mutatsiooni poolt huntingtiini kodeerivas geenis, mis paikneb inimese 4-ndas kromosoomis. See mutatsioon ilmneb kaukasoididel sagedusega 1:10000 indiviidi kohta. Huntingtoni tõbi avaldub tavaliselt 30 – 50-nda eluaasta vahel tsentraalse närvisüsteemi progresseeruva degeneratsiooni näol ja lõpeb 10-15 aastat hiljem patsiendi surmaga. Heterosügootide lastel on tulevikus 50%-line tõenäosus samuti haigestuda. Huntingtiini geen sisaldab trinukleotiidset järjestust CAG 11 kuni 34 koopiat tervetel indiviididel, haigetel aga 42 kuni 100 koopiat või veelgi enam. See, kui varakult Huntingtoni tõbi avaldub, korreleerub CAG korduste arvuga. Pärast huntingtiini geeni primaarjärjestuse määramist oli võimalik sünteesida praimerid, mis olid komplementaarsed DNA regioonidega mõlemal pool CAG kordusjärjestusi ning amplifitseerida vastav geeni piirkond PCR-i abil. Amplifitseerunud DNA fragmendi pikkus sõltub CAG järjestuse koopiaarvust. Nii on võimalik juba sünnieelselt diagnoosida, kas lapsel on risk haigestuda Huntigtoni tõppe või mitte.

 

Huntingtoni tõbe põhjustava mutantse geeni isoleerimine oli pikaajaline protseduur. Ka sel juhul kasutati positsioonilist kloneerimist. Uuriti suuri perekondi, kus esines Huntingtoni tõbi ning RFLP analüüsil leiti, et teatud molekulaarne marker on aheldunud haigust põhjustava alleeliga. Selle tulemusena lokaliseeriti mutantne alleel 4-nda kromosoomilühikese õla 500 kb pikkusesse regiooni. Seejärel koostati 500 kb pikkusele alale detailne restriktsiooni ja kontiikide kaart. Kuna lähtuti genoomsest DNA-st, mis sisaldab intronjärjestusi, viidi läbi eksoni amplifitseerimine. Genoomse DNA fragmendid kloneeriti loomaviirusel põhinevasse vektorisse, kus kloneerimissaidid olid viidud intronjärjestusse. Rekombinantne DNA viidi rakkudesse ning rakukultuuri kasvatati mõned päevad, et rekombinantselt DNA-lt toimuks transkriptsioon ning sünteesitud RNA puhul splaissing. Seejärel eraldati tsütoplasmaatiline mRNA ning sünteesiti sellelt cDNA. cDNA-lt amplifitseeriti PCR-i abil eksonjärjestus, kasutades praimereid, mis olid komplementaarsed kloneeritud fragmendist vasakule ja paremale jäävate vektori järjestustega. Amplifitseeritud eksonjärjestust kasutati DNA proovina cDNA raamatukogu sisaldavate kolooniate hübridisatsioonil. cDNA kloone omakorda kasutati komplementaarsete genoomse DNA kloonide identifitseerimiseks. Hübridiseerunud genoomse DNA ja cDNA kloonidest eraldati DNA, kloneerunud fragmendid sekveneeriti ning järjestuste analüüsi tulemusena identifitseeriti uuritavas kromosoomi regioonis asuvad geenid. Genoomse DNA järjestuse võrdlemine cDNA järjestusega võimaldas genoomses DNA-s defineerida ka eksonid ja intronid. Haigetelt ja tervetelt indiviididelt isoleeritud DNA järjestuste võrdlemisel identifitseeriti mutantne DNA järjestus, mis põhjustas Huntingtoni tõbe. 

 

Tsüstiline fibroos (CF) ilmneb Põhja-Euroopa populatsioonis sagedusega 1:2000 vastsündinu kohta. CF-i põhjustab autosomaalne retsessiivne mutatsioon. Kaukasoidses populatsioonis on 1 indiviid 25-st CF-i suhtes heterosügootne. CF-i põhjustavad mutatsioonid geenis, mis kodeerib transmembraanset regulaatorit CFTR, mis asub ioonkanalites, osaledes soolade transpordis rakust sisse ja välja. Mutantse geeni puhul on häiritud klooriioonide transport hingamiselunditel, pankreasel, soolestikul ja teistel organitel. Selle tulemusena akumuleerub organite epiteelrakkudes sool ja rakkude pind muutub limaseks. See omakorda muudab organid vastuvõtlikuks infektsioonidele ja nii on haigetel kõrge risk surra kopsupõletikku juba imikueas. CF geen paikneb 7-nda kromosoomi pikas õlas. CF-i puhul on 70%-l juhtudest tegemist ühe konkreetse 3-nukleotiidse deletsiooniga CF geenist, mille tulemusena läheb valgu aminohappelisest järjestusest kaotsi fenüülalaniin positsioonist 508. Lisaks DF508 deletsioonile on identifitseeritud veel 170 erinevat mutatsiooni CF geenis. Deletsiooni DF508 diagnoosimiseks on välja töötatud metoodika, mis põhineb potentsiaalset deletsiooni sisaldava DNA piirkonna amplifitseerimisel PCR teel ja amplifitseeritud DNA hübridiseerimisel erinevate radioaktiivselt märgistatud oligonukleotiididega. Hübridisatsioonitingimused on selektiivsed: üks oligotest hübridiseerub ainult algtüüpi DNA järjestusele, teine aga deletsiooni sisaldavale. Hübridisatsioon toimub filtritel, kuhu amplifitseeritud DNA on kantud “Southern blot” meetodil.

 

Ka tsüstilist fibroosi põhjustava mutantse CF lookuse isoleerimisel kasutati positsioonilist kloneerimist, kus lähtuti paarist RFLP markerist ning rakendati nii kromosoomil "jalutamist" kui ka "hüppamist". Eukarüootses DNA-s on piirkondi, rikkad CG-dinukleotiidse järjestuste poolest. Selliseid alasid nimetatakse CpG saarekesteks (p tähistab fosfodiestersidet C ja G vahel). CF lookusest ülevalpool leiti 3 CpG saarekeste kogumit 

 

Geeniteraapia.

 

Geeniteraapia seisneb normaalse geeni viimises indiviidi genoomi, mis sisaldab defektset geeni. Geeni, mis on viidud organismi rakkudesse, nimetatakse transgeeniks (“transgene”, tuletatud nimetusest “transferred gene”) ja organismi, kuhu see geen on viidud, nimetatakse transgeenseks. Juhul kui geeniteraapia on olnud edukas, sünteesib transgeenne organism varem puudunud geeniprodukti ja selle tulemusena taastub tal normaalne fenotüüp. Eristatakse 2 tüüpi geeniteraapiat:

1.         Somaatiliste rakkude mittepäritav geeniteraapia

2.         Sugurakkude geeniteraapia e. päritav geeniteraapia.

 

Inimese puhul on kasutatud ainult somaatiliste rakkude geeniteraapiat. Geeniteraapiat rakendati inimese puhul esimest korda 1990-ndal aastal adenosiini deaminaasi puudumisest põhjustatud immunodefektsust põdeva ADA^-SCID (adenosine deaminase-deficient severe combined immunodeficiency disease) patsiendi puhul. Adenosiini deaminaasi defektsuse korral akumuleerub T lümfotsüütides selle ensüümi substraat desoksüadenosiin, mis on T rakkudele toksiline. T lümfotsüüdid stimuleerivad B lümfotsüüte immuunvastuse tekitamiseks (antikehade sünteesiks). Kui T lümfotsüüdid hävivad, ei teki organismil immuunvastust ja sellised lapsed surevad varakult. Inimese ADA geen kloneeriti retroviirusel põhinevasse vektorisse ja viidi haige lapse valgetesse vererakkudesse. Selleks isoleeriti patsiendilt vererakud, kuhu viidi funktsionaalne ADA geen, kontrolliti geeni avaldumist vererakkudes ja seejärel viidi transgeensed rakud tagasi organismi. Seda protseduuri tuli aga hakata sageli kordama, kuna ADA geeni avaldumine patsiendi organismis oli lühiajaline. Lisaprobleemi tekitas ka see, et valgete vererakkude eluiga on suhteliselt lühike. 1993-ndal aastal rakendati geeniteraapiat luuüdi rakkudele, millest arenevad T lümfotsüüdid. Sel juhul saadi paremad tulemused - modifitseeritud tüvirakud produtseerisid pidevalt ADA transgeenseid T rakke.

 

Senine geeniteraapia põhineb metsiktüüpi geeni viimisel haige organismi defektsele geenile lisaks. Sel juhul on transgeeni avaldumine rakus kontrollitud kunstlikult, regulatoorsete elementide poolt, mis sisalduvad rekombinantses DNA-s. Ideaalvariant oleks see, kui suudetaks defektne geen kromosoomis asendada normaalse geeniga. Defektse geeni asendamine homoloogilise rekombinatsiooni teel funktsionaalse geeniga võimaldaks viia metsiktüüpi geeni tema õigesse konteksti ja tagada selle tulemusena tema normaalne ekspressioonitase rakus. 

 

DNA fingerprint e. “sõrmejäljed”.

 

Inimese genoom koosneb ligikaudu 3 x 10⁹ nukleotiidist. Kõige suurem heterogeensus inimese genoomi järjestuses esineb mittekodeerivates olulise funktsioonita alades. Samuti võib varieeruda koodoni 3-ndas positsioonis olev nukleotiid, kui see ei põhjusta muutust valgu aminohappelises järjestuses. DNA polümorfism võimaldab tuua esile indiviidile omapärase DNA fragmentide mustri, mida nimetatakse DNA “sõrmejälgedeks” e. DNA fingerprindiks. Kui lõigata DNA-d spetsiifiliste restriktaasidega, mille lõikesaitide esindatus testitavas DNA regioonis erineb indiviiditi ja analüüsida DNA-d “Southern blot” meetodil, hübridiseerides genoomse DNA restriktsioonifragmente testitavat DNA regiooni sisaldava radioaktiivse prooviga, näeme hübridiseerunud fragmentide mustris erinevusi. Isiku identifitseerimise puhul on vaja eelnevalt teada, millise tõenäosusega saadakse identne fragmentide muster kahe erineva indiviidi puhul. DNA testi puhul on võimalik lähtuda väga väikesest bioloogilise materjali kogusest – vere või spermaplekist, juuksekarvast või nahatükikesest ja amplifitseerida sealt PCR meetodil DNA järjestused, mida edaspidi kavatsetakse analüüsida. Testi läbiviimisel võrreldakse sageli DNA järjestusi, mis sisaldavad kordusjärjestusi. Nende kordusjärjestuste hulk varieerub indiviiditi, põhjustades erinevat restriktsioonifragmentide mustrit. Selliseid järjestusi nimetatakse VTNR-deks (variable number tandem repeats). 

 

DNA fingerprinti kasutatakse näiteks isaduse tuvastamisel ja kohtumeditsiinis. Isaduse tuvastamisel tuleb arvestada seda, et homoloogilistest kromosoomidest pooled on pärit isalt, pooled emalt. Seega sisaldub  lapse fragmentide mustris nii isale kui ka emale iseloomulikke fragmente. Mida enam erinevaid hübridisatsiooniproove kasutatakse, seda suuremat osa genoomist võrreldakse ning selle tulemusena on ka tulemused usaldusväärsemad. 

 

Eukarüootsete valkude tootmine bakterites.

 

Rekombinantse DNA tehnoloogia võimaldab konstrueerida ekspressioonisüsteeme, kus eukarüootsed geenid on viidud bakterisse tootmaks seal eukarüoodi valke. Nii on pandud bakterid sünteesima inimese insuliini, kasvuhormooni ja interferooni. Selleks, et E. coli hakkaks tootma näiteks inimese kasvuhormooni, on vaja vastav inimese geen (mis on kloneeritud cDNA raamatukogust) viia bakteri regulatoorsete elementide kontrolli alla, mis aktiveeriksid E. coli’s geeni transkriptsiooni ja oleksid signaaliks translatsiooni initsiatsioonil. Antud juhul kasutati selleks laktoosi sünteesi määravate geenide (lac operoni) promootorit ja ribosoomiga seondumise järjestust. Kasvuhormooni kodeerivale DNA-le lisati ka järjestus, mis kodeeris signaalpeptiidi valgu transpordiks rakust välja. Valgu transportimisel läbi rakumembraani toimus valgu protsessimine produktiks, mis oli identne inimese organismis toodetava kasvuhormooniga.

 

Osa bakteris toodetavaid ensüüme on tööstusliku tähtsusega. Näiteks juustu valmistamisel kasutatavat renniini toodetakse tänu rekombinantse DNA tehnoloogiale nüüd bakteris. Varem tuli seda ekstraheerida veiste maost.

 

Enamus rekombinantse DNA tehnoloogias kasutatavaid ensüüme (restriktaasid, DNA ligaas, DNA ja RNA polümeraasid, pöördtranskriptaas ning nukleaasid) on samuti bakteris toodetud. Vastavaid ensüüme kodeerivad geenid on viidud bakteris töötavatesse ekspressioonivektoritesse.

 

Transgeensed taimed ja loomad.

 

Transgeensetel taimede ja loomade konstrueerimisel on 3 põhilist eesmärki::

1.         Soovitavate tunnuste lisamine või võimendamine kultuurtaimedel ja koduloomadel.

2.         Huvipakkuva produkti tootmine taimes või loomas.

3.         Transgeensete organismide konstrueerimine eesmärgiga uurida bioloogiliste protsesside toimumise molekulaarseid mehhanisme.

 

Transgeensed loomad.

 

Transgeensete loomade konstrueerimisel on 2 metoodilist lähenemist. Enamasti süstitakse rekombinantne DNA viljastatud munarakku. Süstitav DNA võib olla kas lineaarne või rõngasmolekul. Lineaarne DNA integreerub genoomi ligi 5 korda efektiivsemalt kui tsirkulaarne DNA. Tavaliselt süstitakse ühte munarakku sadu kuni tuhandeid rekombinantse DNA molekule. Sisseviidud DNA integreerub genoomi suvalistesse kohtadesse. Teiseks transgeensete loomade konstrueerimise võimaluseks on embrüode nakatamine retroviiruste baasil konstrueeritud rekombinantsete DNA molekulidega.

 

Eriti palju on transgeenseid loomi konstrueeritud hiirte puhul. Inimese, veise või roti kasvuhormooni viimisel hiire organismi saadi hiired, kes olid võrreldes normaalsetega ligi 2 korda suuremad. See innustas konstrueerima näiteks transgeenseid sigu, kanu ja kalu. Edaspidi selgus, et lisaks oodatud tulemusena ilmnesid kõrvalnähud. Transgeensed sead kasvasid küll suuremaks (vajasid selleks siiski eridieeti), kuid nende liha oli lahjem. Nende sigade muskulatuur oli halvasti arenenud, nad olid loiud. Emised olid sageli steriilsed.

 

Kanade puhul on konstrueeritud viiruseresistentseid transgeenseid tibusid, kes on resistentsed ALV (avian leukosis virus) vastu. Nende transgeensete kanade organism sisaldab defektset ALV-d, mis produtseerib intaktse viiruse paljunemist blokeerivat valku.

 

Konstrueeritud on ka selliseid transgeenseid loomi, kus huvipakkuvat produkti toodetakse ja sekreteeritakse piima. Nii on näiteks on lammas pandud tootma inimese verehüübe faktorit IX ja kasvuhormooni.

 

 

Transgeensed taimed.

 

Rekombinantse DNA sisseviimiseks taimerakku on erinevaid meetodeid. DNA kas “tulistatakse” volframi või kullapartiklite koosseisus taimerakku, sisestatakse elektrivoolu abil (elektroporatsioon) või siis transformeeritakse taimerakke Agrobacterium tumefaciens Ti plasmiidide põhjal konstrueeritud rekombinantsete plasmiididega. Taimede geneetilisel manipuleerimisel on suureks abiks taimerakkude totipotentsus – iga üksiku taimeraku võime dediferentseeruda embrüonaalseks rakuks, mis seejärel võib saada aluseks uue taime kasvatamisel. Kui diferentseeerunud taimekude viia kunstlikesse kasvutingimustesse, steriilsesse koekultuuri ja kasvatada rakke 2,4-diklorofenoksüäädikhappe 2,4-D juuresolekul, mis on üks taimehormoone, taime koerakud dediferentseeruvad, moodustades kalluse. Seejärel viiakse kalluskultuuri rakud 2,4-D-vabale söötmele, mis sisaldab kasvuhormooni kinetiin, ning taimerakud hakkavad jälle diferentseeruma.

 

A. tumefaciens’i Ti plasmiidid indutseerivad taimedel kasvajaid. Ti tuleneb terminist “tumor-inducing capacity”. Ti plasmiidis olev T-DNA (transferred DNA) on võimeline plasmiidist taime genoomi integreeruma. T-DNA-sse viidud võõrad geenid integreeruvad samuti taime genoomi. Selleks, et kontrollida rekombinantse DNA integreerumist taime genoomi, sisaldab rekombinantne DNA selektiivse markerina näiteks antibiootikumi resistentsusgeeni.

 

Taimede puhul on konstrueeritud herbitsiididele resistentseid teraviljasorte. See võimaldab läbi viia umbrohutõrjet ilma kultuurtaimi kahjustamata. Glüfosaat (glyphosate) on laia toimega  herbitsiid, mis inhibeerib ensüümi 5-enoolpüruvüülshikimaadi 3-fosfaadi süntaasi (EPSP süntaasi), mis osaleb aromaatsete aminohapete türosiin, fenüülalaniin ja trüptofaan sünteesis. Sama herbitsiid inhibeerib EPSP süntaasi töö ka bakterites. Bakterite puhul on isoleeritud glüfosaadi-tolerantsed EPSP süntaasi geeni aroA mutandid. Bakteri mutantse aroA geeni viimisel taime omandasid ka transgeensed taimed tolerantsuse glüfosaadile.

 

Antisense RNA-de kasutamine geenide ekspressiooni mahasurumiseks.

 

Antisense-RNA-de kasutamine geeniekspressiooni mõjutamiseks põhineb mRNA-le komplementaarse RNA sünteesimisel ja viimisel rakku, mille tulemusena rakus blokeeritakse konkreetselt mRNA-lt toimuv valgusüntees. Antisense-RNA ja mRNA moodustavad dupleksi, mis on translatsiooniliselt inaktiivne. Antisense-RNA-d produtseeriv rekombinantne DNA konstrueeriti tomati puhul. Tomati viljad kipuvad pehmenema tomati rakkudes sisalduva ensüümi galakturonaasi toimel. Kui galakturonaasi tase rakus madalamaks viia, säiluvad viljad kauem. Seda ensüümi kodeerivat DNA-d kasutati rekombinantse DNA konstrueerimiseks, kus ensüümi kodeeriv järjestus kloneeriti transkriptsiooni initsiatsiooniks vajaliku promootorjärjestuse taha mRNA transkriptsiooni suunale vastupidises suunas. Selle tulemusena sünteesis RNA polümeraas galakturonaasi mRNA-le komplementaarset antisense-RNA-d. Rekombinantne DNA viidi tomatitaime ja saadi tomatisort, mille viljad säilusid võrreldes varasemate sortide omadega kauem. Antisense-RNA-sid püütakse rakendada ka viirusinfektsioonide vastu, surudes maha viiruse-spetsiifiliste geenide avaldumist rakus.       

 

 

Kloonimine imetajatel.

 

Organismi kloonimise tulemusena saadakse kaks või enam geneetiliselt identset isendit. Sisuliselt on ka ühemunakaksikud kloonid, sest nad arenevad ühest samast viljastatud munarakust. Samuti on koduloomade puhul rakendatud varajase embrüo (2-8 raku staadium) rakkude lahutamist ning nendest identsete järglaste saamist (embrüokloonimine). Samas ei olnud kuni viimase ajani võimaliks paljundada organisme lähtudes imetajate somaatilistest rakkudest. Erinevalt näiteks taimerakkudest tekivad diferentseerunud imetajarakkude puhul probleemid tuumamaterjali ümberprogrammeerimisega viljastatud munaraku staadiumi.

 

1997-ndal aastal tuli ilmale esimene kloonitud lammas Dolly. Täiskasvanud lamba (6-aastane utt) udarast isoleeritud rakke kultiveeriti laboritingimustes. Teiselt utelt isoleeriti munarakud, millel kõrvaldati tuum. Seejärel liideti tuumata munarakud koekultuuris kasvatatud diploidsete piimanäärme rakkudega ning implanteeriti asendusemale, kelleks oli kolmas utt. Sündis lammas, kes oli geneetiliselt identne udararakkude doonoriga.

 

Järgmisel, 1998-ndal aastal teatati hiire kloonimisest. Sel juhul ei liidetud rakke vaid hiire ootsüütidele, millest tuum oli kõrvaldatud, viidi tuumamaterjal erinevatest somaatilistest rakkudest, mis täiskasvanud loomas enam ei jagune (närvirakud, Sertoli rakud, cumuluse rakud (diferentseerunud rakud, mis übritsevad ootsüüte)). Neid rakke ei paljundatud enne tuumamaterjali võtmist kunstlikult vaid võeti otse hiirelt. Kloonitud järglasi saadi ainult teatud rakutüüpide korral. Kõige paremad tulemused saadi cumuluse rakkudega. Nii sündis hiir nimega Cumulina.

 

Üheks kloonimise rakendusalaks tulevikus on transgeensete loomade paljundamine. Inimese kloonimine on seadusega keelatud. Samas anti Inglismaal roheline tee organite paljundamisele kloonimise teel.