Geneetika

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

IX. TRANSKRIPTSIOON JA RNA PROTSESSING Elusorganismide geneetilise informatsiooni säilitamiseks ja realiseerimiseks on informatsioonikandja märkimiseks vaja vaid nelja tähte (A, T, G, C). On seda palju või vähe? Võrdluseks, nüüdisaegsetes arvutites on kasutusel vaid 2 arvsümbolit (0, 1), seevastu inglise keeles on 26 tähte, eesti keeles 27 eesti tähestiku tähte ja 5 võõrtähte (c, q, w, x, y) e. 32 tähte. 1. TRANSKRIPTSIOON 1.1. Transkriptsiooni üldpõhimõtted 1.1.1. Molekulaarbioloogia põhipostulaat Molekulaarbioloogia põhipostulaadi (ingl. central dogma of molecular biology) e. Cricki postulaadi kohaselt on geneetilisel informatsioonil kaks põhiomadust (jn. 9.1). 1. Geneetiline informatsioon säilib, kandudes põlvkonnast põlvkonda edasi nukleiinhappelt nukleiinhappele (DNA-lt DNA-le; RNA viirustel, kel genoomiks on RNA, toimub ülekanne RNA-lt RNA-le). 2. Geneetiline informatsioon kandub edasi organismi geenide avaldumisel (fenotüübilisel ekspressioonil) DNA-lt valkudesse, s.t. DNA nukleotiidse järjestuse informatsioon kodeeritakse ümber valkude aminohappeliseks järjestuseks. Geneetilise informatsiooni ülekanne valkudesse on kaheetapiline. 1. Transkriptsioon (ingl. transcription), kus geneetiline informatsioon kandub üle DNA-lt RNA-le. 2. Translatsioon (ingl. translation), kus geneetiline informatsioon kandub üle RNA-lt valku. Geneetilise informatsiooni ülekanne DNA-lt RNA-le on põhimõt eliselt pöörduv protsess. Näiteks, kui transkriptsioonil toimub DNA-sõltuva RNA polümeraasi toimel informatsiooni ülekanne DNA-lt RNA-le, siis vastupidisel protsessil, pöördtranskriptsioonil (ingl. reverse transkription) toimub RNA-sõltuva DNA polümeraasi e. revertaasi toimel geneetilise informatsiooni ülekanne RNA-lt DNA-le. Seevastu geneetilise informatsiooni ülekanne RNA-lt valku on alati pöördumatu (ühesuunaline) protsess. Transkriptsioon ja RNA protsessing 263 Molekulaarbioloogia põhipostulaat ütleb, et geneetiline informatsioon kandub nukleiinhappelt nukleiinhappele ja nukleiinhappelt valku, mit e valgult nukleiinhappele. See tähendab aga ka seda, et keskkonna toimel organismi eluajal omandatud fenotüübilised tunnused ei saa suguliselt sigivatel organismidel järglastele päranduda: ei pärandata tunnuseid, vaid geneetilist informatsiooni, mis tagab iseloomulike tunnuste tekke. 1.1.2. RNA tüübid Transkriptsioonil kasutatakse üht DNA-ahelat matriitsina (ingl. template) komplementaarse RNA-ahela sünteesil. Sünteesitud RNA-ahelat nimetatakse transkriptiks (ingl. transcript). Kuivõrd RNA-s on tümiini asemel uratsiil, siis näiteks juhul, kui matriitsahela DNA-molekulis on nukleotiidne järjestus AAA, vastab sellele RNA transkriptis UUU. Translatsiooni käigus muudetakse („tõlgitakse”) RNA nukleotiidne järjestus valkude aminohappeliseks järjestuseks. Nagu igasuguse info ülekandel ühest märgisüsteemist teise vajatakse selleks koodi, geneetilise info ülekandel geneetilist koodi (ingl. genetic code). Geneetilise koodiga määratakse valkude aminohapped RNA nukleotiidsete tripletite (ingl. triplets) poolt, mida nimetatakse koodoniteks (ingl. codons). Ülalesitatud näites määrab UUU triplet RNA-s valgu polüpeptiidahelasse (geeni produkti) aminohappe fenüülalaniini lülitumise. Translatsioon toimub ribosoomides (ingl. ribosomes), mis koosnevad 3–5 RNAmolekulist, 50–90 erinevast valgust ja reast muudest regulatoorsetest makromolekulidest. Ribosoomides transleeritavaid RNA-molekule nimetatakse informatsiooni-RNA-deks e. mRNA-deks (ingl. messenger RNAs, mRNAs). Prokarüootidel on geeni poolt määratav esmane transkript (ingl. primary transcript) võrdne mRNA-ga ning ta on ka kohe transleeritav (jn. 9.2). Eukarüootides toimub aga esmalt eellas- e. pre-mRNA (ingl. premRNA) süntees, misjärel toimub nn. eellas-mRNA potsessing (ingl. processing) küpseks GENEETILISE INFORMATSIOONI VOOL PÕLVKONNAST PÕLVKONDA RNA DNA RNA DNA Replikatsioon RNA-sõltuv RNA polümeraas DNA-sõltuv DNA polümeraas mRNA Polüpeptiid (valk) RNA-sõltuv DNA polümeraas DNA-sõltuv RNA polümeraas Pöördtranskriptsioon Transkriptsioon FENOTÜÜBI KONTROLL (GEENI AVALDUMINE) Translatsioon Joonis 9.1. Molekulaarbioloogia keskne dogma (Cricki postulaat). Cricki post u laat: geneet i l i ne informatsioon kandub eda si nu k lei i n happelt nukleiinhappele ja nukl e i i n h a p p e l t v a l g u l e , mitte aga valgult nukleiinhappele. 264Transkriptsioon ja RNA protsessing mRNA-molekuliks. Protsessimise käigus toimub enne translatsiooni pre-mRNA-st spetsiif lise järjestuse kõrvaldamine ning transkripti mõlema otsa modif katsioon. Enamikus eukarüootsetes geenides on mit ekodeerivad järjestused e. intronid (ingl. introns), mis lõigatakse RNA protsessingul RNA-st välja, ühendades sellega RNA-s geeni kodeerivad järjestused e. eksonid (ingl. exons). Intronite väljalõikamise protsessi nimetatakse geeni splaissinguks (ingl. gene splicing). Enne splaissingut lisatakse pre-mRNA 5´-otsa 7-metüülguanosiinmüts (ingl. cap) ja 3´-otsa transkriptsioonijärgselt pärast splaissingut 20–200 nukleotiidi pikkune polü-(A)-järjestus e. polü-(A)-saba (ingl. poly-A tail). Splaissingreaktsiooni läbiviimiseks moodustub makromolekulaarne struktuur, mida nimetatakse splaissosoomiks (ingl. spliceosomes). Kõik nimetatud protsessid toimuvad tuumas. Protsessitud mRNA transporditakse tsütoplasmasse, kus ta transleeritakse. Järelikult on transkriptsioon ja translatsioon eukarüootidel ajaliselt ja ruumiliselt lahutatud. Seevastu prokarüootsetes rakkudes toimuvad transkriptsioon ja translatsioon järjestikku: sünteesitud mRNA osaleb kohe ka translatsioonil. Tegelikult transkribeeritakse geenide ekspressioonil koguni viit erinevat tüüpi RNA-sid: mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, miRNA. Neist transleeritakse aga vaid ühte, ülalnimetatutest mRNA-d. Ülejäänud neli RNA tüüpi on lõpp-produktid. TransportRNA-d e. tRNA-d (ingl. transfer RNAs, tRNAs) on madalmolekulaarsed RNA-d, mis funktsioneerivad translatsioonil kui adapterid aminohapete ja mRNA koodonite vahel. Ekson Intron Ekson Geen Geen mRNA Pre-mRNA MG- -(A)n -(A) MG-müts- n Valk Valk Transkriptsioon DNA DNA Transkriptsioon Translatsioon Translatsioon Transport Protsessing Splaissing Tuum A Prokarüoot B Eukarüoot Rakk Rakk Ekson Intron Ekson mRNA Joonis 9.2. Pro- (A) ja eukarüootide (B) valgusünteesi kaks etappi: transkriptsioon ja translatsioon. Eukarüootide tuumas toimub (sageli) pre-mRNA-st intronite kõrvaldamine (geeni splaissing). Eukarüootide tuumas toimub mRNA modif katsioon (protsessing): 5´-otsa 7-metüülguanosiin-(MG)-mütsi ja 3´-otsa polü(A)-saba lisamine. Eukarüootide mRNA transporditakse tuumast tsütoplasmasse. Prokarüootidel toimub nii transkriptsioon kui ka translatsioon järjestikuliselt – need pole ajas ja ruumis lahutatud protsessid. Transkriptsioon ja RNA protsessing 265 Ribosoomi-RNA-d e. rRNA-d (ingl. ribosomal RNAs, rRNAs) on ribosoomide struktuurseteks ja katalüütilisteks komponentideks. Väikesed tuuma-RNA-d e. snRNA-d (ingl. small nuclear RNAs, snRNAs) on splaissosoomide struktuurikomponentideks. Mikro-RNA-d e. miRNA-d (ingl. micro RNAs, miRNAs) on 20–25 nukleotiidi pikkused üksikahelalised RNA-molekulid, mis lõigatakse välja väikestest juuksenõelastruktuuriga RNA prekursoritest (eellasmolekulidest) ning neil on võime blokeerida nendega komplementaarse või osaliselt komplementaarse mRNA avaldumist, põhjustades viimase degradatsiooni või pidurdades translatsiooni. Kõik ülalnimetatud eri tüüpi R NA-d sünteesitakse eukarüootide tuumades. Neist vaid üks, snRNA toimib tuumas, ülejäänud neli (mRNA, tRNA, rRNA ja premiRNA) transporditakse tuumast tsütoplasmasse, kus toimub translatsioon (jn. 9.3). RNA-d protsessitakse tuumas. Erandina transporditakse tsütoplasmasse miRNA eellane pre-miRNA, mis protsessitakse alles tsütoplasmas aktiivseks miRNA-ks. Tuumas sünteesitud pre-miRNA sekundaarsed kaksikahelalised alad lõigatakse tuumas katki Drosha-ensüümiga (ingl. Drosha enzyme), pre-miRNA väljub tuumast tsütoplasmasse, kus toimub kaksikahelalise RNA järkamine (ingl. dice) ning trimmimine (ingl. RNA trimming) teise ensüümiga – Diceri-nukleaasiga miRNA-ks. Viimane seostub valkudega miRICS-kompleksiks. miRICS-i koosseisus olev üksikahelaline miRNA seondub oma märklaudjärjestusele mRNA-s ning blokeerib sellega mRNA translatsiooni. Siinjuures Joonis 9.3. Valgusünteesi komponendid eukarüoodil. Transkriptsioonilised RNA-d: mRNA, miRNA, rRNA, snRNA, tRNA. snRNA splaissingu funktsioon splaissosoomis. mRNA, rRNA, tRNA ribosoomide ja aminohapete osalus translatsioonil tsütoplasmas. miRNA regulatiivne funktsioon: Drosha on ensüüm, mis lõikab tuumas pre-miRNA-st välja kaksikahelalised RNA osad; Dicer on nukleaas, mis trimmib pre-miRNA-st miRNA; RICS on RNA indutseeritud translatsiooni vaigistav kompleks. U5 U1 DNA Transkriptsioon RNA protsessing snRNA rRNA tRNA mRNA Pre-miRNA U6 U4 U2 Splaissosoom RNA transkript Pre-miRNA mRNA tRNA rRNA Dicer-nukleaas Ribosoomivalgud mRNA mRNA degradatsioon Translatsiooni repressioon Aminohapped Translatsioon Polüpeptiid Transkriptsioon Tsütoplasma Tuum RICS Ribosoom Drosha-nukleaas miRNA 266Transkriptsioon ja RNA protsessing aga blokeeritud mRNA-d ei degradeerita ning neid saab edaspidi kasutada. Seega miRNA vaid moduleerib valgusünteesi toimumist rakus. miRNA on peale eukarüootide ka eukarüootsetes viirustes. Näiteks herpesviiruses kodeeritakse 140 erisugust miRNA-d. 1.1.3. RNA süntees ja lagundamine RNA süntees on põhimõt eliselt sarnane DNA sünteesiga. Erinevused on vaid järgmised. 1. Eellasmolekulid (prekursorid) on ribonukleotiidtrifosfaadid (mit e desoksüribonukleotiid-trifosfaadid). 2. Komplementaarse RNA-ahela sünteesil kasutatakse matriitsina vaid üht DNAahelat. 3. RNA-ahela sünteesi saab initsieerida de novo, ilma praimerahela (ja selle vaba 3´-OH otsa) olemasoluta. Moodustuv RNA-ahel on komplementaarne DNA matriitsahelaga (ingl. template strand) (jn. 9.4), selle erinevusega, et T asemel on U. Teist DNA-ahelat nimetatakse mit e matriitsahelaks (ingl. nontemplate strand). mRNA-molekulid on RNA kodeerivateks ahelateks e. mõt elisteks e. senss-ahelateks (ingl. sens strands), sest nende info kandub edasi polüpeptiidahela aminohappelisse järjestusse. mRNA-ga komplementaarsed RNA-molekulid on vastasmõt elised e. antisenss-RNA-d (ingl. antisense RNAs). Teoreetiliselt on antisenss-RNA geeni (DNA) mit ematriitsahelalt sünteesitud mRNA-le komplementaarne RNA. Tegelikkuses on genoomis kindlad nn. vastasgeenid, millelt CGTATGCTAGTCCGATTGCG GCATACGATCAGGCTAACGC GCAUACGAUCAGGCUAACGC CGTATGCTAGTCCGATTGCG Matriitsahel Mittematriitsahel DNA 3´ 5´ 3´ 5´ RNA süntees mRNA 3´ 5´ 3´ 5´ Matriitsahel RNA DNA Senss-RNA ahel RNA süntees Antisenss-RNA 3´ 5´ RNA DNA 5´ GCATACGATCAGGCTAACGC 3´ Mittematriitsahel Antisenss-RNA ahel CGUAUGCUAGUCCGAUUGCG Joonis 9.4. RNA süntees toimub vaid ühel DNA-ahelal. mRNA sünteesitakse DNA matriitsahelal. RNA sünteesil loetakse geneetilist informatsiooni 3´→ 5´ ahelalt, süntees toimub suunas 5´→ 3´. Sünteesitud 5´→ 3´ RNA-ahel on komplementaarne DNA 5´→ 3´ mit ematriitsahelaga (T asemel on vaid U). Antisenss-RNA on kui DNA mit ematriitsahelal sünteesitud RNA. Transkriptsioon ja RNA protsessing 267 moodustatakse antisenss-RNA-d, mis võivad paarduda mitmete mRNA-de märklaudjärjestustega ning blokeerida sellega mRNA translatsiooni. Tüüpiliselt on antisenss-RNA-d ca 100 nukleotiidi pikad ning nende seondumisjärjestus on ca 30 nukleotiidi pikkune. Antisenss-R NA-de kui väikeste regulatoorsete R NA-de seondumine mR NA äratundmisjärjestustele sõltub väikesest spetsiif lisest Hfg-valgust, mida nimetatakse RNA-tšaperoniks (ingl. RNA chaperon), sest see valk aitab väikestel RNA-molekulidel hoida oma korrektset struktuuri. Hfg-valk moodustab mRNA ja antisenss-RNA paardumisel nende ümber moodustuvate tasapindade heksameerse struktuuri ning selle kompleksiga seondub veel ribonukleaas E, mis alustab mRNA degradeerimist. RNA-ahela süntees toimub nagu DNA puhulgi suunas 5´ → 3´, kus ribonukleotiide lisatakse ahela lõppu, 3´-hüdroksüülgrupi (3´-OH) külge. Analoogselt DNA-sünteesiga toimub selles reaktsioonis 3´-OH nukleof ilne rünnak eellasmolekuli, ribonukleotiidtrifosfaadi kolme fosfaadi sisemisele (nukleotidüül)fosforiaatomile ning sellega kaasneb pürofosfaadi vabanemine (jn. 9.5). RNA-sse lülituv nukleotiid on komplementaarne vastasoleva DNA matriitsahela nukleotiidiga. O CH2 H H H H O P O O O O CH2 H H H H O P O O O O CH2 H H H H O P O O O O CH2 H H H H O O P O O O CH2 O P O O O CH2 O H H OH H H O H OH H OH H H O P O O O P CH2 O O O P O O O H OH H OH H H O Uue sideme moodustumine Tsütosiin Guaniin Guaniin Tsütosiin Uratsiil Adeniin Tümiin H H H H O 3´ 5´ 3´ 5´ Saabuv ribonukleotiidtrifosfaat Ahela pikenemine RNA DNA Joonis 9.5. RNA-ahela elongatsioon suunas 5´→ 3´ RNA polümeraasi toimel. 268Transkriptsioon ja RNA protsessing RNA sünteesi teostab ensüüm RNA polümeraas (ingl. RNA polymerase). Summaarset reaktsiooni väljendatakse järgmiselt: DNA matriits n(RTP) → → → → (RMP)n + n(PP), RNA polümeraas kus n on kasutatud ribonukleotiidtrifosfaatide (RTP), RNA-sse lülitunud ribonukleotiidmonofosfaatide (RMP) ja vabanenud pürofosfaatide (PP) hulk. RNA polümeraas seondub ja alustab transkriptsiooni DNA spetsiif listelt järjestustelt, mida nimetatakse promootoriks (ingl. promoter). Pro- ja eukarüootsetel geenidel on promootorjärjestused erinevad. Transkriptsiooni initsiatsiooni promootoritelt reguleeritakse transkriptsioonifaktorite (ingl. transcription factors) seondumisega promootoriga. Transkriptsioonifaktorid on nii positiivsed kui ka negatiivsed regulaatorvalgud, kusjuures positiivsed regulaatorvalgud soodustavad ja negatiivsed pidurdavad transkriptsiooni alustamist. Transkriptsioon toimub RNA polümeraasi toimel lokaalselt lahtikeerdunud DNA-lõigul, mida nimetatakse ka transkriptsioonisilmaks või transkriptsioonimulliks (ingl. transcription bubble) (jn. 9.6). Prokarüootidel on üks RNA polümeraas, eukarüootsetes rakkudes aga kolm erinevat RNA polümeraasi, kuivõrd viimasel juhul katalüüsivad erinevad polümeraasid eri tüüpi RNA-molekulide sünteesi. C A U G U A A A U U U U C A G A U U A G G T A C A T T T A A A A G T C T A A T C G C T T A C A T G T A A A T T T T C A G A T T A G C G A A T RNA DNA matriitsahel Lokaalselt lahtikeerdunud DNA-fragment RNA polümeraas 5´ 5´ 5´ 3´ 3´ 3´ RNA/DNA hübriid DNA mittematriitsahel Joonis 9.6. RNA süntees lokaalselt lahtikeerdunud DNA piirkonnas e. transkriptsioonisilmas. Transkriptsioonisilmas on näha, et vaid mõned ük sikud DNA matriitsahela nuk leotiidid on aluspaardunud kasvava RNAahela lõpus (R NA/DNA hübriid). DNA-molekuli lahtikeerdumist enne ja tagasi kinnikeerdumist pärast replikatsioonisilma katalüüsitakse RNA polümeraasi poolt. Meeldejätmiseks • Molekulaarbioloogia põhipostulaat ütleb, et geneetiline informatsioon kandub nukleiinhappelt nukleiinhappele ja nukleiinhappelt valku, mitte valgult nukleiinhappele. • Transkriptsioonil sünteesitakse RNA transkript, mis on komplementaarne geeni DNA ühe ahelaga. • Transkribeeritakse viit erinevat tüüpi RNA-molekule (mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, miRNA), milledest transleeritakse vaid mRNA-d. • Translatsioonil konverteeritakse RNA nukleotiidses järjestuses sisalduv geneetiline informatsioon valkude polüpeptiidide aminohappeliseks järjestuseks (geeni produktiks) geneetilise koodi abil. Transkriptsioon ja RNA protsessing 269 • Eukarüootsed geenid asuvad tuumas, polüpeptiidid sünteesitakse aga tsütoplasmas. • Transkriptsioonil moodustuvad RNA-d protsessitakse valdavalt tuumas ja transporditakse tsütoplasmasse, v.a. miRNA. • Geneetilise informatsiooni ülekande vaheühendiks on mRNA, millega kantakse informatsioon DNA-lt ribosoomidesse, kus toimub valgusüntees. • RNA polümeraasi poolt katalüüsitav RNA-süntees on väga sarnane DNA-sünteesiga. • RNA-süntees toimub lokaalselt lahtikeerdunud DNA-lõigul, mis algab promootorist ning kus RNA-sünteesi matriitsina kasutatakse vaid üht DNA-ahelat. 1.2. Transkriptsioon prokarüootidel Transkriptsiooni põhietapid on pro- ja eukarüootidel samased, kuid on ka olulisi erinevusi, näiteks juba nimetatud promootorite nukleotiidsed järjestused. Lisaks on RNA polümeraasid pro- ja eukarüootidel, eriti arhedel, erisuguse ehitusega. DNA segment, mis transkribeeritakse üheks R NA-molekuliks, kannab nime - tust „transkriptsiooniüksus” (ingl. transcription unit). Eukarüootidel on transkriptsiooniüksus sageli ekvivalentne individuaalse geeniga. Prokarüootidel on transkriptsiooniüksuseks aga mitu geeni, mis on osa operonist (ingl. operon). Operoni koosseisu kuuluvad veel operoni geene reguleerivad DNA-järjestused. Operonilt sünteesitud RNA-molekuli nimetatakse polütsistroonseks RNA-ks (ingl. polycistronic RNA). Transkriptsioonil eristatakse kolme staadiumi (jn. 9.7). 1. Uue RNA-ahela alustamine e. initsiatsioon (ingl. initiation). 2. Ahela pikenemine e. elongatsioon (ingl. elongation). 3. Transkriptsiooni lõpetamine e. terminatsioon (ingl. termination) ja valmis RNAmolekuli vabanemine. Transkriptsiooni kirjeldamisel kasutatakse termineid „ülesvoolujärjestused” (ingl. upstream sequences) ja „allavoolujärjestused” (ingl. downstream sequences) tähistamaks DNA piirkondi, mis jäävad transkribeeritavast alast kodeerivas DNA-ahelas vastavalt 5´- ja 3´-otsa suundadesse. Selline eristus põhineb faktil, et RNA süntees toimub alati suunas 5´ → 3´. Geeni üles- ja allavoolujärjestused kirjeldavad seega geeni 5´ ja 3´ DNAjärjestusi, mis jäävad transkriptsiooni alguspunktist vastavalt vasakule või paremale. Prokarüootidel algab translatsioon ja mRNA-molekulide degradatsioon sageli enne, kui nende süntees (transkriptsioon) veel lõpebki. Selline samaaegne toime on võimalik, sest mRNA-molekulid sünteesitakse, transleeritakse ja degradeeritakse samaselt, suunas 5´ → 3´. Lisaks pole prokarüootidel peptiidide sünteesi masinavärk (valgu süntees) ruumiliselt mRNA sünteesist eraldatud – neil pole tuumamembraaniga piiritletud tuuma nagu ka teisi membraaniga ühendatud organelle. 1.2.1. RNA polümeraas Prokarüootide RNA polümeraas on multimeerne valk molekulmassiga ca 480 000 daltonit. RNA polümeraas koosneb viiest alaüksusest e. alaühikust. Kompleksse RNA polümeraasi molekuli e. holoensüümi (ingl. holoenzyme) koostis on α2 ββ´σ ning selline 270Transkriptsioon ja RNA protsessing kompleks on vajalik transkriptsiooni initsieerimiseks (alustamiseks). Elongatsiooni viib läbi RNA polümeraasi põhiensüüm e. apoensüüm (ingl. apoenzyme), mis on tetrameerne valk koostisega α2 ββ´. α-subühikud osalevad RNA polümeraasi apoensüümi assambleerimisel (kokkupakkimisel), β-subühik sisaldab ribonukleosiidtrifosfaadi seondumissaiti ja β´-subühik DNA matriitsahelaga seondumise piirkonda. Sigmafaktor (ingl. sigma (σ) factor) on vajalik vaid transkriptsiooni initsiatsiooniks. Pärast transkriptsiooni alustamist ta vabaneb ning RNA-ahela edasist pikenemist (elongatsiooni) viib läbi juba RNA polümeraasi apoensüüm. Sigmafaktori funktsiooniks on ära tunda ja seondada RNA polümeraas DNA-promootorsaiti. Bakteritel on mitmed erinevad ning spetsiif lised sigmafaktorid, mis võimaldavad RNA polümeraasil seonduda erinevate promootorjärjestustega. Neist põhiline on σ70. RNA polümeraasi holoensüüm (σ esineb) on võimeline alustama RNAahela sünteesi ka in vitro, kuid üksnes samadest saitidest kui in vivo. Seevastu R NA polümeraasi apoensüüm (σ puudub) on võimeline läbi viima RNA sünteesi in vitro ainult ebaspetsiif liselt. Sel puhul toimub RNA sünteesi alustamine (initsiatsioon) juhuslikult jaotuvatest punktidest ning mõlemalt DNA-ahelalt. 1.2.2. RNA-ahela initsiatsioon Transkriptsiooni initsiatsioon jaotatakse kolmeks etapiks. 1. RNA polümeraasi holoensüümi seondumine DNA promootorpiirkonda. 2. RNA polümeraasi toimel DNA kaksikahela lokaalne lahtikeerdumine, millega matriitsahel muutub vabaks, et võimaldada paardumist saabuvate ribonukleotiididega. DNA DNA DNA RNA polümeraas RNA 5´-ots Kasvav RNA-ahel Valmis RNA-molekul RNA-ahela initsiatsioon RNA-ahela elongatsioon RNA-ahela terminatsioon 1 2 3 Joonis 9.7. Prokarüootse transkriptsiooni kolm etappi: initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon. Transkriptsioon ja RNA protsessing 271 3. Fosfodiestersideme moodustumine, kus kasvavasse RNA-ahelasse lülitatakse esimesed ribonukleotiidid. RNA polümeraasi holoensüüm jääb promootoriga seotuks (ilma et RNA polümeraas liiguks mööda DNA-ahelat edasi) esimese 8–9 fosfodiestersideme moodustumisel. Transkriptsiooni initsiatsioonil sünteesitakse seega lühikesi RNA-lõike (2–9 nukleotiidi). Kui need vabanevad, siis sellega transkriptsioon ka lõpeb ning tegemist on abortiivse transkriptsiooniga (ingl. abortive transcription). Abortiivne transkriptsioon lõpeb juhul, kui on sünteesitud juba 10 või rohkem ribonukleotiidi. Sel juhul vabaneb sigmafaktor ning RNA polümeraasi põhiensüüm (apoensüüm) liigub edasi mööda DNA-ahelat promootorist allavoolu ning jätkab RNA-ahela elongatsiooni (pikendamist). Kokkuleppeliselt nummerdatakse transkriptsiooni initsiatsiooni piirkonnas nukleotiide, lähtudes transkriptsiooni initsiatsioonisaidist. Esimene nukleotiidipaar (märgitakse +1) vastab RNA transkripti esimesele (5´) nukleotiidile. Initsiatsioonisaidile eelnevaid nukleotiidipaare tähistatakse miinusmärgiga, initsiatsioonisaidile järgnevaid plussmärgiga. Nimetatud järjestusi nimetatakse ka vastavalt üles- ja allavoolu esinevateks nukleotiidijärjestusteks. Prokarüootsed promootorid erinevad üksteisest oluliselt. Selleks, et sigmafaktor saaks spetsiif liselt ära tunda promootoripiirkonna, on vajalikud konserveerunud nukleotiidijärjestusega piirkonnad. Kahe konserveerunud piirkonna keskpunktid asuvad 10 ja 35 nukleotiidipaari kaugusel transkriptsiooni initsiatsioonisaidist ülesvoolu ning neid järjestusi nimetatakse seepärast vastavalt –10- ja –35-järjestusteks (ingl. –10 and –35 sequences) (jn. 9.8). Kuivõrd need järjestused on erinevatel liikidel pea ühesugused, nimetatakse neid konsensusjärjestusteks (ingl. consensus sequences). Tavaliselt on need järjestused heksameersed: –10-järjestus mit ematriitsahelal on TATAAT ja –35-järjestus TTGAGC. Kuna sigmafaktor tunneb kõigepealt ära –35-järjestuse ja seondub sellega, siis nimetatakse seda järjestust ka äratundmisjärjestuseks (ingl. recognition sequence). AT-rikas –10-järjestus võimaldab DNA-s esmast kaksikahelate lahtikeerdumist, andes eelduse, et RNA süntees saaks üldse alata. Üldiselt on –10- ja –35-järjestuste vahemaa tugevasti konserveerunud: mit e kunagi pole see väiksem kui 15 ja suurem kui 20 nukleotiidipaari. Transkriptsioooni alguspunkt jääb –10-järjestusest 5–9 nukleotiidi allavoolu. Geeni RNA-transkripti esimeseks 5´-aluseks on E. coli´l üle 90%-l juhtudest puriin. 1.2.3. RNA-ahela elongatsioon R NA-ahela elongatsiooni katalüüsib R NA polümeraasi põhiensüüm, millest on vabanenud sigma faktor. RNA-ahelate kovalentsete sidemetega (ribonukleotiidide lisandumisega) pikenemine toimub transkriptsioonisilmas lokaalselt lahtikeerdunud DNA alal. RNA polümeraasil on nii DNA-d lahtikeerav kui ka tagasi kokkukeerav aktiivsus: RNA polümeraas katalüüsib pidevalt DNA-ahelate lahtikeerdumist enne polümerisatsioonisaiti ning põhjustab komplementaarsete ahelate kokkukeerdumist pärast polümerisatsioonisaiti, liikudes samal ajal piki DNA kaksikheeliksit edasi (jn. 9.9). E. coli´l on transkriptsioonisilma keskmine pikkus 18 nukleotiidipaari ning sekundis lülitatakse kasvavasse RNA-ahelasse ca 40 ribonukleotiidi. Tekkiv R NA-ahel vabaneb DNA matriitsahelalt RNA polümeraasi edasiliikumisel mööda DNA-d. Tegelik 272Transkriptsioon ja RNA protsessing T T A A A T A A C T G T T T G A C A A T A T A T T või C A või G 16–19 bp 5 – 9 bp Äratundmisjärjestus e. –35-järjestus -10-järjestus Transkriptsioon Matriitsahel Mittematriitsahel 5´ 5´ 3´ 3´ Transkriptsioonisilm Ülesvoolusuund Allavoolusuund Joonis 9.8. E. coli tüüpiline promootor. RNA polümeraas seostub promootori –35-järjestusega ja initsieerib DNA-ahelate lahtikeerdumise A-T-rikkas –10-piirkonnas. Transkriptsioon algab transkriptsioonisilma saidis, mis on –10-järjestusest 5–9 bp allavoolu. DNA kaksikheeliks RNA polümeraas Lühike DNA/RNA kaksikheeliks DNA Lahtikeerdumissait Kinnikeerdumissait Lahtikeerdumissait Kinnikeerdumissait Ribonukleotiidide sisenemise sait Kasvav RNAahel DNA kaksikheeliks Kasvav RNAahel Transkriptsioonikompleks A B RNA polümeraasi liikumissuund DNA RNA polümeraas 5´ 5´ 3´ 3´ Transkriptsioonisilm Joonis 9.9. RNA polümeraasi poolt katalüüsitav RNA-ahela pikenemine (elongatsioon) E. coli´s. A. RNA polümeraas seondub DNA-ga ja pikendab kovalentselt RNA-ahelat. B. RNA polümeraas liigub allavoolu koos RNA-ahela pikenemisega. Transkriptsioon ja RNA protsessing 273 paardumisala DNA matriitsahela ja kasvava RNA-ahela vahel on lühikene – pikkus kuni kolm nukleotiidipaari. Seetõt u saavutatakse transkriptsioonikompleksi stabiilsus tänu DNA-ahela ja kasvava RNA-ahela seondumisele RNA polümeraasiga. 1.2.4. RNA-ahela terminatsioon RNA-ahela süntees lõpetatakse (termineeritakse) siis, kui RNA polümeraas kohtab terminatsioonisignaali (ingl. termination signal). Terminatsioonisignaal põhjustab transkriptsioonikompleksi dissotsieerumist ning moodustunud RNA-molekuli vabanemist. E. coli´l tuleb et e kaht tüüpi transkriptsiooni terminatsiooni: 1) Rho-sõltuv terminatsioon (ingl. rho-dependent termination), kus Rho-valgu olemasolu on hädavajalik; 2) Rho-sõltumatu terminatsioon (ingl. rho-independent termination), kuis Rhovalgu olemasolu pole vajalik. Transkriptsiooni terminatsioonijärjestust, mis tunneb ära Rho(ρ)-valgu, nimetatakse Rho-sõltuvaks terminaatoriks, Rho-valku mit etundvaid terminatsioonijärjestusi aga Rho-sõltumatuteks terminaatoriteks. Rho-sõltumatud terminaatorid sisaldavad DNA-s GC-rikast piirkonda, millele järgneb 6 või rohkem AT-aluspaari, kus N-alus A asub matriitsahelas (jn. 9.10). GC-rikas piirkond asub DNA-s selliselt, et üksikahelalises RNA-s saab vastav piirkond moodustada sekundaarseid kaksikahelalisi RNA piirkondi (juuksenõelasarnaseid struktuure). Juuksenõelastruktuurid (ingl. hairpin structures) moodustuvad kohe pärast vastavate RNA piirkondade sünteesi. Sellega aeglustatakse RNA polümeraasi liikumist mööda DNA-d (põhjustab pause ahela pikenemisel). Kuna järgnev AU-aluspaardumine nõuab CCCACTGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTTTCTTTCTTTAATGA GGGTGACGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAAAAGAAAGAAATTACT Voltunud RNA-ahel soodustab RNAahela transkriptsiooni terminatsiooni Inverteeritud järjestuste transkriptsioon CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUUUU -OH 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 5´ C C C A C G C A U C G C G G C C G C G G C T A U U U U U U -OH U C C 3´ Matriitsahel RNA kiire voltumine RNA transkript RNA juuksenõelastruktuur DNA Inverteeritud järjestused U G J o o n i s 9.10 . R h o - s õ l t u m a t u transk riptsiooni terminatsioon prokarüootidel. R ho-sõltumatu terminatsioonijärjestus on G-Crikas inverteeritud järjestustega piirkond, millele järgneb minimaalselt 6 A-T-aluspaari. G-C-rikas piirkond moodustab RNA transk riptis juuksenõelastr uktuuri (ahelasisese R NA kaksikahela), millega takistatakse RNA polümeraasi liikumist piki DNAm o l e k u l i j a p õ h j u s t a t a k s e transk riptsiooni terminatsioon külgnevas A-T-rikkas piirkonnas. 274Transkriptsioon ja RNA protsessing ahelate lahknemiseks vähem energiat (kaks H-sidet), siis RNA transkripti U-piirkonna süntees soodustab uuestisünteesitud RNA-ahela lahtitulekut (dissotsieerumist) DNA matriitsilt juhul, kui eelnevalt oli moodustunud GC-juuksenõelastruktuur ja RNA polümeraasi liikuvus oli seetõt u aeglustunud. Rho-sõltuvad terminaatorid (nt. rRNA sünteesi puhul) on samuti GC-rikkad piirkonnad, kus RNA transkriptis on valdavalt C-nukleotiidid. Rho-valk seondub kasvava RNA-ahelaga ja liigub transkriptsioonikompleksi järel mööda RNA-d suunas 5´→ 3´ ning kui RNA polümeraas aeglustab oma liikumist või peatub Rho-sõltuva terminatsioonijärjestuse juures, siis jõuab Rho-valk RNA polümeraasile järele ja tõukab sünteesitud RNA-ahela transkriptsioonikompleksist (transkriptsioonisilmast) välja. Meeldejätmiseks • RNA sünteesil on kolm etappi: initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon. • Transkriptsiooni katalüüsivad RNA polümeraasid on komplekssed multimeersed ensüümid. • RNA-ahela kovalentne pikenemine toimub DNA lokaalselt lahtikeerdunud ahelate piirkonnas. • RNA-ahela pikenemine katkeb, kui RNA polümeraas kohtab transkriptsiooni terminatsiooni signaali. • Prokarüootidel toimub mRNA-molekulide transkriptsioon, translatsioon ja degradatsioon sageli samal ajal. 1.3. Transkriptsioon ja RNA protsessing eukarüootidel Eukarüootidel transkribeeritakse korraga valdavalt vaid üht geeni, kuid siiski on multigeensete transkriptide osa eukarüootidel väga suur. Näiteks varbussi (Caenorhabditis elegans) transkriptidest on üks neljandik multigeensed. Kuigi eukarüootidel on kolme tüüpi RNA polümeraase, läbivad eukarüootsed transkriptid ikkagi sarnased protsessingud. Eukarüootsete transkriptide modif katsioon toimub enne transkriptide transporti tuumast tsütoplasmasse. Põhilisi modif katsioonitüüpe on kolm (jn. 9.11). 1. mRNA esmase (primaarse) transkripti 5´-otsa lisatakse vastupidises suunas 5´-5´-fosfaatsidemega 7-metüülguanosiin-5´-müts (ingl. 5´cap). 2. Transkriptide 3´-otsa lisatakse polü(A)-polümeraasi (ingl. poly(A) polymerase) abil 20– 200 nukleotiidi pikad polü(A)-sabad (ingl. poly(A) tails). 3. Intronid splaissitakse transkriptidest välja. Eukarüootide tuumas olevaid primaarseid transkripte nimetatakse heterogeenseks tuuma-RNA-ks e. hnRNA-ks (ingl. heterogenous nuclear RNA, hnRNA), sest see koosneb väga erineva suurusega RNA-molekulidest. Suurem osa hnRNA-st on mit ekodeeriv ning sisaldab intronite järjestusi. Pärast tuumas toimuvat RNA-protsessingut (ingl. RNA processing) kaetakse transkriptid RNA-seoseliste valkudega (ingl. RNA-binding proteins). Need valgud kaitsevad RNA-d teda lagundavate ensüümide e. ribonukleaaside (ingl. ribonucleases) toime eest (transkriptide transportimisel tuumast tsütoplasmasse). Selline transkriptide valguline kaitse on vajalik, sest eukarüootsete geenide transkriptide poolestusaeg on oluliselt pikem kui prokarüootidel (ca 5 tundi, võrreldes E. coli transkriptide vähem kui 5 minutiga). Transkriptsioon ja RNA protsessing 275 O P O O CH2 O P O O O P O O O H H O CH2 OH H OH O P O O O O O H H H H CH3 CH3 N + N N N OH N H2 5´ 3´ 5´ 2´ N-alus Riboos 7-metüülguanosiin DNA Pre-mRNA 5´-müts 5´-müts 5´-müts 5´-müts 3´-polü(A)-saba 3´-polü(A)-saba 3´-polü(A)-saba -AAAAA(A)~190AAAA-OH 3´ Intron Transkriptsioon 1 2 3 7-MG-mütsi lisamine 5´-otsa Polü(A)-saba lisamine 3´-otsa Introni kõrvaldamine splaissingul mRNA Intron Intron Endonukleaasse katke sait Joonis 9.11. Eukarüootsete geenide kolm transkriptsioonijärgset RNA protsessingu sündmust. 1 – 7-metüülguanosiin-(MG)-mütsi lisamine pre-mRNA 5´-otsa 5´-5´-fosfaatsidemega. 2 – polü(A)-saba lisamine 3´-otsa. 3 – intronite kõrvaldamine geeni splaissingul. 276Transkriptsioon ja RNA protsessing 1.3.1. Kolm RNA polümeraasi Kõikides eukarüootides (k.a. näiteks üherakulised pärmseened) on kolm tüüpi RNA polümeraase: RNA polümeraas I, II ja III (ingl. RNA polymerases I, II and III) (jn. 9.12). Kõik need polümeraasid on palju komplekssemad kui prokarüootide RNA polümeraas. Nad sisaldavad 10 või rohkem alaüksust. Erinevalt prokarüootide RNA polümeraasidest on kõigi eukarüootsete polümeraaside töötamise eeltingimuseks transkriptsiooni initsiatsioonil transkriptsioonifaktorite olemasolu. Resistentne Tundlik Osaliselt tundlik tRNA, 5S rRNA, snRNA Pre-mRNA 5,8S rRNA, 18S rRNA, 23S rRNA RNA polümeraas I RNA polümeraas III RNA polümeraas II Tuumake Tuum Tundlikkus Į-amanitiini suhtes siRNA, siRNA antisenssjärjestused RNA polümeraas V Taimeraku tuum siRNA RNA polümeraas IV Kromatiini ümbermodelleerimine Joonis 9.12. Eukarüootide kolme eri tüübi RNA polümeraasi üldiseloomustus. RNA polümeraas I on tuumakeses, RNA polümeraasid II ja III tuumas ning RNA polümeraasid IV ja V esinevad vaid taimerakkudes kromatiini ümbermodelleerimise teostamisel siRNA või siRNA märklaudjärjestuste antisenssjärjestuste moodustamisel. Eukarüootide RNA polümeraas I paikneb tuumakeses, kus sünteesitakse rRNA ning mis seostatakse ribosoomivalkudega juba tsütoplasmas. RNA polümeraas I katalüüsib kõigi rRNA-de sünteesi, v.a. 5S rRNA. Vaid RNA polümeraas II transkribeerib valke kodeerivaid tuuma geene, s.t. sünteesib pre-mRNA-d, aga ka miRNA-d. RNA polümeraas III katalüüsib tRNA-, 5S rRNA- ja snRNA-molekulide sünteesi. Erinevatel eukarüootsetel RNA polümeraasidel on erisugune tundlikkus α-amanitiini suhtes: polümeraas I pole tundlik, polümeraas II aktiivsus inhibeeritakse täielikult juba mürgi madalatel kontsentratsioonidel ja polümeraas III on vahepealse tundlikkusega. α-amanitiin on metabolismimürk, mida sisaldab kärbseseen (Amanita phalloides). 1.3.2. RNA-ahela initsiatsioon Eukarüootsed RNA polümeraasid pole, erinevalt prokarüootsest RNA polümeraasist, võimelised initsieerima ise transkriptsiooni. Eukarüootsete RNA polümeraaside seondumiseks DNA-ga on eelnevalt vajalik põhiliste transkriptsioonifaktorite (ingl. basal transcription factors) seondumine promootorijärjestustega. Seejuures on promootorid ja transkriptsioonifaktorid erisuguste geenide puhul väga erinevad. Kõikide RNA polümeraaside puhul toimub DNA kaksikahelate lokaalne teineteisest eraldumine ning vaba matriitsahela moodustumine. Transkriptsiooniüksuse Transkriptsioon ja RNA protsessing 277 promootoriga interakteeruvad seejuures mitmed erinevad transkriptsioonifaktorid. RNA polümeraas II poolt äratuntavad promootorid sisaldavad konserveerunud järjestuselemente e. mooduleid, mis asuvad transkriptsiooni algussaidist ülesvoolu. Joonisel 9.13 on esitatud hiire tümidiinkinaasi geeni promootori konsensusjärjestused. Teised RNA polümeraas II poolt äratuntavad promootorid sisaldavad neist komponentidest vaid osa. Tran skriptsiooni algussaidile (+1) lähim konsensusjärjestus on TATA-järjestus (ingl. TATA box) konsensusjärjestusega TATA A A A (lugedes mittematriitsahelal suunas 5´→ 3´), mis paikneb keskmisest nukleotiidist ca –30 nukleotiidi kaugusel. TATA-järjestusel on üks tähtsamaid rolle transkriptsiooni algussaidi positsioneerimisel. Siiski ei ole pea pooltel geenidel TATA-järjestusi või neil on sarnane järjestus võrrelduna TATA-ga. Teist konserveerunud järjestust nimetatakse CAAT-järjestuseks (ingl. CAAT box) ning see asub keskmise nukleotiidi suhtes tavaliselt positsioonis –80 ning tal on konsensusjärjestus GGCCAATCT. Kolmandaks konsensusjärjestuseks on GC-järjestus (ingl. GC box) konsensusjärjestusega GGGCGG ja neljandaks oktameerne järjestus (ingl. octamer box) konsensusjärjestusega AT TGCAT. Viimatinimetatud kaht konserveerunud järjestust ei ole kõigil RNA polümeraasi II poolt äratuntavatel promootoritel. Nende olemasolu tõstab aga promootorite transkriptsiooni initsiatsiooni efektiivsust. Nagu juba nimetasime, on RNA polümeraas II seondumiseks DNA-ga vajalik promootori eelnev seondumine rea põhiliste transkriptsioonifaktoritega. Lisaks seonduvad ja interakteeruvad promootoriga veel mitmed transkriptsioonifaktorid, mida nimetatakse tugevdajateks e. enhanseriteks (ingl. enhancers) ja nõrgestajateks e. vaigistajateks (ingl. silencers). Põhiliste transkriptsioonifaktorite seondumine peab toimuma kindlas järjekorras ja viisil. RNA polümeraas II puhul tähistatakse basaalseid transkriptsioonifaktoreid sümboliga TFIIX, kus X tähistab individuaalset transkriptsioonifaktorit. Promootori põhilise transkriptsiooni initsiatsioonikompleksi moodustumine algab interaktsioonil TFIID promootoriga (jn. 9.14). TFIID sisaldab TATA-seoselist valku, mis seondub TATA-järjestusega. Järgmisena ühineb TFIIA ja seejärel järjestatult teised transkriptsioonifaktorid. Transkriptsioonifaktor TFIIF seondub aga esmalt RNA polümeraasiga -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 +1 Transkriptsiooni alguspunkt ATTTGCAT konsensus GGCCAATCT konsensus TATAAAA konsensus GGGCGG konsensus GGGCGG konsensus Oktameerne järjestus GCjärjestus CAATjärjestus TATAjärjestus GCjärjestus Joonis. 9.13. RNA polümeraasi II äratundva promootori struktuur. TATA- ja CA AT-järjestused asuvad pea samades kohtades enamiku eukarüootide promootorites. GC- ja oktameersed järjestused võivad esineda või ka puududa: kui nad esinevad, asuvad nad väga erinevates kohtades ja neil on väga erinev koopiaarv. 278Transkriptsioon ja RNA protsessing 5´ 3´ 3´ 5´ -50 5´ 3´ 3´ 5´ ATATTTT TATAAAA 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´ A A ATATTTT TATAAAA B ATATTTT TATAAAA 5´ 3´ 3´ 5´ A B ATATTTT TATAAAA F 5´ 3´ 3´ 5´ A B ATATTTT TATAAAA F E -30 -10 +10 +30 +1 Transkriptsiooni alguspunkt +1 +1 +1 +1 +1 RNA polümeraas II Transkriptsioonifaktor TFIID seondub TATA-järjestusega 1 2 3 Transkriptsioonifaktor TFIIA seondub initsiatsioonikompleksiga Transkriptsioonifaktor TFIIB seondub initsiatsioonikompleksiga Transkriptsioonifaktor TFIIF (lahtikeerav aktiivsus) ja RNA polümeraas II seonduvad initsiatsioonikompleksiga Transkriptsioonifaktor TFIIE seondub initsiatsioonikompleksiga 4 5 D D Joonis 9.14. Eukarüootse transkriptsiooni initsiatsioon RNA polümeraas II-ga. Esmalt seondub DNA-ga transkriptsioonifaktor TFIID (1), seejärel järjestikuliselt TFIIA (2), TFIIB (3), TFIIF (millel DNA-d lahtikeerav aktiivsus) koos RNA polümeraas II-ga (4) ja initsiatsioonikompleksi moodustamise lõpetab TFIIE (5). Transkriptsioon ja RNA protsessing 279 II ning nende kompleks ühineb edaspidi juba transkriptsiooni initsiatsiooni kompleksiga. TFIIF koosneb kahest alaüksusest, millest ühel on DNA-d lokaalselt lahtikeerav aktiivsus. Lõpuks seondub initsiatsioonikompleksiga transkriptsioonifaktor TFIIE, mis seondub DNA-ga transkriptsiooni alguspunktist allavoolu (transkriptsioonikompleksi et e). Lisaks tuleb nimetada transkriptsioonifaktorit TFIIH, mis seondub pärast TFIIE-d. TFIIH-l on helikaalne aktiivsus ning ta liigub elongatsiooniprotsessis koos RNA polümeraas II-ga mööda DNA-d, keerates DNA-ahelaid transkriptsioonisilmas lahti. R NA polümeraaside I ja III promootorid on märgatavalt erineva nukleotiidse järjestusega, ehkki nad võivad sisaldada RNA polümeraas II promootoritega samu cis-toimelisi elemente (ingl. cis-acting elements). RNA polümeraas I promootorid on kahetised, kus põhijärjestused lokaliseeruvad piirkonnas –45 kuni +20 ning lisaks seonduvad kontrollelementidega ülesvoolu piirkonnas –180 kuni –105. Neil kahel piirkonnal on sarnased nukleotiidsed järjestused ning nad on GC-rikkad alad. Transkriptsiooni initsiatsiooniks piisab põhijärjestusest, kuid transkriptsiooni initsiatsiooni efektiivsust tõstab tugevalt ülesvoolu esinev kontrollelement (enhanser). Erinevalt RNA polümeraasidest I ja II asub enamus RNA polümeraas III promootorjärjestustest hoopis transkriptsiooni initsiatsioonisaidist allavoolu. 1.3.3. RNA-ahela elongatsioon ja 5´-metüülguanosiinmütsi lisamine Pärast seda kui RNA polümeraas vabaneb promootori initsiatsioonikompleksi põhilistest transkriptsioonifaktoritest, järgneb RNA-ahela pikenemine (elongatsioon) sama mehhanismi alusel, nagu seda teeb prokarüootide RNA polümeraas. Paralleelselt elongatsiooniga, kui kasvav RNA-ahel on vaid ca 30 nukleotiidi pikkune, toimub pre-mRNA 5´-otsa modifitseerimine (jn. 9.15). Pärast transkriptsiooni GTP 2´-O-metüültransferaas Transkriptsiooniüksus RNA polümeraas II Lühike DNA/RNA kaksikheeliks Lahtikeerdumissait Kinnikeerdumissait Ribonukleotiidide sisenemise sait Pre-mRNA DNA 5´ 7-MG 5´ 3´ CH3-GpppNpNp CH3 CH3-GpppNpNp GpppNpNp pppNpNp Guaniin-7-metüültransferaas Guanüültransferaas PPi + Pi 5´-müts Joonis 9.15. 7-metüülguanosiinmütsi lisamine biosünteesiahelale. 7-me t ü ü l g u a no s i i n - (7- MG -) müts lisatakse pre-mR M A 5´-otsa (5`-5`-trifosfaat: ebaharilik side) pea kohe pä ra st elongatsioon i algust. 280Transkriptsioon ja RNA protsessing lisatakse raku biosünteetilise ahela toimel 7-metüülguanosiin-(7-MG)-müts. 7-MG lisatakse 5`-otsa tagurpidi ebahariliku 5´- 5´-trifosfaatse sidemega ning ta sisaldab kaht või rohkemat metüülgruppi. 7-MG-mütsi tunnevad ära valgulised faktorid, mis toimivad translatsiooni initsiatsioonil. 7-MG-müts aitab ka oluliselt kaitsta kasvavat RNA-ahelat nukleaaside de gradatsiooni eest. Kuivõrd eukarüootne DNA on seotud nukleosoomsesse struktuuri, peavad transkriptsioonil nukleosoomid kas lagunema või võimaldama neis seotud DNA-ahela transkriptsiooni muul viisil. Selgus, et R NA polümeraas II on võimeline mööduma nukleosoomidest kromatiini transkriptsiooni soodustava valgulise FACT-kompleksi (ingl. facilitates chromatin transcription) olemasolul. FACT-kompleks kõrvaldab nukleosoomist histoonide H2A/H2B dimeerid, jät es sellega nukleosoomid heksameerseteks. Pärast polümeraas II möödumist nukleosoomikohast restaureeritakse algsed nukleosoomid (taaslülituvad H2A/H2B dimeerid) FACT-kompleksiga kaasnevate muude valkude koostoimel. Samas, sõltuvalt olukorrast, võivad nukleosoomid vabaneda ka täies ulatuses ja asendatakse uutega (s.t. et toimub de novo nukleosoomse struktuuri taastamine) juba pärast transkriptsiooni. 1.3.4. RNA-ahela terminatsioon ja 3´-polü(A)-saba lisamine RNA polümeraas II ei tunne ära spetsiifilisi terminatsioonisignaale. Seetõttu moodustuvad transkripti 3´-lõpud endonukleaasse lõikamise tulemusena. Tavaliselt termineerub transkriptsioon paljudes erinevates punktides ning piisava varuga, tüüpiliselt 1000–2000 nukleotiidi allavoolu hilisemast küpsenud (valminud) transkripti 3´-otsast. Transkripti 3´-ots täpsustatakse endonukleaasi toimel. Tavaliselt moodustub Transkriptsiooniüksus RNA polümeraas II AAUAAA GC-rikas järjestus Polü(A)-saba Lõikamine endonukleaasiga -müts 5´ 7-MG 5´ 3´ Endonukleaasne katke AAUAAA 5´ 3´ -müts AAUAAA 5´ AAAAA(A)195 3´ Polü(A)-saba lisamine polü(A)-polümeraasi abil Joonis 9.16. Polü(A)-saba lisamine eu ka r üood i tra nsk r ipt i 3´-otsa ensüümiga polü(A)-polümeraas. Polü(A)-polümeraasile vajalik vaba 3´-OH ots moodustub pre-mRNA transkriptil polüadenülatsioonisignaalist allavoolu ja enne GC-rikast järjestust endonukleaasse katkemisega. Polüadenülatsioonisaidis on konsensusjärjestus A AUA A A. Transkriptsioon ja RNA protsessing 281 lõikamisel 3´-ots 11–30 nukleotiidi kaugusel allavoolu RNA transkriptis olevast konsensusjärjestusest AAUAAA ning ülesvoolu DNA transkriptsiooniüksuse lõpu lähedal paiknevast GC-rikkast piirkonnast (jn. 9.16). Pärast endonukleaasset lõikamist lisab ensüüm polü(A)-polümeraas transkripti 3´-otsa polü(A)-saba, mis koosneb kuni 200 ühesugusest nukleotiidist – adenosiinmonofosfaadist. Seda protsessi nimetatakse polüadenülatsiooniks (ingl. polyadenylation). Järelikult on polü(A)-saba moodustamiseks vaja transkripti spetsiif list 3´-otsa, mis moodustub AAUAAA-järjestust äratundva komponendi, GC-rikka järjestust stimuleeriva faktori, endonukleaasi ja polü(A)-polümeraasi toimel. Eukarüootide mRNA polü(A)-saba suurendab oluliselt transkripti stabiilsust ja tal on tähtis rolll mRNA transportimisel tuumast tsütoplasmasse. RNA polümeraasid I ja III tunnevad aga ära kindlaid terminatsioonisignaale. RNA polümeraas I termineerib transkriptsiooni 18 nukleotiidi pikkusega järjestusel, kuhu on eelnevalt seondunud terminatsioonivalk. RNA polümeraas III reageerib terminatsioonisignaalile analoogselt E. coli´s toimuva Rho-sõltumatu terminatsiooniga. 1.3.5. RNA korrektuur Molekulaarbioloogia põhidogma kohaselt ei muutu geneetilise informatsiooni ülekande vaheetappidel (DNA-st mRNA-ks) geneetiline informatsioon. Erandjuhtudel võib see aga siiski toimuda. Üheks RNA muutumise mehhanismiks on RNA korrektuur e. RNA redigeerimine (ingl. RNA editing), kus mRNA-s olevat geneetilist informatsiooni muudetakse juba sünteesitud mRNA-molekulis. RNA editeerimisel muudetakse vastava geeni geneetilist informatsiooni kahel viisil: 1) üksikute N-aluste struktuuri muutmisega; 2) uridiinmonofosfaadi jääkide (U) lisamise või kõrvaldamisega. 1.3.5.1. Lämmastikaluste muutmine mRNA-s RNA editeerimisel muudetakse mRNA-molekulis lämmastikaluste struktuuri. Seda protsessi tuleb harva et e, vaid üksikutel spetsiif listel juhtudel. Näiteks toimub C → U konversioon, kus järjestikuspetsiifiline RNA-ga seonduv valk kõrvaldab tsütosiinist aminogrupi. Nimetatud protsess toimub näiteks CAA- (glutamiini-) koodonis, mis muudetakse tsütosiini desamiinimisel transkriptsiooni terminatsioonikoodoniks UAA. Järelikult kõrvaldatakse siin geeni avaldumine mRNA editeerimise tasemel, sest stoppkoodoni moodustumisel ei saa tekkida enam terviklikku polüpeptiidi – vastava geeni produkti. Järelikult on mRNA editeerimisel geeni avaldumisele regulatiivne toime. Käsitletavat tüüpi R NA editeerimine avastati roti ja inimese apolipoproteiin-B (apo-B) geenide mRNA-de puhul (jn. 9.17). Apolipoproteiinid on veres olevad valgud, mis transpordivad erinevat tüüpi rasvamolekule. Maksas kodeerib apolipoproteiini apo-B-mRNA terviklikku 4563-aminohappelist polüpeptiidi, seedetraktis aga lühikest 2153-aminohappelist polüpeptiidi, sest C → U konversiooniga moodustus siin transkriptsiooni terminaatorkoodon UA A. Sama tüüpi N-aluste konversiooni on näidatud ka rot ide ajurakkudes glutamaadi retseptorvalgu puhul. Taimede mõnedes mitokondriaalse DNA määratud transkriptides muudetakse aga lausa enamik C-sid U-deks. 282Transkriptsioon ja RNA protsessing 1.3.5.2. Uridiinmonofosfaatide lisamine ja kõrvaldamine mRNA-s U-nukleotiidide lisamine või kõrvaldamine mR NA-molekulidest on kompleksne protsess, mida teostavad teatud mitokondriaalsete geenide poolt moodustatavad madalmolekulaarsed giid-RNA-d (ingl. guide RNAs, gRNA). Giid-RNA-d sisaldavad järjestusi, mis on vaid osaliselt homoloogsed korrigeeritava pre-mRNA-järjestustega. Giid-RNA ja korrigeeritava pre-mRNA paardumine põhjustab mRNA-s tühikute ja giid-RNA-s mittepaardunud A-nukleotiidide moodustumist. R NA korrigeerimisel kasutatakse gRNA-d matriitsina A-aluste vastu U-lämmastikaluste lisamisel mRNA tühikutesse. Saame informatsiooniliselt muudetud e. editeeritud mRNA. Nimetatud protsessi on kirjeldatud näiteks alglooma Leishmania tarentolae mitokondrites (jn. 9.18). See viburloom põhjustab inimesel aafrika unitõbe. Ehkki seda tüüpi RNA korrigeerimise geneetiline tagapõhi on veel ebaselge, on selgunud, et nimetatud nähtusel on nii trüpanosoomide kui ka taimede mitokondriaalsete geenide avaldumisel põhiroll. 3´ 5´ C A A 3´ 5´ COOH CAA GTT CAA 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ C A A U 3´ H2N COOH H2N DNA maksas seedetraktis Redigeerimata mRNA Redigeeritud mRNA Transkriptsioon ja intronite splaissing RNA-seoseline desaminaas RNA redigeerimine: tsütosiini oksüdatiivne desamiinimine Translatsioon Apolipoproteiin: 4563 aminohapet Apolipoproteiin: 2153 aminohapet Joonis 9.17. Apolipoproteiin A mRNA editeerimine loomade seedetraktis. CA A-koodonis tsütosiini oksüdatiivsel desamiinimisel moodustub tsütosiinist uratsiil ja koodon muutub stoppkoodoniks UA A. RNA redigeerimise tulemusel moodustub üle kahe korra lühem valguline produkt. Transkriptsioon ja RNA protsessing 283 Meeldejätmiseks • Eukarüootidel on kolm erinevat RNA polümeraasi, mis on spetsialiseerunud eri tüüpi geenide transkriptsiooniks. • Eukarüootsete geenide transkriptidel toimub valdavalt kolm erinevat tüüpi RNA protsessingut e. modif tseerimist: 1. 7-metüülguanosiinmütsi lisamine 5´-otsa; 2. polü(A)-saba lisamine 3´-otsa; 3. mittekodeerivate intronjärjestuste kõrvaldamine (geeni splaissing). • RNA redigeerimisega toimub eukarüootsete geenitranskriptide informatsiooni muutmine, sest enne translatsiooni leiavad aset muudatused nende geenide mRNA-de nukleotiidses koostises ja järjestuses. TTTCGCCTCTCTTTTCTTTTCCGAAATTGAAGTCCAACAAATAATGCTCATATACC Transkriptsioon 5´ 3´ 3´ 5´ 3´ 5´ DNA matriitsahel Pre-mRNA AAAGCGGAGAGAAAAGAAAAGGCUUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG 5´ 3´ AAAGCGGAGAGAAAAGAAA A G G C UUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG UUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAGU AUAUUCAAUAAUAAAU UCAGUAUACACUAUAAUAAUAAU 3´ 5´ 5´ 3´ AAAGCGGAGAGAAAAGAAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG UUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAGU AUAUUCAAUAAUAAAU UCAGUAUACACUAUAAUAAUAAU 5´ 3´ AAAGCGGAGAGAAAAGAAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG Paardumine osaliselt komplementaarse giid-RNA-ga Uridiinmonofosfaatide insertsioon Giid-RNA vabanemine mRNA-st Redigeeritud mRNA Giid-RNA Giid-RNA Pre-mRNA Pre-mRNA Joonis 9.18. Mitokondriaalse tsütokroom b pre-mRNA redigeerimine trüpanosoomil Leishmania tarentolae. Pre-mRNA paardub osalise komplementaarsusega giid-RNA-ga. Giid-RNA paardunud lõigus on kaheksa A-d, mis pre-mR NA-s puuduvad: paardumisel täidetakse need kaheksa tühikut uridiinmonofosfaatide lisamisega. RNA redigeerimisel muudetakse mRNA-s olevat geneetilist informatsiooni ning saadakse muutunud redigeeritud mRNA ja translatsioonil täiesti muutunud polüpeptiid. 284Transkriptsioon ja RNA protsessing 2. GEENIDE INFORMATSIOONILINE KATKENDLIKKUS Enamik prokarüootseid geene on pidevad, s.t. et nende nukleotiidid on järjestunud pidevalt määramaks aminohapete järjestust polüpeptiidides (geeni produktides). Seevastu eukarüootsetes geenides paiknevad enamasti geeni kodeerivate alade vahel mit ekodeerivad alad. Seega on need geenid katkendlikud, sisaldades vahejärjestusi (ingl. intervening sequences) e. introneid. Neid geenijärjestusi, mis jäävad mRNA koosseisu ka pärast intronite RNA-st kõrvaldamist e. geeni splaissingut (ingl. gene splicing), nimetatakse ekspresseeruvateks järjestusteks (ingl. expressed sequences) e. eksoniteks (ingl. exons). 2.1. Eukarüootsed katkelised geenid Ehkki intronid on enamikul loomade ja taimede geenidel, pole nad hädavajalikud, sest osas geenides pole introneid. Esmalt näidati introniteta geenide leidumist merisiiliku histoonigeenides ja Drosophila kuumašokigeenides. Praegu on teada aga juba väga palju selliseid geene. 2.1.1. Eksonid ja intronid Intronite olemasolu tõestati esmakordselt imetajate β-globiini geenil. Näidati, et hiire β-globiini geeni mRNA, mis oli tsütoplasmast eraldatud, hübriidus selle geeni DNA-ga vaid nendes piirkondades, kus moodustus RNA-DNA dupleks (kaksikahel). Mit ehübriidunud piirkondades oli aga DNA-ahel nähtav väljaulatuva linguna. RNA-DNA hübriidis mit epaardunud üksikahelalisi linge hakati nimetama R-lingudeks (ingl. R-loops). Seevastu tuumast eraldatud β-globiini geeni pre-mRNA hübriidus β-globiini geeni DNA-ga pea täies ulatuses, ilma R-linge moodustamata. Siit järeldus üheselt, et algsest mRNA-st lõigatakse kindlad segmendid välja ja protsessitud RNA transporditakse seejärel tsütoplasmasse. Intronitega geenid võivad olla väga komplekssed, sisaldades hulgaliselt introneid. Kui β-globiini geenis on vaid kaks intronit (ja kolm eksonit), siis näiteks kannuskonna (Xenopus laevis) vitelliini A2-geenis (määrab muna rebuvalgu) on 33 intronit ja tibude 1α2 kollageeni geenis 50 intronit. Kollageenigeen on 37 000 nukleotiidipaari pikkune, kuid valminud introniteta mRNA on vaid 4600-nukleotiidiline. Senikirjeldatutest on suurimaks geeniks inimese Duchenne’i lihasdüstroof a geen DMD, mille mutantne vorm põhjustab selle raske päriliku haiguse teket. Nimetatud geeni pikkuseks on 2,5 miljonit nukleotiidipaari ning ta sisaldab 78 intronit. Teisalt, osas geenides, mis sisaldavad suhteliselt vähe introneid, võib olla üksikuid väga pikki introneid. Näiteks Drosophila Ultrabithorax’i (Ubx) geen sisaldab intronit, mis on 70 000 nukleotiidipaari pikkune. Intronite bioloogilise tähtsuse kohta pole veel kõik teada. Osa introneid sisaldab regulatoorseid alasid, mis mõjutavad geenide avaldumist. Tähtsaim on aga alternatiivse splaissingu tagajärjel intronite ja eksonite väljalõikamisel saadav geenifragmentide kombinatoorika ja seetõt u erinevate geenivariantide poolt erinevate valkude moodustamine, näiteks immuunvastusena antikehade moodustamine B-lümfotsüütidest. Ilmselt puudub osal intronitel siiski bioloogiline funktsioon. Ka arvatakse, et intronid võivad olla nukleotiidseks varumaterjaliks uute geenide tekkel ja organismide evolutsiooniliseks geneetiliseks reserviks. Transkriptsioon ja RNA protsessing 285 2.1.2. RNA splaissing Valku kodeerivate geenide pre-mRNA splaissing peab toimuma väga täpselt, et mRNA saaks kodeerida funktsionaalset valku. Eksonite ühinemisel moodustub kahe eksoni vahele koodon, mis on vajalik funktsionaalse valgu moodustumiseks (jn. 9.19). Intronite täpne väljalõikamine peab toimuma nukleotiidi täpsusega. Rakutuumas asuvate valke moodustavate geenide intronite otstes asuvad 100%-liselt konserveerunult dinukleotiidid: nimelt GT-nukleotiidid intronist 5´-suunda jääva eksoni kõrval ja AG-nukleotiidid intronist 3´-suunda jääva eksoni kõrval. Introni otstest sissepoole jäävad vähemkonserveerunud alad. Eksoni-introni ühildumise alad on tRNA-geenide ja mitokondrite ning kloroplastide struktuurgeenide puhul siiski erinevad ning seal esinevad seepärast ka teistsugused splaissingumehhanismid. Lisaks esineb üks lühike konserveerunud järjestus, TACTA AC-järjestus, mille kuuendas positsioonis asuv A on 100%-liselt konserveerunud. Pärmseente geenides on kogu TACTAAC-järjestus konserveerunud. TACTAAC-järjestus asub tuumageenides introni 3´-splaissingusaidist 30 nukleotiidi ülesvoolu. Tänapäeval tuntakse RNA transkriptidest kolmesugust intronite väljalõikamise mehhanismi. 1. tRNA eellasmolekulides toimub intronite täpne endonukleaasidega väljalõikamine ning eksoneid sisaldavate RNA-segmentide ühendamiseks toimuvat ligeerimisreaktsiooni katalüüsib spetsiif line splaissingu endonukleaas, vajalik on ka splaissingu ligaasi aktiivsus. 2. Mõnede rRNA eellasmolekulide intronid kõrvaldatakse autokatalüütiliselt, unikaalse keemilise reaktsiooniga (splaissinguga), mida teostavad RNA-molekulid ise (RNA kui ensüüm). 5´ 3´ Ekson 1 DNA Intron A Intron B Ekson 2 Ekson 3 Geen Ekson 1 Ekson 2 Ekson 3 Intron A Intron B Koodon n Koodon n+1 Primaarne transkript RNA protsessing Transkriptsioon Translatsioon mRNA Polüpeptiid Koodon n n+1 Ekson 1 Ekson 2 Ekson 3 n n+1 Joonis 9.19. Intronite vä lja lõikamine primaarsetest transkriptidest RNAsplaissing ul. Splaissing u mehhanism garanteerib intronite nukleotiidilise täpsusega väljalõikamise. Ülesvoolu eksoni koodon ühineb järgneva allavoolu asuva eksoniga nii, et valgulises produktis saavutatakse õigete aminohapete lülitumine polüpeptiidahelasse. 286Transkriptsioon ja RNA protsessing 3. Tuuma pre-mRNA e. heterogeenne tuuma mR NA (hnR NA) (ingl. heterogenous nuclear mRNA, hnRNA) transkriptidest lõigatakse intronid välja kaheetapilise splaissingureaktsiooniga, mida teostab kompleksne riboproteiinne partikkel – splaissosoom. 2.1.2.1. tRNA eellaste splaissing tRNA eellaste splaissingul teeb katked RNA-ahelasse spetsiifiline splaissingu endonukleaas ja RNA segmentide eksonid ühendatakse splaissingu ligaasi abil. tR NA splaissingureaktsioone on põhjalikumalt uuritud pagaripärmil (Saccharomyces cerevisiae). Pärmseente tRNA eellasmolekulidest kõrvaldatakse intronid kaheetapiliselt (jn. 9.20). 1. Etapis I põhjustab tuumamembraaniga seondunud splaissingu endonukleaas (ingl. splicing endonuclease) intronite otstesse kahe katke tekke. 2. Etapis II ühendab splaissingu ligaas (ingl. splicing ligase) tRNA kaks poolt, moodustades valmis tRNA. 3´ 5´ P 3´ OH 3´ OH 5´ P 3´ OH HO 3´ OH 5´ P 5´ P 5´ P P OH OH P Intron tRNA eellane Splaissingu endonukleaas Splaissingu ligaas Introni järjestus Küps tRNA I etapp II etapp Joonis 9.20. tRNA eellasmolekulist introni väljalõikamise kaheastmeline protsess. I etapp. Introni mõlemas lõpus teostatakse splaissingu endonukleaasi toimel katkemised. II etapp. Uuesti moodustunud eksonite lõpud ühendatakse splaissingu ligaasiga. Ligeerimisel toimub splaissingu ligaasi toimel kolm protsessi: splaissingu ligaasil on fosfodiesteraasi, kinaasi ja ligaasi aktiivsus. Need ensüümid tunnevad ära eelkõige tRNA prekursorjärjestuse kõrgema järgu struktuure, mit e aga kindlaid nukleotiidijärjestusi per se. 2.1.2.2. Autokatalüütiline splaissing Osade rRNA prekursorite puhul, eriti alamatel eukarüootidel (nt. Tetrahymena thermophila) ning mitokondrite ja kloroplastide rRNA-s, tRNA-s ja mRNA-s kõrvaldatakse intronid autokatalüütiliselt RNA-molekuli enda poolt. Seda nimetatakse RNA iseeneslikuks splaissinguks e. autokatalüütiliseks aktiivsuseks (ingl. RNA self-splicing or autocatalytic activity). RNA ensümaatilise aktiivsuse avastasid 1982. a. T omas R. Cech Transkriptsioon ja RNA protsessing 287 (snd. 1947) ja kaastöötajad. 1989. a. said T. R. Cech ja Sidney Altman (snd. 1939) nimetatud avastuse eest Nobeli preemia. Autokatalüütilise splaissingu mehhanism on sarnane sellega, mis toimub pre-mRNA puhul splaissosoomide abil, kuid siin pole vaja ei välist energiaallikat ega spetsiif liste valkude aktiivsust. Selle asemel toimub rida fosfodiestersidemete ülekandeid, ilma et neid sidemeid kaotataks või uusi loodaks. Reaktsioonil on kofaktorina vajalikud vaba 3´-OH-ga guanosiinnukleosiidid või -nukleotiidid (GTP, GDP, GMP) ning monovalentne ja divalentne katioon. Absoluutselt vajalik on G(guanosiin)-3´-OH olemasolu. Splaissing on etapiviisiline (jn. 9.21). Kõigepealt toimub fosfodiestersideme ülekanne eksoni-introni ühendusalalt G(guanosiin)-3´-OH-le, mille tõttu selles punktis RNA-ahel ka katkeb. Seejärel katkeb fosfodiesterside järgmise eksoni ja introni 3´-otsa vahel ning vastavate eksonite vahel moodustub fosfodiesterside. Väljalõigatud intron muutub ringjaks molekuliks veel ühe fosfodiestersideme ülekandega. Järelikult ei esine siin mitte mingit trans-katalüütilist aktiivsust (ensüümide toimel), vaid cis-katalüütiline aktiivsus, mis on määratud RNA-molekuli struktuuri endaga. -OH 3´ 5´P5´P5´P- -OH 3´ -OH 3´ OH U-O-P G-OH U-O-P O-PUpA UpA U-O G-PEkson 1 Ekson 1 Ekson 1 Ekson 2 Ekson 2 Ekson 2 Väljalõigatud intron Splaissitud rRNA Intron Intron Introni fragment Rõngasjas intron rRNA eellane Ribosüümne aktiivsus Eksoni splaissing + Joonis 9.21. Autokatalüütilise splaissingu mehhanism Tetrahymena thermophila rR NA eellasmolekulis. Autokatalüütiliseks splaissinguks on vaja vaba guaniinnukleosiidi või -nukleotiidi 3´-OH otsa. Fosfodiestersidemete ülekandega lõigatakse intron välja ja vabanenud intron võib tsirkulariseeruda. 

2 Transkriptsioon ja RNA protsessing 289 fosfodiesterside (jn. 9.22). Protsessis osaleb kogu splaissosoom, kuid enne katke teket on vajalik, et splaissingusaidiga seostuks esmalt U1 snRNP. Introni 5´-katkesaidi äratundmiseks on vajalik aluspaaride paardumine konsensusjärjestuse ja snRNA 5´-terminuse lähedal oleva komplementaarse järjestusega. Teiseks snRNP-ks, mis ühineb splaissingukompleksiga, on U2 snRNP, seostudes A-jääki sisaldava konsensusjärjestusega, nn. harusaidiga. Edasises protsessis osaleb juba kogu splaissosoom. Järgnevalt ühinebki introni 5´-ots harusaidi A-ga, moodustades nn. lariantstruktuuri ning U1 ja U4 vabanevad. Edasi tekib katke introni 3´-splaissingusaidis, millega vabaneb eksoni 2 5´-ots. Protsessi lõpetamisel ühineb 3´-otsa ekson 2 eksoniga 1 (fosfodiestersideme moodustumine). Vabaneb lariantstruktuur koos snRNP-dega U2, U5 ja U6. Süsteemse erütomatoosluupuse (ingl. systemic lupus erythematosus, SLE) patsientidel on autoantikehad, millega saab snRNP-sid hõlpsasti välja sadestada. Nimetatud autoimmuunhaiguse puhul moodustuvad organismis antikehad, mis reageerivad organismis paljudele rakulistele komponentidele, k.a. snRNP valkudele. Neid antikehasid nimetatakse autoantikehadeks (ingl. autoantibodies). Autoantikehad põhjustavad patsientidel pikaajalist kudede närbumist ja organite kärbumist, millega võib kaasneda ka organismi hukkumine südame-, maksa- ja neerufunktsiooni häirete tõttu.

Reparatsioon ja rekombinatsioon

386Reparatsioon ja rekombinatsioon

XIII. REPARATSIOON JA REKOMBINATSIOON

1. DNA REPARATSIOON

1.1. DNA-KAHJUSTUSED

DNA-kahjustusi tekib pidevalt ja hulgaliselt nii rakkude sisekeskkonna (rakusiseste 

protsesside) kui ka väliskeskkonna tegurite toimel. Hinnanguliselt arvatakse toimuvat 

inimese igas rakus päevas kuni 1 miljon DNA-kahjustust, mis üldjuhul kõik ära paran-

datakse. Seda parandusprotsessi nimetatakse reparatsiooniks (ingl. reparation). 

Mitteparandatud DNA-kahjustused võivad põhjustada raku hukkumist. Kahjustuse 

ebatäpsel parandamisel kinnistub kahjustus muutusena, veana e. mutatsioonina (ingl. 

mutation). Seega väljendavad mutatsioonid reparatsiooniprotsessi nõrkust.

1.1.1. DNA-d kahjustavad tegurid

Peamised DNA-d kahjustavad tegurid jaotuvad nelja gruppi:

1) oksüdatiivne stress;

2) kiirgused;

3) kemikaalid ja keskkonnategurid;

4) vead DNA replikatsiooniprotsessis.

Raku ainevahetusahelate vaheproduktidena moodustuvad keemiliselt aktiivsed, kuid 

ebastabiilsed tugevalt reaktiivsed vabad hapniku radikaalid, mis põhjustavad oksü-

datiivset stressi (ingl. oxydative stress). Rakkudes on mehhanismid, mis lagundavad 

või neutraliseerivad selliseid vaheühendeid. Kui seda ei suudeta teha, võivad tekkida 

DNA-kahjustused, mis väljenduvad näiteks DNA lämmastikaluste oksüdeerimisena 

(moodustub 8-oksü-7,8-dihüdroguaniin) või DNA üksikahelaliste katketena.

DNA-d kahjustavad nii ioniseeriv kiirgus (nt. gamma- ja röntgenikiirgus) kui ka 

mit eioniseeriv kiirgus. UV-kiirgus (10–400 nm) on lühema lainepikkusega kui nähtav 

valgus ning pikema lainepikkusega kui röntgenikiirgus. Ta on valdavalt mit eioniseeriv 

elektromagnetiline kiirgus, mille väiksematel lainepikkustel (10–120 nm) esinev ioni-

seeriv toime blokeeritakse õhuhapniku poolt. Ioniseeriv kiirgus, mis põhjustab eelkõige 

DNA kaksikahelalisi katkemisi, toimib pidevalt loodusliku radioaktiivse fooni tõttu, 

mis on maakera eri piirkondades väga erinev. Mitteioniseerivast kiirgusest on olulisim Reparatsioon ja rekombinatsioon

387

juba nimetatud UV-kiirgus, mis põhjustab DNA-ahelas kõrvutiasetsevate pürimidii-

nide vahele ristsidemete moodustumist (sagedamini tümiini dimeeride T-T teke) ja nn. 

6-4-fotoproduktide teket. UV lainepikkus ≈260 nm absorbeerub DNA-ga maksimaal-

selt, omades seega ka maksimaalset mõju. Tuntud on UV-lambid, mida kasutatakse õhus 

olevate mikroobide hävitamiseks (nt. haiglaruumides). 

DNA-kahjustuste tekkel on oluline siiski ka atmosfääri osoonikihti läbiv pikema lai-

nepikkusega UV-kiirgus (põhjustab nt. päikese käes naha punetust), kusjuures kõik üle 

280 nm ja enamuse üle 315 nm lainepikkusega kiirgusest blokeerib tegelikult nimetatud 

osoonikiht. Selge, et osoonikihi puudumine oleks elusorganismidele hävitav. Inimese 

silm UV-kiirguse suuremaid lainepikkusi (violetne osa) otseselt ei erista, küll eristavad 

seda putukad ja linnud. Selle spektriosa UV-kiirgus on inimesele nähtav kaudselt, sest 

ta põhjustab paljude f uorestseeruvate materjalide helendumist, mida inimene näeb näh-

tavas valguses (390–750 nm). Pikalainelised f uorestsents-UV-lambid annavad lillakat 

valgust. Nn. optiline aken võimaldab nähtaval valgusel tungida läbi atmosfääri ning et 

sel puhul murdub sinise valguse lainepikkus rohkem, on keskpäevane taevas sinine. 

Mutageense ja kantserogeense toimega on mitmesugused kemikaalid. Tuntuimad 

olmekemikaalid on sigaretisuitsus ja praepanni kõrbenud rasvas olevad süsivesikud, 

näiteks bensopüreenid. DNA-le mõjuvad ka paljud taimede ja mikroobide poolt moo-

dustatud ühendid, näiteks maapähklite seenhallituse korral moodustuvad alfatoksiinid. 

Kemoteraapias kasutatavad keemilised ühendid on samuti kahjulikud, eriti need, mida 

kasutatakse vähkkasvajate ravil. DNA-aluste hüdrolüüs ja kõrgendatud temperatuur 

põhjustavad DNA nukleotiidipaaride lämmastikaluste eemaldumist teineteisest (kaksik-

ahelate lahtikeerdumist) või nende keemiliste omaduste muutumist.

Kõik DNA polümeraasid teevad töötamisel vigu, mille nad tavaliselt küll ise ära 

parandavad. Erisugustel DNA polümeraasidel on vigade parandamise efektiivsus väga 

erinev. Näiteks Y-perekonna prokarüootide DNA polümeraasid Pol IV ja Pol V on 

võimelised toimima kahjustatud DNA matriitsil ning põhjustama vigade teket. Neid 

polümeraase nimetatakse ka vea-aldisteks DNA polümeraasideks (ingl. error-prone 

polymerases).

1.1.2. DNA-kahjustuste tüübid

Peamisi DNA-kahjustuste tüüpe on neli:

1) lämmastikaluste eemaldamine DNA-st;

2) nukleotiidide desamiinimine ja nukleotiidide valesti paardumine;

3) DNA-ahelate katkemine;

4) kovalentsete keemiliste ristsidemete teke (ahelasiseselt või -vaheliselt).

DNA lämmastikaluste hüdrolüüsil ei toimu DNA-ahelate selgroos (ingl. DNA backbone) 

katkemist (DNA-niidid ei katke, -ahelad lähevad vaid teineteisest lahku). See-eest või-

dakse kõrvaldada DNA kaksikahela üksikute nukleotiidide koosseisust kas puriinalus 

(A või G), kui toimub depuriinimine (ingl. depurination), või pürimidiinalus (T või C), 

kui toimub depürimidiinimine (ingl. depyrimidination). 

Kõiki nelja DNA lämmastikalust võidakse erinevates positsioonides ka kovalentselt 

modif tseerida. Üheks sagedamaks juhuks on aminogrupi kaotamine e. desamiinimine

(ingl. deamination). Tsütosiini (C) desamiinimisel muudetakse ta uratsiiliks (U). DNA 388Reparatsioon ja rekombinatsioon

replikatsioonil võib DNA polümeraas läbi viia mit ekorrektse DNA korrektuuri e. redi-

geerimise (ingl. proof eading), põhjustades sellega DNA-ahelas mit epaarduvate (ingl. 

mismatch) lämmastikaluste paaride teket. Tavajuhuks on tümiini (T) asemel ahelasse 

uratsiili (U) lülitamine, ehkki U on tavaliselt RNA koosseisus.

DNA-ahelate selgroo katkemisi võib et e tulla nii üksikahelates (ingl. single-strand 

break, SSB) kui ka kaksikahelates (ingl. double-strand break, DSB). DNA-ahelate katke-

mise iseloomulikuks põhjuseks on kiirgused, kuid ka mõningad kemikaalid. 

DNA-s võivad moodustuda lämmastikaluste vahele ebaharilikud kovalentsed 

ristsidemeid (ingl. crosslinks). See protsess võib toimuda nii samas DNA-ahelas e. 

ahelasiseselt (ingl. intrastrand) kui ka DNA-ahela ning tema vastasahela vahel (ingl. 

inter strand). Ahelasisestest ristsidemetest on tuntumad pürimidiini dimeeride vahelised 

kovalentsed sidemed ning DNA nukleotiidide ristsidemed valkudega (nt. lämmastikus-

happe, formaldehüüdi jms. kemikaalide toimel). Ahelatevahelisi ristsidemeid põhjustavad 

näiteks alküülivad ühendid ja sinepigaas (kasutatakse kemoteraapias), kus guaniini läm-

mastiku N7-asendis moodustuvad kovalentsed sidemed DNA vastasahelaga.

Meeldejätmiseks

• DNA-d kahjustavateks teguriteks on oksüdatiivne stress, kiirgused, keskkonna keemilised ja füüsikalised 

tegurid ning DNA replikatsiooniprotsessi ebaefektiivsus.

• Põhilised DNA-kahjustuste tüübid on DNA-ahelast lämmastikaluste kõrvaldamine või nende desamiini-

mine, lämmastikaluste valepaardumine, üksik- ja kaksikahelalised katkemised ning ahelasiseste ning 

-vaheliste kovalentsete keemiliste ristsidemete teke.

1.2. REPARATSIOONI TÜÜBID 

Protsesse, mis võimaldavad kõrvaldada DNA-st kahjustusi, nimetatakse DNA paranda-

miseks (ingl. DNA repair) e. reparatsiooniks. Selleks, et hoida mutatsioonide hulk väike, 

on elusorganismidel välja kujunenud rida mitmesuguseid reparatsioonimehhanisme, 

mille funktsiooniks on DNA defektide parandamine ja organismide geneetilise infor-

matsiooni muutumatul kujul säilitamine ning selle edasikandumine läbi sugurakkude 

järgnevatele põlvkondadele. DNA reparatsioonirajad on erisuguste DNA-kahjustuste 

tüüpide puhul erinevad. Siiski esineb ka mõningane kattuvus, olukord, kus erinevad DNA parandusprotsessid kulgevad samal ajal. 

DNA reparatsioon jaotub kaheks alaosaks, sõltuvalt sellest, kas DNA-ahelad on kat-

kenud või mit e: 

1) kahjustatud või valede lämmastikaluste reparatsioon;

2) DNA-ahelate katkemiskohtade reparatsioon.

DNA reparatsioonimehhanismid jaotuvad kolmeks põhitüübiks:

1. Otsesed keemilised pöördreaktsioonid (ingl. direct chemical reversal), kus muu-

tuste tekke kohal toimub konkreetsete spetsiif liste kahjustuste kõrvaldamine ja 

algse oleku taastumine (nt. T-T-dimeeride kõrvaldamine).

Reparatsioon ja rekombinatsioon

389

2. Kahjustuse kõrvaldamine väljalõikega e. ekstsisioonreparatsiooniga (ingl. 

excision repair) tähendab DNA parandamist, kus kahjustatud lämmastikalused 

kõrvaldatakse esmalt väljalõikega ning väljalõigatud osa asendatakse järgnevalt 

õigega lokaalsel DNA sünteesil. Väljalõikega reparatsioonimehhanisme on kolm:

2.1. lämmastikaluste väljalõige e. BER (ingl. base excision repair, BER) repa-

ratsioon;

2.2. nukleotiidide väljalõige e. NER (ingl. nucleotide excision repair, NER) 

reparatsioon;

2.3. valepaardumise reparatsioon e. MMR (ingl. mismatch repair, MMR).

3. Rekombinatsioonisõltuv reparatsioon (ingl. recombination-dependent repair), 

mis toimub tegelikult kahe erisuguse mehhanismi alusel:

3.1. homoloogne rekombinatsioon e. HR (ingl. homologous recombination);

3.2. mit ehomoloogne DNA otste ühendamine e. NHEJ (ingl. non-homolo-

gous end joining).

Väljalõikereparatsiooni e. ekstsisioonreparatsiooni mehhanismid on evolutsiooniliselt 

konserveerunud, olles põhimõt eliselt samased bakteritest imetajateni. Väljalõikerepa-

ratsioonil toimub DNA-kahjustuse kõrvaldamine kolmes etapis.

1. DNA reparatsiooniline endonukleaas või endonukleaasi sisaldav ensüümikomp-

leks tunneb kahjustatud N-aluse(d) või nukleotiidi(d) ära, seondub nendega ja 

lõikab nad DNA-st välja.

2. Moodustunud tühikusse sünteesitakse DNA polümeraasi abil normaalsed 

N-alused või nukleotiidid, kasutades matriitsina komplementaarset DNA-ahe-

lat.

3. DNA ligaas ühendab uuestisünteesitud DNA-lõigu intaktseks kõrvaloleva DNA-

ahela otsaga. 

Reparatsioonisüsteemid on üldiselt väga täpsed. Täpsus nõuab aga vahendeid (energia-

kulu). Kui rakk on väga tugevalt kahjustatud, siis peab ta võitlema vaid selle eest, et ellu 

jääda ning vigade täpne parandamine ei ole enam kõige olulisem. Kõigest hoolimata peab 

toimuma aga geneetilise materjali paljundamine tütarrakkude vahel. Niisuguses situat-

sioonis käivitub bakterites hädaabivastus e. SOS-vastus (ingl. SOS responce), millega 

kaasneb vigaderohke DNA süntees kahjustatud DNA-lt. Seda teostavad prokarüootidel 

veaaltid (ingl. error-prone) DNA polümeraasid Pol IV ja Pol V.

Kui reparatsioonis osalevad mõningad reparatsioonigeenid on defektsed, siis DNA-

kahjustusi ei parandata ning sellega kaasneb mutatsioonitaseme oluline tõus. Inimesel on 

teada kümneid reparatsiooni puudulikkusega seotud pärilikke haiguseid, mida põhjusta-

vad päritavad reparatsioonivead. Tuntuimaks näiteks on xeroderma pigmentosum, kus 

inimesel ei parandata UV-kiirgusest tekkinud kahjustusi, mistõt u neil inimestel areneb 

tavaliselt juba lapseeas välja nahakasvaja.

1.2.1. Reparatsioon keemiliste pöördreaktsioonidega

Vea tekke kohal toimuv kahjustuste parandamine otseste keemiliste pöördreaktsiooni-

dega toimub vaid spetsiif liselt ja kindlate kahjustuste eemaldamisel. Selliseks juhuks on 

näiteks tümiini (T-T) dimeeride või teiste 6-4-fotoproduktide parandamine spetsiif liste

390Reparatsioon ja rekombinatsioon

ensüümide kaasabil. Niisugust reparatsiooniprotsessi nimetatakse DNA valgustund-

likuks reparatsiooniks (ingl. light-dependent repair) e. fotoreaktivatsiooniks (ingl. 

photoreactivation), sest see toimub valguse poolt aktiveeritava ensüümi DNA-fotolüaasi

(ingl. DNA photolyase) toimel. UV-kiirguse mõjul moodustunud pürimidiindimeerid

tunneb ära fotolüaas, mis on kodeeritud phr-geenide poolt. Ensüüm aktiveerub vaid 

sinise lainepikkusega valguse (440–490 nm) toimel. Aktiveeritud ensüüm kõrvaldab 

tümiini dimeeride, tsütosiini dimeeride ja tsütosiini-tümiini dimeeride vahelised kova-

lentsed sidemed ning taastab kiirguseelse olukorra (jn. 13.1). Kui me aga soovimegi 

saada UV-kiirguse toimel mutatsioone, siis tuleb rakke pärast kiiritamist hoida vähemalt 

mõne põlvkonna vältel pimedas, et kahjustusi ei repareeritaks ning vead kinnistuksid, s.t. 

tekiksid mutatsioonid. Fotolüaasi on leitud bakterites, pärmides, äädikakärbses, kannus-

konnas, kuid mit e imetajates.

Fotodimeer

Tümiin Tümiin UV-

kiirgus

Fotolüaas +

sinine valgus

T T

A A

T=T

A A

T=T

A A

T T

A A

T T

A A

UV 

Tümiini dimeer

Fotolüaas seondub

Sinine valgus

Ristsideme katke

Ensüümi vabanemine

A B

3´

5´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

Fotolüaas

Joonis 13.1. Fotoreaktivatsioon (DNA valgustundlik reparatsioon): tümiini dimeeride vaheliste ristsidemete 

katkemine valgus-aktiveeritud fotolüaasiga. A – fotoreaktivatsiooni toimumine DNA-ahelas. B – fotodimee-

ride teke ja lagunemine.

Üheks kõige sagedamaks punktmutatsioonide tekke põhjuseks on alküülimine (ingl. 

alkylating), näiteks metüülgrupi (-CH3

) spontaanne lisandumine tsütosiinile (C) koos 

järgneva desamiinimise ja tümiini (T) moodustumisega. Õnneks kõrvaldatakse enamik 

selliseid muutuseid monofunktsionaalsete DNA glükosülaaside (ingl. monofunctional Reparatsioon ja rekombinatsioon

391

DNA glycosylases) abil. Nendel ensüümidel on ainult glükosülaasne aktiivsus ja nad kõr-

valdavad mit epaardunud T ning taastavad algse C. Protsessis ei põhjustata DNA selgroos 

katkete teket. 

Otsese keemilise pöördreaktsiooniga on võimalik parandada ka vigu guaniin aluste 

metüülimises. Metüülguaniini parandab metüülguaniini metüültransferaas (ingl. 

methylguanine methyltransferase) (MGMT-geeni produkt), mis peale reaktsiooni toi-

mumist inaktiveerub. Seepärast vajab iga metüülgrupi kõrvaldamise reaktsioon üht 

ensüümimolekuli. O6

-metüülguaniin (ingl. O6

-methylguanine) on teatavasti geneetili-

selt väga ohtlik lämmastikaluse modif katsioon, sest see modif tseeritud nukleotiid võib 

edukalt paarduda nii C- kui ka T-nukleotiididega, kuid DNA replikatsiooni käigus lülitab 

DNA polümeraas vastasahelasse üksnes T-nukleotiidi, millega põhjustatakse mutatsiooni 

teke.

1.2.2. Lämmastikaluste väljalõikereparatsioon

Lämmastikaluste väljalõikereparatsiooni (BER – ingl. base excision repair) käigus 

eemaldatakse DNA-ahelast üksik kahjustatud nukleotiid ning asendatakse õigega. Arva-

takse, et igas meie keharakus toimub sellist tüüpi reparatsioone ühes päevas ca 20 000 

korda. BER-i alustavateks ensüümideks on erinevate geenide poolt määratud DNA 

glükosülaasid (ingl. DNA glycosylases), mis leiavad DNA-s esinevad valed N-alused 

(oksüdeeritud, alküülitud, hüdroksüülitud või desamiinitud) ning osalevad nende välja-

vahetamisel. 

DNA glükosülaas katkestab vale N-aluse ja 2-desoksüriboosi vahelise glükosiidsi-

deme, põhjustades apuriinse või apürimidiinse saidi e. AP-saidi (ingl. AP sites) tekke 

ning N-aluse vabanemise. DNA-ahela suhkur-fosfaat-selgroog jääb selles etapis intakt-

seks. Glükosülaase on kahte tüüpi. Enamik glükosülaase on monofunktsionaalsed ja neil 

on vaid glükosülaasne aktiivsus. Bifunktsionaalsetel komplekssetel glükosülaasidel on 

lisaks veel 3´ - 5´-eksonukleaasne AP-lüaasi (ingl. AP lyase) aktiivsus. Sõltumata sellest, 

kas DNA glükosülaasil on või pole lüaasset aktiivsust, katalüüsib N-aluste väljalõike-

reparatsiooni järgmist etappi ensüüm AP-endonukleaas (ingl. AP endonuclease), mis 

põhjustab AP-saidi 5´-otsas DNA selgroos DNA üksikahelalise katke ning vaba 3´-OH-

otsa tekke. Üllatavalt on AP-endonukleaasil lisaks ka 3´- 5´-eksonukleaasne aktiivsus. 

Edasi sünteesitakse 3`-OH-otsast lähtuvalt DNA polümeraasi abil DNA AP-sait täis ning 

ahel muudetakse DNA ligaasi toimel intaktseks. Vaatleme kahte näidet.

Tsütosiini desamiinimisel tekib uratsiil. Valestipaardunud nukleotiidile (U) seon-

dub DNA glükosülaas ja lõikab U välja, põhjustades AP-saidi tekke (jn. 13.2). Uratsiili 

DNA glükosülaas on väga spetsiif line, kõrvaldades ahelast vaid uratsiili ning tal pole 

AP-endonukleaasset aktiivsust. AP-saidi tunneb ära teine ensüüm, AP-endonukleaas, mis 

toimib koos fosfodiesteraasiga (ingl. phosphodiesterase), et kõrvaldada saidist suhkur-fos-

faatgrupid, ning mille tulemusel DNA kaksikahelas üks ahel katkeb. Järgnevalt lisab DNA 

polümeraas puuduvad nukleotiidid juba komplementaarses ahelas sisalduva info põhjal. 

Lõpuks seob DNA ligaas DNA-ahela otsad kokku. 

Guaniini oksüdeerimisel moodustub 8-hüdroksüguaniin (GO) (ingl. 8-hydroxy 

guanine). Selliseid kahjustusi tekib ka normaalses raku ainevahetusprotsesside käi-

gus, sest kahjustusi põhjustavaid vabu hapnikuradikaale tekib elektroni transpordil, 

peroksüdatsiooniprotsessides jms. Niisuguste kahjustuste kõrvaldamist nimetatakse Reparatsioon ja rekombinatsioon

393

GO-reparatsiooniks (ingl. GO repair). Põhiliselt vastutavad E. coli rakkudes GO-repa-

ratsiooni eest kolm valku (MutM, MutT, MutY). MutT on ennetava funktsiooniga, sest ta 

lagundab rakkudes GO-d. MutM ja MutY on glükosülaasid. MutM kõrvaldab DNA-ahe-

last GO, mutY kõrvaldab aga valesti paardunud A paarist A:G või A:GO. 

1.2.3. Nukleotiidide väljalõikereparatsioon

Nukleotiidide väljalõikereparatsioon e. ekstsisioonreparatsioon (NER) erineb läm-

mastikaluste väljalõikereparatsioonist (BER) rea omaduste poolest.

1. Kasutatakse erinevaid ensüüme.

2. Isegi üksiku vale N-aluse väljalõikeks haaratakse NER-i puhul DNA-kahjustu-

sest mõlemalt poolt (kahele poole samas ahelas lähtuvalt kahjustusest) kaasa rida 

nukleotiide.

3. Kahjustatud DNA-ahelasse tekitatakse NER-i puhul kahjustatud ala lokaliseeri-

miseks katked kahjustusest nii 3´- kui ka 5´-suunas.

Bakterite ja eukarüootide NER-mehhanismid on sarnased, kuid eukarüootidel osaleb 

protsessis palju rohkem erinevaid valke.

E. coli DNA nukleotiidide ekstsisioonreparatsioon teostatakse UvrABC endonuk-

leaasse ensüümkompleksi toimel, mis koosneb tegelikult neljast Uvr-valgust: UvrA, 

UvrB, UbrC ja DNA helikaas II (e. UvrD). NER toimib näiteks tümiini dimeeride kõr-

valdamisel (jn. 13.3). Esmalt skaneerib UvrA-UvrB-kompleks DNA-l vigu ning kui UvrA 

tunneb ära DNA-heeliksis näiteks tümiini dimeeri, siis UvrA vabaneb ning UvrB sulatab 

lahti DNA-ahelatevahelised H-sidemed. Edasi ühineb UvrC-valk UvrB-DNA-komp-

leksiga ning moodustunud kompleksis põhjustab endonukleaas UvrC katkete tekke 8 

nukleotiidi kaugusel kahjustuse 5´-otsast ja 4 nukleotiidi kaugusel kahjustuse 3´-otsast. 

Tekitatakse 12-nukleotiidiline üksikahelaline ala e. 12-mer (ingl. 12 mer), mis kõrval-

datakse DNA-st DNA helikaasi II toimel. Järgnevalt sünteesib DNA polümeraas Pol I 

tühiku täis (kasutades matriitsina komplementaarset ahelat) ja DNA ligaas ühendab 

DNA-ahelad.

Eukarüootidel jaotatakse NER kahte klassi.

1. Transkriptsiooniseoseline reparatsioon e. TCR (ingl. transcription-coupled 

repair), mis aktiveerub siis, kui RNA polümeraas jääb transkribeeritaval DNA-

ahelal seisma.

2. Globaalne genoomne reparatsioon e. GGR (ingl. global genome repair), mis 

toimub transkriptsioonist sõltumatult ning parandab vigu ka transkribeeritava 

geeni mit ekodeerivas DNA-ahelas.

TCR-i ja GGR-i erinevus seisneb eelkõige selles, kuidas avastatakse erinevate valgukomp-

leksidega DNA vigastusi. Pärast vigastuse avastamist, järgmises etapis, on nii TCG kui 

ka GGR-i puhul vaja kohale tuua eukarüootne transkriptsioonifaktor TRIIH. TFIIH on 

10 alaüksusest koosnev valgukompleks, kus asub ka DNA helikaas, mille toimel avatakse 

DNA vigastatud piirkonnas DNA-ahelad. Inimesel on kõrvaldatav ala 24–32 bp pikkune 

ja tühik täidetakse DNA polümeraasi (kas δ või ε) poolt ning DNA ligaas ühendab lõpuks 

DNA-ahelad.

392Reparatsioon ja rekombinatsioon

C

G

AP sait

Tsütosiini desamiinimine

Uratsiili seondamine

DNA glükosülaasiga

Uratsiili väljalõikamine

3´

5´

5´

3´

U

G

3´

5´

5´

3´

U

G

3´

5´

5´

3´

Glükosülaas

G

3´

5´

5´

3´

G

3´

5´

5´

3´ Suhkurfosfaatgrupi 

kõrvaldamine AP-endonukleaasi 

ja fosfodiesteraasiga

Puuduv nukleotiid

3´

5´

Üksikahelaline katke

DNA polümeraas

C

G

DNA ligaas

C

G

3´

5´

5´

3´

Repareeritud sait

5´

3´

Joonis 13.2. DNA ekstsisioonreparatsioon: N-aluste kõrvaldamise ahel.

394Reparatsioon ja rekombinatsioon

12-mer

DNA polümeraas I sünteesib 

tühiku täis, kasutades 

matriitsina komplementaarset 

DNA-ahelat, ning DNA ligaas 

ühendab üksikkatked.

Tümiini dimeer

3´

5´

5´

3´

Valguline trimeer (2 koopiat 

UvrA- ja 1 koopia UvrB-valku) 

tunnevad ära ja seonduvad 

kahjustatud DNA-ga

Asendatud 12 nukleotiidi

ATP

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´ B

3´

5´

5´

3´

B

B

B

A A

C

3´

5´

5´

3´

POL I

3´

5´

5´

3´

3´-katke 5´-katke

B

A A

ADP + Pi

C

+

A A

C

ATP

ADP + Pi

ATP energiaga painutatakse

DNA-d ja muudetakse UvrB-

valgu konformatsiooni ning

UvrA dimeer vabaneb

UvrC-valk seondub 

UvrB-DNA-ga ja põhjustab 

3´- ja 5´-katkete teket

ATP energia abil vabastab 

UvrD helikaas

väljalõigatava oligomeeri 

(12-mer) ning vabastab 

ka UvrC-valgu

Ekstsinukleaasne aktiivsus

DNA polümeraas I 

asendab UvrB-valgu

B

Joonis 13.3. DNA ekstsisioonreparatsioon: nukleotiidide väljalõikamine. Ekstsinukleaasse aktiivsuse avaldumiseks (E. coli´ l 12 nukleotiidi väljalõikamine) on vaja kolme 

geeni (uvrA, uvrB, uvrC) produkte. Funktsionaalse DNA moodustumiseks on vajalikud veel DNA polümeraas Pol I ja DNA ligaas.

Reparatsioon ja rekombinatsioon

395

1.2.4. Valepaardumisega reparatsioon

DNA polümeraasil on korrektsiooniline e. redigeerimisaktiivsus (ingl. proof eading 

activity), mis tähendab, et tema koosseisus olev 3´→5´-eksonukleaasne aktiivsus kõrvaldab 

kasvava ahela 3´-otsast valesti paardunud nukleotiidid. Sellele replikatiivsele korrek-

tuurile sekundeerib teine, replikatsioonijärgse DNA reparatsiooni toimemehhanism, 

mida nimetatakse valepaardumise reparatsiooniks (MMR). Nii parandatakse paar-

dumisvead, mis jäid DNA-sse pärast replikatsiooni. Replikatsiooni käigus võib tekkida 

mikroinsertsioone või -deletsioone, mille tagajärjel on uues ahelas mõni nukleotiid üle või 

puudu. Eriti lihtsalt tekivad sellised vead 1–2-nukleotiidilisi korduseid sisaldavate DNA 

piirkondade replikatsioonil. Lisaks võidakse DNA sünteesi vigade tõt u lülitada DNA-sse 

mit ekomplementaarseid nukleotiide. Näiteks lülitatakse nukleotiidi T vastu vastasahelas 

nukleotiid G. Kuna normaalsele DNA-le on iseloomulikud ka valepaardumisi põhjusta-

vad nukleotiidid, peab olema spetsiif line reparatsioonisüsteem, mis suudaks eristada 

uut DNA-ahelat vanast matriitsahelast. E. coli bakterites on see võimalik tänu sellele, et 

vana DNA-ahel on metüülitud, uus aga veel mit e. E. coli´s metüülitakse A kindla inter-

valliga pärast replikatsiooni järjestuses GATC Dam-metülaasi (ingl. Dam methylase) 

poolt. Valepaardumise reparatsioonisüsteem kasutab ära seda, et hemimetüülitud (ingl. 

hemimethylated) olekus (vana DNA-ahel on metüülitud, uus aga veel mit e) kõrvaldatakse 

mit emetüülitud ahela valestipaardunud nukleotiid(id) koos külgnevate nukleotiididega 

ja nende asemele sünteesitakse uus DNA-lõik, kasutades matriitsina metüülitud ahela 

nukleotiidset järjestust. 

E. coli´s on valepaardumisega reparatsioonil (MMR) vajalikud nelja geeni, mutH, 

mutL, mutS ja mutU (=uvrD) produktid. Mit epaardunud alaga metüülitud DNA-ahelaga 

ühineb otseselt MutS, seejärel ühineb moodustunud kompleksiga MutL. MutS ja MutL 

aktiveerivad GATC-spetsiif lise endonukleaasi MutH (ingl. GATC-specif c endunucle-

ase), mis teeb mit emetüülitud DNA-ahelasse katke valepaardumisest kas 3´- või 5´-suunas 

(jn. 13.4). Sõltuvalt GATC-järjestuse kaugusest mit epaardunud nukleotiidide suhtes võib 

katke toimuda valepaardumisest isegi rohkem kui 1000 nukleotiidi kaugusel. Kui sisselõige 

tehti GATC-järjestusest paardumisvea suhtes 5´-suunaliselt, kõrvaldatakse nukleotiidid 

DNA-ahelast 5´→3´ eksonukleaasi, näiteks eksonukleaas VII abil. Kui sisselõige toimus 

aga paardumisveast 3´-suunas, siis vajatakse 3´→5´ eksonukleaasset aktiivsust, näiteks E. coli

eksonukleaasi I. Nukleotiidide kõrvaldamisel uuest, mit emetüülitud DNA-ahelast osaleb 

ka DNA helikaas II (UvrD). Seejärel sünteesitakse üle 1000-nukleotiidine tühik täis DNA 

polümeraas III poolt ning DNA-ahela otsad liidetakse DNA ligaasi toimel. 

Bakterite M MR-geenide homolooge on k irjeldatud ka seentel, loomadel ja 

imetajatel. See näitab, et valepaardumisega reparatsioon on kõrgkonserveerunud 

universaalne mehhanism kontrollimaks geneetilise informatsiooni säilimist kaksikahe-

lalises DNA-s. Inimesel soodustab MMR subtüüpide defektsus päriliku mit epolüüpse 

käärsoole-pärasoolevähi e. HNPCC (ingl. hereditary nonpolyposis colorectal cancer), soole- 

(nt. Muir-Torre sündroom), nahavähi ja ka teiste vähivormide teket.

1.2.5. Rekombinatsiooniline reparatsioon

Lisaks eespoolkirjeldatud DNA reparatsioonisüsteemidele võib kahjustuste kõrvaldamine 

toimuda ka rekombinatsioonisõltuva reparatsiooni (ingl. recombination-dependent repair) 

abil. DNA üksikahelaliste ja kaksikahelaliste katkete parandamine toimub kahel viisil.

396Reparatsioon ja rekombinatsioon

MutS

CH3

3´

5´

5´

3´

GATC GATC

CH3 Vanemahel

Tütarahel

A-metüülgrupid GATC-saidis eristavad 

DNA vanemahelat tütarahelast

Valepaardunud

nukleotiid

CH3

3´

5´

5´

3´

GATC GATC

CH3

CH3

3´

5´

5´

3´

GATC GATC

CH3

MutH

MutL

MutL-

MutS MutH- MutL

MutS MutH

ATP ADP + Pi

CH3

3´

5´

5´

3´

GATC GATC

CH3

CH3

3´

5´

5´

3´

GATC GATC

CH3 CH3

3´

5´

5´

3´

GATC GATC

CH3

Asendatud 

nukleotiidid

MutSHL reparatsioonisüsteem

tunneb ära valepaardunud

nukleotiidi ja seondub sellele

MutH liigub mööda DNA-d 

kuni vanemahela metüülitud 

N-aluseni, seondub DNA-le 

ning MutL seondub MutS ja 

MutH-ga

MutH teeb katke mitte-

metüülitud ahelasse

Helikaas II + üksikahelaline

eksonukleaas kõrvaldavad

DNA-segmendi DNA polümeraas I täidab tühiku õigete nukleotiididega 

ja DNA ligaas ühendab 

ahelad

Tütarahel metüülitakse

CH3

Joonis 13.4. Valepaardumisega reparatsioon E. coli`s. MutSHL reparatsioonisüsteem (MutS, MutH, MutL) tunneb ära DNA metülatsioonikohad. MutH sisaldab spetsiif list 

GATC-endonukleaasset aktiivsust (ahelasse tehakse katke). DNA helikaas II on MutU valk.

Reparatsioon ja rekombinatsioon

397

1. Homoloogne rekombinatsioon e. HR (ingl. homologous recombination), mille 

puhul kaksikahelaline katkekoht taastatakse täielikult homoloogse kromosoomi, 

tütarkromatiidi või mingi teise homoloogse DNA kaasabil ilma mutatsioonideta. 

2. Mit ehomoloogsete DNA-otste ühendamine e. NHEJ (ingl. non-homologous 

end joining). Selle korral liidab DNA ligaas katkenud ahelad, kuid isegi lühikeste 

üksikahelaliste homoloogiate esinemisel põhjustatakse siin mutatsioonide teke 

(eriti lühikesed deletsioonid). Raku seisukohalt on see siiski parem variant kui 

jät a DNA otsad üldse ühendamata. 

HR on iseloomulik prokarüootidele, kuid toimub ka eukarüootide rakutsükli S- ja G2

-faa-

sides. Kui E. coli DNA polümeraas III jõuab DNA replikatsioonil matriitsahelas asuva 

kahjustuseni, näiteks tümidiini dimeerini (ingl. thymine dimer), siis võib DNA süntees 

sellest kohast katkeda ja jätkuda kaugemalt. Kui DNA-s viga ei parandata, tekib järgmise 

DNA replikatsiooni tulemusena selles kohas juba DNA kaksikahelaline katke, DSB

(ingl. double strand break, DSB). DSB-d parandatakse homoloogse rekombinatsiooni teel, 

kus osalevad RecA-valk ning RecBCD-kompleks. RecA-valk aktiveerub kokkupuutes 

üksikahelalise DNA-ga, ssDNA (ingl. single strand DNA, ssDNA) ning viib üksteisega 

kontakti homoloogsed DNA-ahelad, mis asuvad erinevates DNA-molekulides, nii et 

Tümiini dimeer

RecA-valk

Endonukleaasne katke

T=T 

5´

3´

3´

5´

T=T 

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´ 3´

3´ 5´

T=T 

3´ 5´

5´ 3´

5´ 3´

3´ 5´

T=T 

3´ 5´

5´ 3´

5´ 3´

3´ 5´

T=T 

3´ 5´

5´ 3´

Endonukleaasne katke

DNA polümeraas

DNA ligaas

DNA replikatsioon

Joonis 13.5. RecA-sõltuv rekombinatsiooniline reparatsioon prokarüootidel (üksikahelalised katkemised). 

RecA-valk aktiveerub üksikahelalise DNA (ssDNA) toimel DNA üksik- või kaksikahelalise katkemise 

korral. RecA katalüüsib DNA-ahelate vahetust homoloogsete DNA piirkondade vahel. Tümiini dimeeri ei 

kõrvaldata, kuid saavutatakse ülejäänud DNA täpne replikatsioon.

398Reparatsioon ja rekombinatsioon

kahjustamata ahel ühest DNA-molekulist oleks DNA sünteesil matriitsiks katket sisalda-

vale ahelale teisest DNA-molekulist (jn. 13.5). Selleks, et katketega DNA-molekuli ahelad 

eralduksid teineteisest ning saaksid paarduda teise, intaktse DNA-molekuli homoloog-

sete ahelatega, on vajalik RecBCD-kompleksi aktiivsus. RecBCD-kompleksil on lisaks 

nukleaassele aktiivsusele ka helikaasne aktiivsus, mis võimaldab üksikahelalise ala teket 

ning mis on vajalik DNA-dupleksi moodustumiseks homoloogse alaga teises DNA-

molekulis. Rekombinatsiooni käigus toimub homoloogselt DNA matriitsilt DNA süntees 

DNA polümeraasi (enamasti DNA Pol III) vahendusel. 

DNA üksikahelaliste katkete (ingl. single strand break, SSB) puhul katalüüsib 

homoloogseks rekombinatsiooniks vajalikku üksikahelate teket RecFOR-kompleks. 

Eukarüootidel on RecA-valgu homoloogiks Rad51, mis vahendab ühe tütarkromatiidi 

kaksikahelalise katkenud DNA-ahela paardumist teises kromatiidis paikneva terve homo-

loogse ahelaga (jn. 13.6). Järgneb DNA süntees, kus matriitsina kasutatakse tervet ahelat. 

Homoloogsest rekombinatsioonist tuleb detailsemalt jut u käesoleva peatüki alaosas 2.

NHEJ toimib sagedamini eukarüootide rakutsükli G2

-faasis. NHEJ toimumiseks on 

vajalik, et katkenud DNA otsad oleksid teineteise lähedal. Katkenud DNA otsi tunneb 

ära kahest valgust moodustunud kompleks Ku, mis koosneb alaüksustest Ku70 ja Ku80. 

Järgmisena seondub DNA otstega DNA-sõltuv proteiinkinaas e. DNA-PK (ingl. DNA 

dependent protein kinase). DNA-PK seondub ka nukleaasiga, mis on vajalik DNA otstest 

mõnede nukleotiidide eemaldamiseks ning DNA otstes lokaalse homoloogia leidmiseks, 

näiteks DNA lühikeste kordusjärjestuste puhul. DNA-PK-Ku-kompleksiga ühineb DNA 

ligaas IV, mis ühendab DNA vabad otsad. Kordusjärjestuste olemasolu ongi peamiseks 

põhjuseks, miks rakud parandavad kaksikahelalisi DNA katkeid NHEJ abil, riskides 

seejuures geneetilise informatsiooni muutumisega. DNA kaksikahelate ühendamine 

on ülimalt tähtis ka antikehade varieeruvate piirkondade reassambleerimisel ja V(D)

J-ühendpiirkondade tekkel. On näidatud, et Ku80 nokauditud hiired pole võimelised 

parandama kaksikahelalist DNA katket. 

1.2.6. SOS-vastus ja vea-aldis DNA süntees kahjustatud DNA-lt 

Bakteritel käivitub DNA-kahjustuste korral, mida põhjustavad näiteks UV-kiirgus ja 

mitmed mutageensed kemikaalid, SOS-vastus (ingl. SOS response). SOS-vastust on 

põhjalikult uuritud bakteris E. coli. E. coli’s indutseeritakse SOS-vastuse korral mitmed 

DNA reparatsioonivalgud, mis osalevad kas NER-is või homoloogsel rekombinatsioonil, 

ning DNA polümeraasid, mis on võimelised jätkama DNA sünteesi kahjustatud DNA-lt 

olukorras, kus replikatiivne DNA polümeraas Pol III on DNA-kahjustuse kohal peatu-

nud. Selline kahjustatud DNA-lt toimuv süntees (ingl. translesion DNA synthesis, TLS) 

võib olla vearohke, kui seda viivad läbi Y-perekonna DNA polümeraasid Pol IV (DinB) 

või Pol V (UmuD’C), sest neil puudub vigu korrigeeriv (ingl. proof-reading) aktiivsus 

(jn. 13.7). Kui DNA polümeraas V põhjustab valdavalt asendusmutatsioonide teket, siis 

DNA polümeraas IV-le on iseloomulikud raaminihkemutatsioonid (ühenukleotiidilised 

deletsioonid ja insertsioonid). 

SOS-vastus aktiveeritakse kahe regulaatorvalgu, LexA ja RecA koostoimel (jn. 13.7). 

Tavaolukorras on nende ensüümide tase rakus madal. Sel juhul on transkriptsiooni 

negatiivne regulaatorvalk LexA-repressor seondunud DNA lex-geenide operaator-

piirkondadesse, pidurdades geenide uvrA, umuCD ja lexA transkriptsiooni.  Esimesed Reparatsioon ja rekombinatsioon

401

kaks geeni määravad vastavalt UvrA- ja UmuCD-valkude sünteesi, mis osalevad vea-

altil DNA reparatsioonil. Kolmanda geeni produktiks on Lex A-valk. SOS-vastuse 

käigus indutseeritavate valkude tase on rakus DNA-kahjustuste puudumisel madal. 

Rakkude eksponeerimisel ultraviolettkiirgusele või mõnele muule DNA-d kahjusta-

vale tegurile tekivad DNA-ahelates kahjustused, mis pärsivad DNA replikatsiooni ja 

põhjustavad üksikahelaliste DNA (ssDNA) piirkondade teket. ssDNA-ga seondub 

RecA-valk, moodustades RecA-ssDNA nukleoproteiinse filamendi. RecA-valgu 

interaktsioon ssDNA-ga aktiveerib RecA-valgu. Aktiveeritud RecA-valk stimuleerib 

LexA-repressorvalgu autoproteolüüsi e. iseenda katkilõikamist (degradatsiooni). Kui 

LexA inaktiveerub, siis suureneb transkriptsioonitase neilt geenidelt, mis olid varem 

LexA poolt pärsitud. 

LexA-repressor seondub erinevate SOS-vastuse käigus aktiveeritavate geenide pro-

mootoraladele erisuguse af insusega. Geenidelt, mille regulatoorsetele aladele seondub 

LexA nõrgema af insusega, suureneb transkriptsioon varem kui geenidelt, mille puhul 

LexA afiinsus on kõrgem. Esmajärjekorras tõuseb transkriptsioonitase DNA reparat-

sioonivalke kodeerivatel geenidel, k.a. recA-geenil ning alles hiljem DNA polümeraasi 

V geenidel umuC ja umuD. Lisaks transkriptsioonitasemele kontrollitakse Pol V eks-

pressiooni ka valgu aktiivsuse kaudu. Pol V aktiveerimiseks on vajalik UmuD subühiku 

proteolüüs. Pol V aktiveerimine toimub hilinemisega seetõt u, et selle DNA polümeraasi 

poolt läbiviidav DNA süntees suurendab rakkudes oluliselt mutatsioonisagedust, mis võib 

viia kahjulike mutatsioonide kuhjumisele. Pol V aktiveeritakse alles siis, kui muud või-

malused DNA-kahjustustega toimetulekuks ei ole osutunud piisavaks. Pol V-st sõltuvat 

mutageneesi on varem nimetatud ka SOS-mutageneesiks või UV-mutageneesiks.

1.2.7. Pärilikud reparatsioonivead

Päikesevalguse suhtes ülitundlikel e. xeroderma pigmentosum’iga (XP) patsienti-

del areneb kergesti nahavähk, sest nukleotiidi väljalõikereparatsiooni NER defektsuse 

tõttu ei parandata UV-kiirguse poolt põhjustatud DNA-kahjustusi. XP areneb välja, kui mutatsioonid esinevad NER- geenides XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XPF, XPG jt. Need 

geenid vastutavad kahjustatud nukleotiidide, näiteks tümiini dimeeride väljalõikamise 

eest. Eukarüootses NER-is osalevate valkude hulk on võrreldes bakterite NER-iga tundu-

valt suurem – eukarüootidel on NER-iga seotud 15 valku. Lisaks XP-le on NER-i geenide 

defektidega seotud veel vähemalt kaks inimese pärilikku haigust, Cockayne’i sündroom

ja trihhotiodüstroof a, kuid neil juhtudel pole tegemist nahavähi tekkega, vaid neuroloo-

giliste nähtustega, vaimse alaarenguga (jn. 13.8). 

Inimesel on peale nimetatud kolme haiguse veel mitmeid päranduvaid DNA-st 

sõltuva ainevahetuse defektidega seonduvaid pärilikke haigusi. Nimetame siin atak-

sia-telangiektaasiat e. Louis’-Bari sündroomi, Fanconi aneemiat ning Bloomi, 

Rothmundi-Thomsoni, Werneri ja Nijmegeni sündroome. Kõiki neid haigusi põh-

justavad autosoomretsessiivse pärandumistüübiga geneetilised defektid ning kõik nad 

suurendavad kasvajate tekke riski. MMR-i (valepaardumise reparatsioon) defektsus 

suurendab soolevähi tekke riski. Samas on nende pärilike haiguste toime erinev: ühtedel 

juhtudel on ülitundlikkus ioniseeriva kiirguse, teistel juhtudel DNA-ga interkaleeruvate 

ühendite (nagu mitomütsiin C), kolmandatel juhtudel kromosoomide katkemiste (aber-

ratsioonide) suhtes. Seega, erinevate sündroomide korral esineb erinevate ensüümide 

defektsus. Defektsed võivad olla kas DNA reparatsiooniga seotud kinaasid, helikaasid või 

DNA kaksikahelalisi katkemisi äratundvad valgud.

Meeldejätmiseks

• Elusorganismidel on välja kujunenud rida erisuguseid DNA reparatsioonisüsteeme, mille funktsiooniks on 

säilitada organismide geneetilist informatsiooni muutumatul kujul.

• Erinevatel DNA reparatsiooniradadel on võime parandada DNA-kahjustuste teatavaid tüüpe.

• Otseste keemiliste pöördreaktsioonidega parandatakse DNA-kahjustusi kohapeal, näiteks fotoreaktivat-

sioonil valgustundliku ensüümi DNA fotolüaasi toimel.

• Lämmastikaluste väljalõike reparatsioonil tekib apuriinne/apürimidiinne AP-sait ning kahjustatud 

nukleotiid lõigatakse DNA-st DNA glükosülaaside kaasabil välja.

• Nukleotiidide väljalõikel lõigatakse välja ja parandatakse kahjustatud alast pikem nukleotiidne lõik.

• Valepaardumisega reparatsioonil kõrvaldatakse vigastused, mis on tekkinud DNA replikatsioonil või 

rekombinatsioonil.

• Rekombinatsioonisõltuv reparatsioon toimub kas homoloogse rekombinatsioonina või DNA katkenud 

otste mittehomoloogsel ühendamisel.

• On teada kümneid inimese pärilikke haigusi, mis on põhjustatud DNA reparatsioonisüsteemide defek-

tidest.

• DNA reparatsioonidefektidega on seotud osa kasvajate teke.

DNA reparatsiooni defektsusest põhjustatud

pärilikud haigused inimesel

Ekstsisioonreparatsiooni

defektid

DNA metabolismi

defektid

Xeroderma pigmentosum

Cockayne’i sündroom

Trihhotiodüstroofia 

Ataksia-teleangiektaasia

Fanconi aneemia

Bloomi sündroom

Werneri sündroom

Rothmundi-Thompsoni sündroom

Nijmegani katkemise sündroom

Joonis 13.8. DNA reparatsiooni defektsus põhjustab inimesel pärilike haiguste avaldumist. 

Reparatsioon ja rekombinatsioon

399

3´

5´ 3´

5´

Tütarkromatiidid Kaksikahelaline katkemine DNA-valk-filamendi

moodustumine

Homoloogsuse otsimine

Ahelate ümberpaiknemine

5´-otste trimmimine

katketega ahelas

RAD51

Lühikesed DNA-ühendused

DNA ligaas

Ahelate 

kokkukleepimine

DNA polümeraas

DNA süntees Parandatud tütarkromatiidid

Homoloogne 

tütarkromatiid

Joonis 13.6. RecA-sõltuv rekombinatsiooniline reparatsioon eukarüootidel (kaksikahelalised katkemised). Rad51 on eukarüootidel prokarüootide RecA homoloog, mis 

vahendab tütarkromatiidi kaksikahelalise katkega DNA-ahela paardumist teise tütarkromatiidi homoloogse terve ahelaga. Reparatsioonilisel DNA sünteesil kasutatakse 

matriitsina tervet ahelat.

400Reparatsioon ja rekombinatsioon

III

RecA

V

V

LexA repressor

DNA polümeraas III

Tugevalt kahjustatud matriitsahel

RecA-ssDNA filament

ssDNA aktiveerib 

RecA-valgu

DNA polümeraas V

LexA proteolüüs

Inaktiivne LexA 

repressor

ssDNA

SOS-vastuse

initsiatsioon

Veaaldis DNA

süntees

RecA seondub 

ssDNA-ga

Replikatsioonivead

RecA inaktiveerib 

LexA-valgu

Olex recA

Olex uvrA

Olex umuCD

Olex lexA

A

V

RecA-valk

LexA-valk

(repressor)

DNA PolV

LexA pidurdamine

Struktuurgeenid

UvrA-valk

Skaneerib

DNA 

kahjustusi

Joonis 13.7. SOS-vastus bakterites (vea aldis DNA reparatsioon). DNA polümeraas III pole võimeline kasutama DNA-sünteesil vigast matriitsahelat. Üksikahelalise DNA 

teke aktiveerib RecA-valgu (homoloogse rekombinatsiooni valgu). Aktiivne RecA-valk stimuleerib transkriptsioonil negatiivse regulaatori Lex A proteolüüsi (inaktiveerib 

Lex A), millega suurendatakse oluliselt DNA reparatsioonil ja DNA-sünteesil osalevate geenide transkriptsiooni. RecA-valk initsieerib SOS-vastuse, seondudes tugevalt 

kahjustatud üksikahelalise DNA matriitsahelaga (moodustub RecA-ssDNA nukleoproteiinne f lament). DNA polümeraas V viib läbi vea alti DNA sünteesi, kus vigaselt 

matriitsilt sünteesitakse vigane DNA-ahel (mutatsioonisagedus tõuseb replikatsioonivigade tõttu).

Reparatsioon ja rekombinatsioon

403

2. GENEETILINE REKOMBINATSIOON

2.1. REKOMBINATSIOONIMEHHANISMID

2.1.1. Homoloogne retsiprookne rekombinatsioon

Krossingoveri (ingl. crossing over) molekulaarne mehhanism eeldab DNA-molekulis kat-

kete teket ja ahelate otste taasühinemist. Seepärast on siin vajalik ka DNA reparatsiooni 

toimumine. Homoloogsete DNA-molekulide vahelisel rekombinatsioonil osalevad paljud 

ensüümid, mis katkestavad DNA-ahelaid, keeravad neid lahti, stimuleerivad üksikahelate 

teket ning viivad läbi katkenud DNA-ahelate reparatsiooni ja katalüüsivad DNA-ahelate 

taasühinemist. Molekulaarsel tasemel nimetame DNA-molekulide-vahelist rekombinat-

siooni krossingoveriks. Krossingoveri sünonüümina kasutame terminit „ristsiire”.

Eukarüootidel on ristsiire ja sünapsite teke meioosi esimeses profaasis teineteisega 

seotud. Huvitaval kombel ei toimu ristsiiret isaste äädikakärbeste spermatogeneesis ning 

sel puhul ei täheldata ka sünaptiliste komplekside esinemist. Selle nähtuse geneetilist 

tagapõhja selgitavad katsed emaste äädikakärbestega, kus näidati, et mutatsioonid geenis 

c3G elimineerivad nii ristsiirde toimumise kui ka sünapsite tekke. Niisuguseid mutante 

nimetatakse rekombinatsiooni-defektseteks mutantideks (ingl. recombination-def cient 

mutants). Arvatakse, et neil mutantidel ei toimu täiendavat DNA sünteesi, mis esineb nii 

sünapsite kui ka krossingoveri toimumisel. Samuti arvatakse, et isastes äädikakärbestes 

c3G geen seniteadmata põhjustel ei funktsioneeri. 

Kuivõrd eukarüootidel toimub ristsiire paardunud DNA homoloogide vahel meioosi 

esimeses profaasis, siis saab siin arusaadavalt rääkida eelkõige homoloogsest rekombi-

natsioonist (ingl. homological recombination) ning DNA-lõikude võrdsest vastastikusest 

(retsiprooksest) vahetusest. Lisaks DNA-ahelate homoloogsusele on tõestatud ka DNA-

ahelate füüsiline katkemine ja taasühinemine ning DNA reparatsiooni toimumine neis 

protsessides. Homoloogses rekombinatsioonis osalevad paljud valgud ning erinevates 

olukordades võib protsess toimuda erisuguste molekulaarsete mehhanismide alusel. Laias 

laastus toimub homoloogne rekombinatsioon, lähtudes kas üksik- või kaksikahelalistest 

DNA katketest.

2.1.1.1. Üksikahelaliste katkemiste mudel

Üheks esimeseks rekombinatsiooniprotsessi molekulaarseks mudeliks on Briti mole -

kulaarbioloogi Robin Holliday (snd. 1932) poolt 1964. a. väljapakutud krossing overi

üksikahelaliste katkemiste mudel (ingl. single-strand break model). Rekombinat-

siooniprotsess algatatakse endonukleaasi toimel üksikahelaliste DNA-katkete tekkega 

mõlema DNA-molekuli ühes ahelas (jn. 13.9). Järgnevalt toimub DNA helikaaside toi-

mel DNA-ahelate lahtikeerdumine, lahtisulanud üksikahelate seondumine valkudega ja 

katkega ahelate paardumine nendega homoloogse vastasahelaga teisest DNA-moleku-

list. Üksikahelate ümberasetumist stimuleerib RecA-valk. Seda protsessi nimetatakse 

ka DNA üksikahelate assimileerimiseks (ingl. single-strand assimilation) e. protsessiks, 

kus DNA üksikahel ühest DNA-molekulist paardub temaga rekombineeruvast DNA-

molekulist pärit komplementaarse DNA-ahelaga. RecA-valk viib DNA kaksikheeliksis 

läbi võrdväärseid e. retsiprookseid vahetusi ning teeb seda kahes etapis: esmalt seondub 

üksikahel ühest DNA-molekulist teise DNA-molekuli komplementaarse ahelaga, jättes Reparatsioon ja rekombinatsioon

405

selles molekulis üksikuks teise ahela, toimub DNA-ahelate asendamine (ingl. strand 

displacement) ning seejärel paardub see üksikuks jäänud ahel talle komplementaarse 

esimesest DNA-molekulist pärit üksikahelalise piirkonnaga, s.o. toimub DNA-ahelate 

vahetus (ingl. strand exchange). Selleks et teostada kahe DNA-molekuli ahelate vahetu-

misel toimuvat homoloogset paardumist, seondub RecA-valk üksikahelalise DNA-ga. 

Kui homoloogsed ahelad on teineteist leidnud, siis RecA-valk võimendab homoloogsete 

DNA-ahelate paardumist ligikaudu 50 korda. Katkestatud ja asendatud ahelate kova-

lentne kokkupanek e. taasühinemine (ingl. reunion) toimub DNA ligaasi kaasabil. Kui 

üksikahelalised katked ja taasühinemised ei toimu täpselt samas punktis, on juba selles 

etapis, enne ahelate taasühendamist DNA ligaasiga, vajalik DNA reparatsioon. 

Ülalkirjeldatud protsesside tulemusel toimuvad mõlemas DNA kaksikahelas üksik-

ahelalised katkemised ja taasühendamised, mille tulemusena moodustub DNA-ahelatest 

X-kujuline struktuur, mida nimetatakse hii-vormiks (ingl. chi forms) (jn. 13.9) ning mis 

on hästi detekteeritav ka elektronmikroskoopiliselt. Sellist DNA struktuuri nimetatakse ka 

Holliday ühenduseks (ingl. Holliday junction). Holliday ühendusi võib lahti lõigata kahel 

viisil. Ühel juhul toimub krossingover, teisel juhul mit e. Nimelt võivad üsikahelaliste sil-

dade kaudu ühendatud ja teineteisega risti asetsevad DNA-ahelad roteeruda (pöörduda) 

180O ümber oma telje. Selle tulemusena ei ole üksikahelalised sillad enam üksteisega risti. 

Järgnevalt võib endonukleaas sillad kas horisontaal- või vertikaaltasapinnas katki lõigata. 

Erinevate lõigete puhul saadakse erisugused rekombinatsiooniproduktid. Näiteks, kui enne 

rekombinatsiooni külgnesid rekombinatsioonisaidiga homoloogsete geenide alleelid A ja 

B ühes ning alleelid a ja b teises kromosoomis (DNA-molekulis), siis pärast rekombinat-

siooni asetsevad kõrvuti alleelid a ja B ning A ja b. Alternatiivsel katkemisel rekombinantseid 

DNA-molekule kõrvalolevate geenide suhtes aga ei teki. E. coli´l kõrvaldatakse hii-struktuu-

rid DNA-st geenide recG või ruvC produktide toimel.

2.1.1.2. Kaksikahelaliste katkemiste mudel

Rekombinatsioon võib toimuda erinevate molekulaarsete mehhanismide abil. 1983. a. 

esitasid Jack W. Szostak (snd. 1952) ja Franklin Stahl (snd. 1929) pärmseente uurimise 

tulemuste alusel krossingoveri kaksikahelaliste katkemiste mudeli (ingl. double-strand 

break model). Nimetatud mudeli kohaselt toimub esmalt ühes kaksikahelalises DNA-s 

kaksikahelaline katkemine, kus homoloogsete kromosoomide DNA niidid jäävad rekombi-

natsioonikohas teineteisega ühendatuks üksikahelaliste sildade kaudu. Niisugune ühendus 

on vajalik, sest vastasel juhul kaotaksid kaksikahelaliste katkemiste tõt u erinevad DNA-

fragmendid teineteisega kontakti. Rekombinatsiooniga kaasneb ka DNA süntees.

2.1.2. Homoloogne mitteretsiprookne rekombinatsioon (geeni konversioon)

Kui seentel Neurospora crassa uurida teineteisele väga lähedal asetsevaid aheldunud mar-

kereid (geene), ei saada sageli retsiprookse homoloogse rekombinatsiooni tulemusena 

oodatavat askospooride suhet 1 : 1. Näiteks saadakse kahe lähedalasetseva mutatsiooni 

(m1

 ja m2

) uurimisel ristamisest m1

 m2

+ x m1

+

 m2

 järgmised askospooride paarid:

1) paar 1: m1

+ m2

2) paar 2: m1

+ m2

+

3) paar 3: m1 m2

+

4) paar 4: m1 m2

+

404Reparatsioon ja rekombinatsioon

Homoloog 1

Homoloog 2

A B

a b

A

A

A

A

B

B

B

B

a

a

a

a

b

b

b

b

b

a

b

a

b

a

a

b

a

b

A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

Homoloogsete

kromosoomide

paardumine

Üksikahelaliste

katkete 

teke

Ahelate

ümberasetus

Ahelate

vahetus

Kovalentsete

üksikahelaliste

sildade teke

Endonukleaas

Helikaas, 

SSB-valk

RecA-

valgud

DNA ligaas

Rotatsioon

180o

Endonukleaas

DNA ligaas

Üksikahelaliste

sildade katkilõikamine 

kas horisontaal- või 

vertikaaltasapinnas

Kahemõõtmeline

struktuur

Rekombinantne

kromosoom

Kolmemõõtmeline

struktuur

Ekvivalentne 3D

struktuur

Joonis 13.9. Holliday homoloogsete kromosoomide retsiprookse krossingoveri (rekombinatsiooni) ehk üksikahelaliste katkemiste mudel.

406Reparatsioon ja rekombinatsioon

Siit on näha, et järglaste (askospooride) hulgas tuleb et e metsiktüüpi m1

+ m2

+

 -spoore, ei 

esine aga kaksikmutantseid m1

 m2

-spoore, mis peaksid tekkima homoloogsel rekombi-

natsioonil. Siin saadakse m2

+ : m2 askuste suhe 3 : 1 (mit e aga oodatav 2 : 2-jaotus e. 1 : 

1-suhe) (jn. 13.10). Antud juhul oleks nagu üks m2

-alleelidest konverteeritud m2

+-allee-

liks. Sellist tüüpi mit eretsiprookset rekombinatsiooni nimetatakse geenikonversiooniks

(ingl. gene conversion) e. geeni ümbermuutmiseks.

Homoloogsel retsiprooksel rekombinatsioonil vaadeldakse rekombinatsiooni toimu-

mist teineteisest suhteliselt kaugel asetsevate geenide suhtes. Sel juhul võib uuritavate 

geenide (a ja b) vahele jääda näiteks geen m, mille DNA osas võib olla mit epaardunud 

nukleotiide (ingl. mismaches). Sellisel juhul asetuvad krossingoveri esimeses etapis kõr-

vutiolevate DNA-molekulide üksikahelad ümber nii, et mutantne (mit epaardumisega) 

ahel saab kokku mit emutantse ahelaga ja, vastupidi, mit emutantne ahel saab partneriks 

mutantse ahela (jn. 13.10). Protsessi tulemusel tekivad DNA-molekulid, kus kahes komp-

lementaarses DNA-ahelas on erisugused alleelid. Selliseid heterogeenseid DNA-molekule 

nimetatakse heterodupleksiteks (ingl. heteroduplexes). Mit epaardunud nukleotiidide 

väljalõikel kõrvaldatakse DNA reparatsiooniensüümide poolt mutantne m-ahela osa, 

tühik täidetakse täiendaval DNA sünteesil, kasutades matriitsina metsiktüüpi DNA-

ahelat m+

. Niimoodi muudetaksegi mõlemad DNA-ahelad m+-ahelateks ja tetraadis 

saadaksegi m+ : msuhteks 3 : 1. Juhul kui repareeritakse vaid üks kahest mit epaardunud 

nukleotiidist, siis tänu DNA replikatsiooni poolkonservatiivsele iseloomule saadakse 

askuses askospooride m+

:m markerite lahknemissuhteks 5 m+ : 3 m.

Hetero-

dupleks

A B

a b

A B

a b

A B

a b

m

M

M

A B

a b M

m

m

Valepaardumine Reparatsiooniline

DNA süntees

M

M

M

M

M

M

m

m

Geenikonversioon 

M : m = 3 : 1 (e. 6 : 2)

DNA-ahelate vahetus ja

heterodupleksite teke

Joonis 13.10. Geeni konversioon ehk geeni ümbermuutmine.

Geeni konversioon assotsieerub retsiprookse rekombinatsiooni tulemustega 50%-l 

juhtudest, sest Holliday mudeli kohaselt võib toimuda hii-struktuuride katkemine 

võrdtõenäosuslikult nii horisontaalselt kui ka vertikaalselt. Vertikaalsed katkemised 

põhjustavad askuste teket, kus esinevad nii geeni konversioon kui ka retsiprooksne rekom-

binatsioon. Horisontaalsel katkemisel ilmneb aga ainult geeni konversioon (jn. 13.11).

Reparatsioon ja rekombinatsioon

407

a

b A

Endonukleaas

b

a

A

B

a

b

A

B M

M

a

b

A

B

B

b A a B

b A a B

b A a B

Endonukleaas

DNA ligaas DNA ligaas DNA ligaas DNA ligaas

Kõrvalasetsevate markerite suhtes rekombinantne Kõrvalasetsevate markerite suhtes vanemtüüpi

Reparatsiooniline süntees Reparatsiooniline süntees

M

M

M

M

M M

M

M

M M

M M M

M

M

M

M

M

M

M

M

M

M M

M M

geenikonversioon geenikonversioon

Joonis 13.11. Geenikonversioonil (M/M-DNA-ahelad) moodustuvad rekombinantsed (all vasakul) ja vanemtüüpi (all paremal) f ankeeruvate markerite kombinatsioonid. 

Üksikahelaliste sildade endonukleaasiga vertikaalsuunas katkilõikamine (vasakul) põhjustab rekombinantse kombinatsiooni (Ab ja aB) ja horisontaalsuunas (paremal) 

vanemtüüpi (AB ja ab) kombinatsiooni esinemist.

Reparatsioon ja rekombinatsioon

407

a

b A

Endonukleaas

b

a

A

B

a

b

A

B M

M

a

b

A

B

B

b A a B

b A a B

b A a B

Endonukleaas

DNA ligaas DNA ligaas DNA ligaas DNA ligaas

Kõrvalasetsevate markerite suhtes rekombinantne Kõrvalasetsevate markerite suhtes vanemtüüpi

Reparatsiooniline süntees Reparatsiooniline süntees

M

M

M

M

M M

M

M

M M

M M M

M

M

M

M

M

M

M

M

M

M M

M M

geenikonversioon geenikonversioon

Joonis 13.11. Geenikonversioonil (M/M-DNA-ahelad) moodustuvad rekombinantsed (all vasakul) ja vanemtüüpi (all paremal) f ankeeruvate markerite kombinatsioonid. 

Üksikahelaliste sildade endonukleaasiga vertikaalsuunas katkilõikamine (vasakul) põhjustab rekombinantse kombinatsiooni (Ab ja aB) ja horisontaalsuunas (paremal) 

vanemtüüpi (AB ja ab) kombinatsiooni esinemist.

Reparatsioon ja rekombinatsioon

409

2.1.3.2. Integronid

Integronid (ingl. integrons) on geneetiliste elementide klass, mis esineb sageli plasmiidi-

des, transposoonide koostises või nende läheduses ja teistes insertsioonilistes elementides 

(nt. bakteriofaagid). Integronid sisaldavad integraasigeeni (ingl. integrase gene) ja külg-

nevat rekombinatsioonisaiti at I (ingl. recombination site at I). Integron on võimeline 

haarama endasse näiteks antibiootikumiresistentsuse geenikasset e (ingl. antibiotic-

resistance gene casset es). Rõngasjas geenikasset viiakse lineaarseks integraasi vahendatud 

rekombinatsioonil at I-saidi ja at C-saidi (nimetatakse ka 59 bp elemendiks, mis asub 

kassetis antibiootikumiresistentsuse-geeni kõrval) vahele (jn. 13.13). Enne integratsiooni 

pole antibiootikumiresistentsuse-geenil promootorit ning ta ei avaldu. Integratsiooni järel 

saab aga antibiootikumiresistentsuse-geen avalduda saidis at I. Integraasigeeni trans-

kribeeritakse promootorilt Pint ning integreerunud antibiootikumiresistentsuse-geeni 

(geene) transkribeeritakse sama piirkonna DNA vastasahelal moodustatud tugeva vas-

tassuunalise promootori Pout 

poolt. 

Kuigi integronid on iseloomulikud antibiootikumiresistentsuse-geenidele, on neid kir-

jeldatud ka metaboolsete ja virulentsusgeenide ümberpaiknemise puhul. Integronid on ka 

kohaks, kuhu võivad liituda paljud muud geenikassetid, mõnedel juhtudel isegi rohkem kui 

100 kasset i. Selliseid integrone nimetatakse superintegronideks (ingl. super-integrons).

P h1 hixR P hin hixL h2 rh1

h1 hixL hin P hixR h2 rh1

P

P

Hin katalüüsib 

saitspetsiifilist

rekombinatsiooni, millega 

inverteeritakse promootorit

sisaldav DNA-segment

h2-rh1-operoni transkriptsioon

pidurdatud

h2-rh1-mRNA

H1-repressor

h1-mRNA

H2-flagelliini

alaüksuste valgud

H1-flagelliini

alaüksuste valgud

Faas I orientatsioon

Faas II orientatsioon

DNA

DNA

h1-operoni transkriptsioon

pidurdatud

Faas I Faas II

H1-repressor

P

Joonis 13.12. Salmonella typhimurium´i viburite faasivahetus saitspetsiifilise rekombinatsiooniga. H1- ja 

H2-f agelliini alaüksuste valkude süntees on alternatiivne: H1 sünteesitakse h1-repressori puudumisel; H2- 

(ja H1-repressor) sünteesitakse insertsioonilise elemendi promootori operonisuunalisel orientatsioonil. 

Valk Hin määrab insertsioonilise elemendi mõlemasuunalist inversiooni. Faasis I olevad rakud toodavad 

H1-vibur antigeene, faasis II olevad rakud aga H2-viburantigeene (f agelliine).

2.1.3.2. Integronid

Integronid (ingl. integrons) on geneetiliste elementide klass, mis esineb sageli plasmiidi-

des, transposoonide koostises või nende läheduses ja teistes insertsioonilistes elementides 

(nt. bakteriofaagid). Integronid sisaldavad integraasigeeni (ingl. integrase gene) ja külg-

nevat rekombinatsioonisaiti at I (ingl. recombination site at I). Integron on võimeline 

haarama endasse näiteks antibiootikumiresistentsuse geenikasset e (ingl. antibiotic-

resistance gene casset es). Rõngasjas geenikasset viiakse lineaarseks integraasi vahendatud 

rekombinatsioonil at I-saidi ja at C-saidi (nimetatakse ka 59 bp elemendiks, mis asub 

kassetis antibiootikumiresistentsuse-geeni kõrval) vahele (jn. 13.13). Enne integratsiooni 

pole antibiootikumiresistentsuse-geenil promootorit ning ta ei avaldu. Integratsiooni järel 

saab aga antibiootikumiresistentsuse-geen avalduda saidis at I. Integraasigeeni trans-

kribeeritakse promootorilt Pint ning integreerunud antibiootikumiresistentsuse-geeni 

(geene) transkribeeritakse sama piirkonna DNA vastasahelal moodustatud tugeva vas-

tassuunalise promootori Pout 

poolt. 

Kuigi integronid on iseloomulikud antibiootikumiresistentsuse-geenidele, on neid kir-

jeldatud ka metaboolsete ja virulentsusgeenide ümberpaiknemise puhul. Integronid on ka 

kohaks, kuhu võivad liituda paljud muud geenikassetid, mõnedel juhtudel isegi rohkem kui 

100 kasset i. Selliseid integrone nimetatakse superintegronideks (ingl. super-integrons).

410Reparatsioon ja rekombinatsioon

2.1.3.3. Transpositsioon

Transposoonide (ingl. transposons) iseloomulikumaks omaduseks on nende võime lii-

kuda (transponeeruda, hüpata) doonorsaidist (ingl. donor site) märklaudsaiti (ingl.

targer site) , ilma et nende kahe saidi vahel oleks üldse homoloogiat. Bakteritel võivad 

transposoonid liikuda nii bakteriofaagide, plasmiidide kui ka kromosoomi vahel. Kuigi 

transpositsioon toimub üldjuhul suvalisse DNA piirkonda, on mõnedel elementidel (nt. 

transposoon Tn7) siiski kindlate DNA- järjestuste osas eelistusi. Transposoonidel on 

kirjeldatud kaht selgelt eristatavat rekombinatsioonimehhanismi: replikatiivne ja mit e-

replikatiivne transpositsioon. 

Replikatiivsel transpositsioonil (ingl. replicative transposition) põhjus-

tab transposooni poolt kodeeritud transposaas (ingl. transposase) plasmiidis 

(doonoris) ja märklaudsaidis (retsipiendis) nihutatult üksikahelaliste katkete teket (jn. 

int1 rg1 rg2

attI attC attC

5´ 3´

mRNA

int1

int1 rg1

rg1

rg2

attI

attI

attC

attC

attC

Integraas

Integraas

Integraas

5´

5´ 3´

3´

Integron

Pint

Pint

Pint

Pout

Pout

Pout

Joonis 13.13. Integronis olev resistentsusgeenide kassett. Residentne integron koosneb integraasigeenist 

(int) ja kõrvalasetsevast saidist at I. Integraasigeen transkripteeritakse enda promootorilt Pint. Teine pro-

mootor Pout on aktiivne vaid siis, kui integroni lülitub geenikassett (antud näites resistentsusgeenid rg). 

Geenikassetis on resistentsusgeen ja attC-järjestus rõngasmolekulina (nt. plasmiid). Mitmene ravimi-

resistentsus moodustub resistentsusgeenide järkjärgulise lülitumisega integroni, kus nad kõik transkribeeri-

takse ühelt promootorilt Pout.

2.1.3.3. Transpositsioon

Transposoonide (ingl. transposons) iseloomulikumaks omaduseks on nende võime lii-

kuda (transponeeruda, hüpata) doonorsaidist (ingl. donor site) märklaudsaiti (ingl.

targer site) , ilma et nende kahe saidi vahel oleks üldse homoloogiat. Bakteritel võivad 

transposoonid liikuda nii bakteriofaagide, plasmiidide kui ka kromosoomi vahel. Kuigi 

transpositsioon toimub üldjuhul suvalisse DNA piirkonda, on mõnedel elementidel (nt. 

transposoon Tn7) siiski kindlate DNA- järjestuste osas eelistusi. Transposoonidel on 

kirjeldatud kaht selgelt eristatavat rekombinatsioonimehhanismi: replikatiivne ja mit e-

replikatiivne transpositsioon. 

Replikatiivsel transpositsioonil (ingl. replicative transposition) põhjus-

tab transposooni poolt kodeeritud transposaas (ingl. transposase) plasmiidis 

(doonoris) ja märklaudsaidis (retsipiendis) nihutatult üksikahelaliste katkete teket (jn.13.14). Märklaudsaidi 5´-fosfaatots ühineb (ligeeritakse) siseneva DNA 3´-hüdroksüül-

otsaga. Lõikekohtades eralduvad DNA-ahelad ja märklaud-DNA 3´-hüdroksüülgrupp on

praimeriks transposooni ja temaga külgnevate järjestuste komplementaarse ahela sün-

teesil. Uuestisünteesitud transposooniahelad ligeeritakse järelejäänud 5´-fosfaatgruppi

kandvate DNA otstega. Moodustub kahe transposooniga ühendmolekul, mida nimeta-

takse kointegraadiks (ingl. cointegrate). Transposooni poolt sünteesitud resolvaas (ingl.

resolvase) määrab järgnevalt res-saidis (ingl. res sites) transposoonidevahelise saitspetsiif -

lise rekombinatsiooni toimumise ja transposoonita plasmiidse doonor-DNA vabanemise.

Teine transposooni koopia jääb märklaud-DNA-sse.

Mit ereplikatiivsel transpositsioonil (ingl. nonreplicative transposition) põhjustab

transposooni määratud transposaas plasmiidi inverteeritud järjestuste (IR) (ingl.

inverted repeats, IR) otstes kaksikahelaliste katkete teket ja märklaudsaidis nihutatult

üksikahelaliste katkete teket (vt. ptk. XIX). Transposooni 3´-hüdroksüül-otsad ühinevad

märklaud-DNA 5´-fosfaatotstega. Tulemusena viiakse transposoon märklaud-DNA-sse

ning järelejäänud osa plasmiidsest DNA-st degradeeritakse. Transposooni ühenduskohast

mõlemale poole jäävatele üksikahelalistele aladele sünteesitakse vastu komplementaarsed

lõigud ning see põhjustab ühenduskohtades lühikeste duplikatsioonide teket (märklaud-

saitide duplitseerumist).

412Reparatsioon ja rekombinatsioon

Kromosoomi märklaudjärjestuste 5´P-otsad ühinevad 

transposooni üksikkatkega ahela 3´-hüdroksüülotsaga

Transposaas

Transposaas

Märklaudjärjestus

Plasmiid

Transposoon

Kromosoom

Ahelad lahknevad katkemiskohtades:

märklaud-DNA 3´-OH rühmad on 

praimeriteks transposooni

komplementaarse ahela sünteesil 

Uuestisünteesitud transposooniahelad 

ligeeritakse järelejäänud 5´P-rühmadega.

Transposooni poolt kodeeritud resolvaas 

viib res-saidis läbi saitspetsiifilise

rekombinatsiooni

Plasmiidne doonor 

eraldub kromosoomsest 

kointegraadist

Replikatiivsel transpositsioonil lülitub 

transposoon kromosoomi

Plasmiidi transposoon ja kromosoomi märklaudjärjestus

eraldatakse muust DNA-st üksikahelaliste katketega

transposaasi toimel (kohad tähistatud mustade nooltega)

5´

5´

5´

5´

5´

5´

5´ 5´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

Kointegraat

res

5´

5´

5´

5´

5´

5´

3´

res

Resolvaas

Joonis 13.14. Replikatiivse transpositsiooni mehhanism.