Mendelism 3-8

Blogi, mis räägib kõigest, mis on Leonhardile oluline ja/või huvitav. Kommenteerige, tellige, lugege, nautige ja õppige.

GENEETIKA ÜLDKURSUS

Maia Kivisaar

3. Mendelism:    pärilikkuse üldprintsiibid 19. sajandi keskel uuris Brnos (Tsehhimaal) augustiinlaste kloostri munk Gregor Mendel (1822-1884), kes oli ka loodusteadlane ja kooliõpetaja, milliste seaduspärasuste alusel kanduvad organismide tunnused üle järglastele. 1865.a. avaldas ta tulemused, mis panid aluse uue teadusharu – geneetika sünnile. Mendel katsetas erinevate taimedega ja isegi mesilastega, kuid edu saavutas ta siiski eeskätt aedhernestega. Katsed hernestega olid lõpule viidud juba 1863. aastaks. Mendel kulutas veel paar aastat tulemuste analüüsimiseks, kuid kahjuks ei pälvinud tema artikkel tähelepanu selle sajandi alguseni. Aastal 1900 otsisid sõltumatult kolm botaanikut Hugo de Vries Hollandist, Carl Correns Saksamaalt ning Eric von Tschermak-Seysenegg Austriast varem publitseeritud andmeid, mis kinnitaksid nende endi katsetulemusi pärilikkuseteoorias ja leidsid, et Gregor Mendel oli samad seaduspärasused kirjeldanud juba 35 aastat tagasi. Nüüd levisid Mendeli ideed kiiresti ja seda eeskätt tänu inglise bioloogi William Batesoni aktiivsele tutvustustööle. Pärilikkuseteaduse asemel võeti kasutusele uus termin geneetika (tuleneb kr. keelsest sõnast tähendusega “tekitama”).   3.1.1. Mendeli objekt aedhernes Pisum sativum Mendeli edu tulenes õnnestunud objekti valikust. Aedherne eripäraks on see, et tema õite kroonlehed on allapoole tihedalt suletud, vältimaks tolmuterade väljumist ja võõraste sisenemist. Selline süsteem tagab iseviljastumise, kus nii munarakk kui ka seemnerakk pärinevad samast õiest. Erinevalt teistest bioloogidest, kes püüdsid korraga jälgida mitmete väga erinevate tunnuste pärandumise seaduspärasusi, kontsentreerus Mendel vähestele hästieristuvatele parameetritele – taimede pikkus, seemnete värvus.   3.1.2. Monohübriidne ristamine: dominantsuse ja lahknemise printsiip Mendel ristas kõrgekasvulisi hernetaimi kääbuskasvulistega. Järglaskond oli kõrgekasvuline sõltumata sellest, kas tolmuterad, mida kasutati viljastamiseks, pärinesid kõrgekasvuliselt hernelt ja tolmendati kääbuskasvulise taime õisi või vastupidi. Kõrgekasvulise järglaskonna puhul toimus iseviljastumine ning järgmises põlvkonnas ilmnes tunnuste lahknemine. 1064-st järglasest 787 olid kõrgekasvulised ja 277 kääbused, lahknemissuhe oli ligikaudu 3:1. Mendel märkas, et kääbuskasv võib hübriidides esineda latentsena, olla varjutatud faktori poolt, mis määrab taimede kõrge kasvu. Latentne faktor oli retsessiivne ja avalduv faktor dominantne. Mendel järeldas, et hübriidsete taimede järglaskonnas pidi olema toimunud dominantse ja retsessiivse faktori lahknemine. Kuidas teisiti oleks võimalik seletada kääbuskasvuliste järglaste ilmumist. Mendel kordas katseid aedhernega ka teiste tunnuste pärandumise seaduspärasuste uurimiseks. Ta viis läbi seeria monohübriidseid ristamisi erinevate vastandlike tunnuste suhtes, jälgides seemnete tekstuuri, värvust, kaunade kuju ja värvust, õite värvust ja asukohta. Kõigil juhtudel avaldus hübriidsete taimede tunnuste puhul üks vastandlikest omadustest ning hübriidide iseviljastumise tulemusena saadud järglaskonnas toimus faktorite lahknemine suhtega 3:1. Hiljem, 1909. aastal võttis Taani taimearetaja W. Johannsen nende faktorite asemel kasutusele termini geen, mille retsessiivseid ja dominantseid vorme hakati nimetama alleelideks (kr. keeles “üks teisest”). Mendel tegi oma katsetulemustest ka teise olulise järelduse: geenid esinevad paaridena. Taimed, mida ta kasutas ristamiseks, sisaldasid kahte identset geenikoopiat. Kaasaegse terminoloogia kohaselt olid need taimed diploidsed ja homosügootsed. Gameetides säilus aga ainult üks geenikoopia, need rakud olid kaasaegse terminoloogia põhjal haploidsed. Geenide diploidsus taastus sügoodi moodustumisel. Kui munarakk ja seemnerakk pärinesid geneetiliselt erinevatelt taimedelt, sisaldas sügoot kahte erinevat alleeli, millest üks pärines isalt ja teine emalt. Selline järglaskond oli heterosügootne. Selleks, et tähistada pärilikkusefaktoreid, kasutas Mendel sümboleid. Geneetiliste sümbolite kasutamise kõige üldisemad printsiibid on tänapäevani säilunud. Näiteks taimede kasvu mõjutavaid alleele märgitakse järgmiselt: d – kääbuskasv (d pärineb inglise keelsest sõnast “dwarfness”, kääbusus); D - dominantne kõrget kasvu määrav alleel. Üldiselt lähtutaksegi sellest, et alleeli tähistus tuleneb retsessiivsest tunnusest. Seega märgitakse kõrgekasvuliste ja kääbuskasvuliste taimede alleelset koostist e. genotüüpi vastavalt DD ja dd. Tunnuste ilmetüüpi, antud juhul siis kõrget või kääbuskasvu, nimetatakse isendite fenotüübiks.   Ristamises osalenud vanemaid (inglise keeles “parents”) tähistatakse tähega P – P generatsioon. Nende hübriidset järglaskonda tähistatakse F1, tähistus tuleneb ladinakeelsest terminist. F1 põlvkond on genotüübilt Dd ja fenotüübilt kõrgekasvuline nagu DD genotüübiga vanematel. F1 järglased produtseerivad kahte tüüpi gameete – D ja d genotüübiga, alleelid D ja d lahknevad e. segregeeruvad teineteisest sõltumata. Iseviljastumise tagajärjel liituvad gameedid erinevates kombinatsioonides, produtseerides nelja tüüpi sügoote: DD, Dd, dD ja dd. Munarakust pärinev alleel märgitakse tavaliselt esimesena. Kuna D on dominantne alleel, siis on kolme esimese genotüübi puhul järglaskond ühesuguse fenotüübiga – kõrgekasvuline. Ainult genotüübi dd korral avaldub kääbuskasv. Seega on iseviljastumise teel saadud järgmine generatsioon F2 kas kõrgekasvuline või kääbuskasvuline lahknemissuhtega 3:1. Alleelide segregeerumise bioloogiliseks aluseks on homoloogiliste kromosoomide paardumine ja sellele järgnev lahknemine tütarrakkudesse meioosiprotsessis. Seega kehtivad Mendeli poolt teostatud monohübriidsetel ristamistel kaks printsiipi:   Dominantsuse printsiip – heterosügootides esineb üks alleelidest varjatud kujul. Segregeerumise printsiip – kaks erinevat alleeli segregeeruvad heterosügootide gameetide moodustumisel. Neid kahte printsiipi tuntakse ka Mendeli I ja II seadusena: Mendeli I seadus e. ühetaolisuse seadus – Erinevate homosügootsete isendite ristamisel on esimese põlvkonna järglased F1 kõik ühetaolised heterosügoodid sõltumata ristamise suunast. Mendeli II seadus e. lahknemisseadus – Heterosügootide (hübriidide) järglaskonnas toimub geneetiline lahknemine, nii et kindlates sagedussuhetes tekivad nii homosügootsed kui ka heterosügootsed isendid.   3.1.3. Dihübriidne ristamine: sõltumatu lahknemise seadus e. vaba kombineerumise seadus (Mendeli III seadus) Mendel viis läbi ka selliseid ristamisi, kus taimed erinesid teineteisest rohkem kui ühe tunnuse osas. Ta ristas kollaste ja ümmarguste seemnetega herneid roheliste ja kortsus seemnetega hernestega. Katse eesmärgiks oli kontrollida, kas kaks tunnust, seemnete värvus ja tekstuur päranduvad sõltumatult. Kuna F1 põlvkonna taimede seemned olid kollased ja ümmargused, olid vastavad alleelid dominantsed. F1 põlvkonnas ilmnesid neli erinevat fenotüüpi: vanematega sarnased kollased ja ümmargused ning rohelised ja kortsulised ja kaks uut kombinatsiooni – rohelised ja ümmargused ning kollased ja kortsulised. Seega olid värvus ja tekstuur kontrollitud erinevate geenide poolt, mis kandusid järglaskonda sõltumatult. Toimus ka mõlemate geenide alleelide lahknemine. Sellist kahe tunnuse suhtes jälgitavat ristamist nimetatakse dihübriidseks ristamiseks. Alleelide tähised tuletati retsessiivsetest omadustest: g – “green”; w – “wrinkled”. Kasutades sümboleid, näeb vastav ristamise skeem välja järgmine:   Vanemad          P kollased, ümmargused rohelised, kortsulised X GG WW gg ww Gameedid G W g w F1 kollased, ümmargused Gg Ww Gameedid GW Gw gW gw Isevilja stumine F2 4 erinevat fenotüüpi, 9 genotüüpi kollased, ümmargused 9/16 kollased, kortsulised 3/16 rohelised, ümmargused 3/16 rohelised, kortsulised 1/16   Erinevad alleelipaarid segregeeruvad, kombineeruvad üksteisest sõltumatult. Vt. Viikmaa leksikon!   3.2.  Mendeli seaduste kasutamine inimese geneetikas Mendeli seadusi hakati laiemalt kasutama varsti pärast nende üleavastamist käesoleva sajandi algul. Inimese pärilikkuse geneetilise analüüsi aluseks on informatsioon, mis on saadud sugupuude uurimisest. Põhilised raskused seisnevad selles, et järglaskond on väike, sugupuud sageli ebatäielikult koostatud, alati pole kirjas õige isa. Oluline on ka ajafaktor - mõned haigused ilmnevad alles keskeas. Sellegipoolest on tänaseks geneetiliselt iseloomustatud palju erinevaid haigusi ning indiviidide väliseid tunnuseid. Mõned näited: dominantsed tunnused on kääbuskasv, brahhüdaktüülia (lühikesed sõrmed), Huntingtoni tõbi (neuroloogiline defekt), lokkis juuksed. Retsessiivsed tunnused on albinism (pigmendi puudumine), alkaptonuuria, tsüstiline fibroos, Duchenne lihasdüstroofia, fenüülketonuuria, sirprakne aneemia. Sugupuud on diagrammid, mis näitavad perekonnas olevaid sugulusastmeid. Meessoost indiviide tähistatakse ruutudega ja naissoost indiviide ringidega. Ringi ja ruutu ühendav horisontaalne joon näitab ühist järglaste saamist. Järglased näidatakse pealt ühendatud joonega, esmasündinu on kõige vasakpoolsem. Need indiviidid, kellel avaldub uuritav omadus, näidatakse värvitud või viirutatud sümbolitega. Põlvkonnad on tavaliselt tähistatud rooma numbritega. Tavaliselt avalduvad dominantsed alleelid ka järgmistes põlvkondades. Dominantne alleel võib ilmuda perekonda ka mutatsiooni tagajärjel, kuid selle sündmuse tõenäosus on väga harv – üks miljonist. Need dominantsed tunnused, mis vähendavad fertiilsust ja elujõulisust, on populatsioonis väga harvad. Seega on selliseid tunnuseid kandvad inimesed enamasti vastava alleeli suhtes heterosügootsed. Retsessiivseid tunnuseid on märksa raskem identifitseerida, sest vanematel ei pruugi need avalduda. Siiski on praeguseks kirjeldatud üle 4000 retsessiivse tunnuse. Retsessiivsed tunnused avalduvad sagedamini siis, kui vanemad on omavahel suguluses. Mendeli seadusi on võimalik kasutada arvutamaks, millise tõenäosusega sünnib vanematel haige laps. Näiteks on mõlemad vanemad heterosügootsed retsessiivse alleeli suhtes, mis põhjustab tsüstilist fibroosi. Kui perekonda sünnib 4 last, on võimalikud 5 erinevat varianti: kõik lapsed on normaalsed, 1 on haige, 2 on haiged, 3 last 4-st on haiged ning kõik lapsed on haiged. Loogiline oleks arvata, et kõige tõenäolisemalt realiseerub variant 3 normaalset ja 1 haige laps. Konkreetse sünni puhul on ¾ tõenäosusega laps normaalne. Tõenäosus, et kõik lapsed oleksid normaalsed, on seega ¾ x ¾ x ¾ x ¾ = (¾)4 = 81/256. Võimalus, et 1 konkreetne laps sünnib haigena, on ¼. Seega tõenäosus, et kõik lapsed sünniksid tsüstilise fibroosiga, on (¼)4 = 1/256. Tõenäosus, et 3 last on normaalsed ja 1 haige, arvutatakse järgmiselt. Sõltuvalt haige lapse sünnijärjekorrast on 4 erinevat võimalust: NNNA, NNAN, NANN, ANNN, kus N = normaalne, A = haige. Iga võimalus realiseerub tõenäosusega (3/4)3 x ¼. Tõenäosus, et 1 laps 4-st sünnib haigena hoolimata laste sünnijärjekorrast on 4 korda suurem, 4 x (3/4)3 x ¼. Tõenäosus, et 2 lastest sünnivad tervena ja 2 haigusega, on 6 x (3/4)2 x (1/4)2, sest sel juhul on laste sünnijärjekorda arvestades 6 erinevat võimalust.     4. Mendelismi edasiarendus   4.1. Alleelne varieeruvus ja geeni funktsioon Mendeli õpetuse järgi on igal konkreetsel geenil 2 alleeli – üks dominantne ja teine retsessiivne. Edasised uuringud on aga näitasid, et geenil võib olla rohkem kui 2 alternatiivset varianti, alleeli, ning iga alleel mõjutab fenotüüpi erinevalt.   4.1.1. Semidominantsus ja kodominantsus Alleel on dominantne siis, kui tal on samasugune fenotüübiline efekt nii homosügoodis kui ka heterosügoodis, st. Aa ja AA on fenotüübiliselt eristamatud. Mõnel juhul on heterosügootide fenotüüp homosügootide fenotüübist erinev. Näiteks lõvilõua õied on valged, kui taim on homosügootne retsessiivse alleeli suhtes (ww) ja punased, kui taim on homosügootne dominantse alleeli suhtes (WW). Heterosügootsed taimed (Ww) on aga roosade õitega. Alleel W annab õitele punase värvuse, alleeli w puhul aga pigmenti ei toodeta. Pigmendi intensiivsus õie kroonlehtedes sõltub geeni doosist: homosügoodis WW on geeni produkti (punast pigmenti) 2 korda enam kui heterosügoodis Ww. Sellest ka roosad õied. Osaliselt dominantset alleeli, mis avaldub heterosügootides nõrgemini, nimetatakse ka semidominantseks alleeliks. Inimese vererakud võivad toota 2 erinevat produkti – N ja M antigeeni. Neid antigeene toodavad sama geeni 2 alleelset varianti. Alleeli M suhtes homosügoodid toodavad ainult M antigeeni, alleeli N suhtes homosügoodid aga ainult N antigeeni. Heterosügootides üks alleel teist maha ei suru, vaid avalduvad mõlemad ning seetõttu on verest testitavad nii M kui ka N antigeen. Sel juhul on alleelid kodominantsed. Kuna kodominantsuse puhul avalduvad alleelid teineteisest sõltumatult, märgitakse mõlemad alleelid suurte tähtedega ja üleval indeksina. Seega on M ja N alleelide tähistused LM ja LN. Täht L tuleneb konkreetsel juhul erinevate veretühmade avastaja Karl Landsteineri nimest.   4.1.2. Mitmealleelsus Klassikaline näide mitmealleelsusest esineb küülikute karvavärvust määrava geeni c puhul. Sellel geenil on 4 erinevat alleeli: c – albiino (c tuleneb inglisekeelsest sõnast “colorness”, värvusetu), ch – himaalaja, cch – chinchilla ja c+ – metsiktüüp. Homosügootses olekus on igal alleelil kindel toime karva värvusele. Cc küülikud on üleni valge karvaga, chch küülikud on valged mustade kõrvade, käppade ja ninaotsaga, cch cch küülikud on valgete karvadega, millel on mustad otsad ja c+ c+ küülikud on tumedakarvalised. Kuna enamus looduslikus populatsioonis elavaid küülikuid on tumedakarvalised, siis kutsutakse c+ alleeli metsiktüüpi alleeliks. + märk on geneetikutel metsiktüübi tähiseks. Geenid nimetatakse sageli mutantse alleeli järgi ja enamasti just selle alleeli järgi, mille efekt on kõige markantsem (antud juhul valge karvavärvus). Mitmealleelsusega on seotud ka inimese AB0 vererühmade süsteem. Geenil, mis produtseerib kas A või B antigeeni, on 3 alleelset vormi: IA, IB ja I0. IA kodeerib A antigeeni, IB kodeerib B antigeeni ja I0 alleel ei määra midagi. 6 võimalikule genotüübile vastavad 4 fenotüüpi: A veregrupile (IAIA või IAI0), B veregrupile (IBIB või IBI0), AB veregrupile (IAIB) ja 0 veregrupile (I0I0). Alleelid IA ja IB on kodominantsed, kuid I0 on mõlema suhtes retsessivne. Kuna kõik geeni I 3 erinevat alleeli esinevad arvetatava sagedusega inimpopulatsioonis, nimetatakse seda geeni polümorfseks (kreekakeelsest sõnast, mis tähendab “omab palju vorme”).   4.1.3. Alleelide seeriad Erinevate alleelide kombineerumisel võivad alleelid omada erinevat efekti sõltuvalt sellest, milline alleel millisega on kombineerunud. Küüliku karvavärvust määravate alleelide vahel valitseb domineerumises hierarhia c+ > cch > ch > c. Lahtiseletatult tähendab see seda, et metsiktüüpi alleel on täielikult funktsionaalne, chinchilla ja himaalaja alleelid võimaldavad produtseerida pigmenti vaid osaliselt ning albiino üldsegi mitte. Erinevad alleelide kombinatsioonid heterosügootidel viivad erinevatele fenotüüpidele. Kõik metsiktüüpi alleeli omavad isendid on fenotüübilt tumedakarvalised, cchc heterosügoot hele chinchilla, cchch alleelidega küülik hele chinchilla mustade kõrvade, käppade ja ninaga ning chc heterosügoot on fenotüübilt himaalaja. Alleelide seeriates nimetatakse mittefunktsionaalseid alleele null või amorfseteks alleelideks. Osaliselt funktsionaalsed alleelid on hüpomorfsed, nad on retsessiivsed nende alleelide suhtes, mille funktsioon neid varjutab (tavaliselt metsiktüüpi alleel).   4.1.4. Mutatsioonide testimine alleelsuse määramiseks Seda, kas mutantne fenotüüp on põhjustatud sama geeni alleelse teisendi poolt või mitte, saab testida näiteks testertüvega ristamise teel. Sellist analüüsi saab läbi viia retsessiivsete mutatsioonide uurimiseks. Ristamisse võetav testertüvi on homosügootne teatava geeni retsessiivse alleeli suhtes. Juhul, kui ka järglaskonnal avaldub mutantne fenotüüp, on mutantne alleel sama geeni variant, mille alleel testertüvel retsessiivne on. Näiteks äädikakärbsel Drosophila melanogaster on kirjeldatud 2 retsessiivset mutatsiooni – cinnabar ja scarlet, mis mõlemad põhjustavad kärbestel erepunast silmavärvi. Metsiktüüpi kärbestel on tumedad silmad. Selleks, et teha kindlaks, kas cinnabar ja scarlet mutatsioonid on toimunud samas geenis, st., kas tegemist on mutantsete alleelidega, ristati mutantseid kärbseid omavahel. Kuna järglased olid fenotüübilt metsiktüüp, olid mutatsioonid toimunud erinevates geenides, ristamise käigus toimus komplementatsioon mutantsete geenide suhtes. Kui testiti kolmandat mutatsiooni cinnabar-2, ristates mutantseid kärbseid cinnabar ja scarlet mutantidega, saadi mutantsed järglased cinnabar kärbestega ristates ja metsiktüüpi järglased scarlet mutatsiooni kandvate kärbestega ristates. Need tulemused näitavad, et cinnabar-2 ja cinnabar on ühe ja sama geeni alleelid. Sel viisil ei saa testida dominantseid mutatsioone, sest dominantne alleel avaldub nii või teisiti, hoolimata sellest, millist mutatsiooni kannab ristamisse võetav testertüvi.   4.1.5. Mutatsioonide toime organismile võib olla erinev Mutatsioonid, mis muudavad mõnda morfoloogilist tunnust, näiteks seemnete värvust või tekstuuri, on nähtavad mutatsioonid. Enamus neist on retsessiivse toimega. Mutatsioone, mis takistavad organismi reproduktsioonivõimet, nimetatakse steriilseteks mutatsioonideks. Mõned steriilsed mutatsioonid mõjutavad mõlemat sugupoolt, mõned on aga spetsiifilised kindlale soole. Toime soojätkamisele võib olla kas täielikult või ainult osaliselt pärssiv. Mutatsioonid, mis kahjustavad organismi elulisi funktsioone, on letaalsed mutatsioonid. Nende fenotüübiline avaldumine väljendub organismi surmas ning seda enamasti juba looteeas. Enamus geene võivad muteeruda nii, et selle toime on organismi seisukohalt letaalne. Dominantsed letaalsed mutatsioonid kõrvalduvad ühe põlvkonna vältel, sest kõik järglased surevad. Retsessiivsed mutatsioonid võivad püsida populatsioonis kaua, kuna heterosügootides on nad varjutatud metsiktüüpi alleelide poolt. Retsessiivseid letaalseid mutatsioone on võimalik tuvastada siis, kui järglaskonnas toimub fenotüüpide osas ebatavaline lahknemine. Näiteks mutatsioon yellow-lethal (kollane-letaalne) Yl on hiirtel dominantne nähtav, kuna seda alleeli kandvatel hiirtel on karv hallikaspruuni asemel kollane. Samas on ta ka retsessiivne letaalne, kuna kahte seda alleeli kandvad järglased surevad juba embrüostaadiumis. Kuna värvuse seisukohalt on mutatsiooniga alleel dominantne, võiks heterosügootide ristamisel oodata järglaskonnas lahknemist suhtega 3 kollast:1 hallikaspruun. Tegelikult on see suhe aga 2:1, sest YlYl homosügoote ei sünni.   4.1.5. Geeni produkt on polüpeptiid Polüpeptiidid on makromolekulid, mis koosnevad aminohapetest. Igas organismis sünteesitakse tuhandeid erinevaid polüpeptiide, mis erinevad üksteisest aminohappeliselt järjestuselt. Polüpeptiidid on aluseks valkudele. Valke, mis katalüüsivad biokeemilisi reaktsioone, nimetatakse ensüümideks. Osa valke on raku struktuurseteks komponentideks, samuti on transpordifunktsioonidega valke. Beadle ja Tatum postuleerisid, et iga geen vastutab konkreetse polüpeptiidi sünteesi eest. Kui geenis on mutatsioon, siis vastavat polüpeptiidi kas ei sünteesita või on sünteesiprodukt muutunud funktsioonidega. Need muutused kajastuvad ka fenotüübilistes muutustes.   4.1.6. Mis määrab selle, et osa mutatsioone on dominantsed, osa aga retsessiivsed? Retsessiivsete mutatsioonide tagajärjel kaotab geen oma funktsiooni, mis viib selleni, et vastavat polüpeptiidi enam ei sünteesita või on sünteesitud polüpeptiid mittefunktsionaalne. Seega on retsessiivsete mutatsioonide puhul tegemist funktsiooni kaotanud alleelidega. Dominantse mutatsiooni puhul sünteesitakse aga polüpeptiid, mis käitub võrreldes algse polüpeptiidiga teisiti. Seetõttu nimetatakse dominantseid mutatsioone sisaldavaid alleele neomorfseteks, uue funktsiooni omandanud alleelideks. Dominantsete mutatsioonide näiteks võib tuua mutatsiooni hiire T geenis. Heterosügootses olekus põhjustab see mutatsioon hiire saba lühenemist, homosügootsed järglased hukkuvad aga juba embrüostaadiumis. T geen kodeerib 436 aminohappe pikkust polüpeptiidi, mis on võimeline seonduma DNA-ga ja reguleerima hiire normaalseks arenguks vajalike geenide avaldumist. Mutantse geeni produkt on lühem ja muutunud struktuuriga ning häirib heterosügootides normaalse valgu seondumist DNA-ga, muutes arenevas lootes geenide avaldumise taset. Seetõttu ongi mutantset alleeli kandvad hiired lühema sabaga. Kahte dominantset alleeli kandvates homosügootides on aga paljude arengubioloogiliselt oluliste geenide avaldumine häiritud, mistõttu järglasi ei sünni. Siinkohal tasub siiski märkida, et paljud dominantsed mutatsioonid võivad olla seotud just funktsiooni kadumisega.     4.2. Geenide fenotüübilist avaldumist mõjutavad tegurid   4.2.1. Keskkonna mõju geenide avaldumisele Sama geeni erinevate alleelide poolt kodeeritud produktid võivad olla erineva temperatuuritundlikkusega. Näiteks mutatsiooni shibire kandvad äädikakärbsed on elujõulised ja sigimisvõimelised 25° C juures, kuid paralüseeruvad ootamatu shoki, näiteks raputamise tagajärjel (shibire tuleneb jaapanikeelsest sõnast tähendusega “paralüseeruma”). Kui mutantsete kärbeste kultuur viia aga 29° C juurde, paralüseeruvad nad ka ilma raputamata.   4.2.2. Keskkonna mõju inimese geenidele Fenüülketonuuria (PKO) on retsessiivne haigus, kus on häiritud aminohapete metabolism. Sellise kahjustusega homosügootsetel lastel puudub fenüülalaniini hüdroksülaas, mis muudab fenüülalaniini türosiiniks. PKO haigetel kogunevad fenüülalaniin ja selle derivaadid organismi ning häirivad närvirakkude arengut, mistõttu sellised lapsed on vaimsete puuetega. Kuna PKO patsientidel on türosiini tase organismis normaalsest madalam, on neil melaniini sünteesitase madalam ning seetõttu ka nõrgem pigmentatsioon. Euroopa rahvastel on keskmiselt üks haigusjuht 10000 sünni kohta. PKO-d saab ravida dieediga, kus fenüülalaniini kogus on võrreldes tavalise toiduga tunduvalt madalam. Kui imikul on tuvastatud PKO ja tema toitmisel peetakse kinni dieedist, kasvab vaimselt normaalne laps. Ka bioloogiline keskkond, näiteks indiviidi sugu, võib mõjutada geenide avaldumistaset. Näiteks kiilaspäisus areneb nii heterosügootsetel kui ka homosügootsetel meestel, homosügootsetel naistel on see tavaliselt seotud aga üksnes juuste hõrenemisega. Vastava alleeli avaldumise käivitab testosteroon, mille kogus mehe organismis on märksa kõrgem.   4.2.3. Penetrantsus ja ekspressiivsus Penetrantsus on sagedus protsentides, millega mingi konkreetne genotüüp avaldub selle kandjate fenotüübis. Mittetäieliku penetrantsuse näiteks võib tuua polüdaktüülia, defekti, mille tagajärjel arenevad indiviidil lisasõrmed ja varbad. Kuigi mutatsioon on dominantne, ei avaldu defekt kõigil heterosügootidel. Mittetäielik penetrantsus takistab sugupuude analüüsi. Tavaliselt kasutatakse penetrantsuse mõistet mingi dominantse mutantse alleeli avaldumissageduse hinnanguna heterosügootide hulgas. Penetrantsus sõltub nii indiviidi geneetilisest taustast kui ka elukeskkonnast. Ekspressiivsuse kaudu kirjeldatakse geeni fenotüübilise avaldumise taset. Konkreetne geen võib erinevates indiviidides avalduda erineval tasemel. Enamasti jälgitakse mutantse alleeli avaldumist. Näiteks dominantset lobe mutatsiooni kandvatel äädikakärbestel on silmakuju sagaraline, kuid erinevatel isenditel on sagaralisuse aste erinev. Nii mittetäieliku penetrantsuse kui ka erineva ekspressiivsuse põhjusteks erinevates indiviidides on tunnuste komplekssus, konkreetne fenotüüp on seotud kahe või enama geeni avaldumisega. Ka Hapsburgidele iseloomulik etteulatuv alalõug, mis oli levinud Euroopa kuningakodades, on tunnus, mis avaldub erinevatel indiviididel erineval määral.   4.3. Geenidevaheline interaktsioon Bateson ja Punnett näitasid katseliselt, kuidas 2 erinevat geeni kontrollivad sama tunnust, näiteks geenid R ja P harjakuju kanadel. Wyandottidel (RR pp) on roosikujuline hari, brahmadel (rr PP) aga hernekujuline. F1 hübriidsetel tibudel (Rr Pp) on pähklikujuline hari. Kui neid hübriide ristata omavahel, toimub harjakujus lahknemine 9/19 pähklikujulised (R- P-) , 3/16 roosikujulised (R-pp), 3/16 hernekujulised (rr P-) ning 1/16 harilikud (rr pp). Hariliku harjaga leghornid on mõlema retsessiivse alleeli suhtes homosügootsed.   4.3.1. Epistaas Epistaas (tuleneb kreekakeelsest sõnast tähendusega “seisab kõrgemal”) on ühe geeni tõkestav, pärssiv või varjutav toime teise geeni avaldumisele. Need geenid, mida allutatakse, on hüpostaatilised. Näiteks mutatsioon white on epistaatiline mutatsiooni cinnabar suhtes. Kui äädikakärbsed kannavad mõlemat retsessiivset mutatsiooni homosügootses olekus, on nende silmavärvus ikkagi valge. Selgus, et geen white kodeerib polüpeptiidi, mis transpordib pigmendi kärbse silmarakkudesse. Punast pigmenti sünteesitakse teistes kudedes. Kui vastavat transportvalku ei sünteesita, jäävad kärbeste silmad valgeks. Valgete (CC pp) ja (cc PP) õitega suhkruherneste ristamisel saadi F1 põlvkonnas purpursete õitega (Cc Pp) järglased, kuid F2 põlvkonnas toimus lahknemine suhtega 9/16 purpursed ning 7/16 valged. Valged olid kõik need, kus vähemalt üks retsessiivsetest alleelidest oli homosügootses olekus. Selgus, et dominantsed alleelid C ja P kodeerivad erinevaid etappe antotsüaani sünteesiks: Geen C P Eellane ® Vaheühend ® Antotsüaan Kui ühte ensüümidest ei produtseerita, on antotsüaani süntees blokeeritud. Kui epistaatilise geeni ainsaks avaldumisviisiks on teise geeni pärssimine, nimetatakse teda inhibiitor- või supressorgeeniks.   4.3.2. Pleiotroopsus Pleiotroopne geen mõjutab samaaegselt erinevaid tunnuseid. Ka eelpoolkirjeldatud fenüülketonuuria on pleiotroopsuse näide. Mitme tunnuse üheaegne patogeenne muutus on sündroom. Enamasti on pleiotroopsus tingitud ühe geeniprodukti osalemisest erinevates ainevahetusreaktsioonides või erinevate rakutüüpide vahelises kommunikeerumises ja arenguprotsessides.   4.3.3. Pideva fenotüübilise varieeruvuse geneetiline baas Sama liigi piires varieeruvad ulatuslikult sellised tunnused nagu organismide kasv, kaal, mille väärtus on määratud paljude geenide ja keskkonna kombineeritud koostoimega.       5. Kromosoomid kui pärilikkuse kandjad   5.1. Kromosoomid Kromosoomid avastati 19. sajandi teisel poolel saksa tsütoloogi W. Waldeyeri poolt. Kasutades erinevaid värvimistehnoloogiaid on nad kõige paremini jälgitavad jagunevates rakkudes. Interfaasis ei ole individuaalsed kromosoomid eristatavad, difuusset materjali, mis värvub, nimetatakse kromatiiniks. Kromatiini erinevad regioonid värvuvad erinevalt – nõrgemini eukromatiin ning tugevamini heterokromatiin, kus DNA kondensatsiooniaste on suurem.   5.1.1. Kromosoomide arv Liigisiseselt on kõigil isenditel kromosoome kindel põhiarv n korduses. Tavaliselt on kordsusaste 2. Inimese kromosoomide põhiarv on 23: sugurakkudes on 23 kromosoomi (22 autosoomi + X või Y kromosoom) - haploidse genoom (n) ning somaatilistes rakkudes 46 kromosoomi – diploidne genoom (2n). Mõnedes maksarakkudes on kordsusaste 4 – sel juhul on tegemist tetraploidse genoomiga (4n) ning sel juhul on rakus 92 kromosoomi. Kromosoomide põhiarv erineb liigiti, kuid ei sõltu organismi keerukusastmest. Näiteks muntjakil (Aasias elutsev hirv) on 3 kromosoomi, aga osadel sõnajalgadel on neid mitusada. Enamikel juhtudel jääb see arv 10 ja 40 vahele.   5.1.2. Sugukromosoomid Sugukromosoomide arv võib liigiti varieeruda. Rohutirtsudel on emastel üks sugukromosoom rohkem kui isastel: emastel on kaks X kromosoomi ning isastel üks. Seega on emased tsütoloogiliselt XX ning isased XO (O tähistab kromosoomi puudumist). Emaslooma rakkude meiootilise pooldumise käigus X kromosoomid paarduvad (konjugeeruvad) ja seejärel lahknevad ning kõigisse sugurakkudesse jääb üks X kromosoom. Isaslooma organismis jäävad aga pooled seemnerakud ilma X kromosoomita. Munaraku viljastamisel moodustuv sügoot sisaldab seega kas üks või kaks X kromosoomi, andes aluse kas isaste või emaste tirtsude arenguks. Paljudel teistel loomadel ning ka inimesel on mõlemal sugupoolel võrdne arv sugukromosoome. Isaste (XY) sugukromosoomid lahknevad meioosi käigus, produtseerides võrdsel arvul X ja Y kromosoomi sisaldavaid gameete. Inimese puhul peaks viljastumise tulemusena tekkima teoreetiliselt XY ja XX sügoote. Tegelikult on Y kromosoomi sisaldavatel seemnerakkudel võrreldes teistega viljastamisel väike eelis – nii on XY:XX suhe 1,3:1. Kuna XY embrüod on võrreldes XX embrüotega vähem eluvõimelised, on sünnimomendiks see suhe juba 1,07:1 ning paljunemisikka jõudmisel on meeste ja naiste suhe 1:1. Inimese Y kromosoom on X kromosoomist morfoloogiliselt eristatav: ta on tunduvalt lühem ning Y kromosoomi tsentromeer paikneb ühe kromosoomi otsa lähedal. Ühist geneetilist materjali on X ja Y kromosoomil vähe.   5.2. Pärilikkuse kromosoomiteooria 5.2.1. Eksperimentaalsed tõendid selle kohta, et geenide päritavus on seotud kromosoomidega Selle sajandi algul näitas Thomas Morgan, et teatav äädikakärbse Drosophila melanogaster silmavärvust mõjutav geen paikneb X kromosoomis. Tegemist oli silmade valget värvust põhjustava retsessiivse mutatsiooniga, mis avaldus ainult isastel kärbestel. Valgesilmsete mutantsete (w) isaste ristamisel homosügootsete (w+) emastega olid mõlemast soost järglased punaste silmadega, kuid hübriidide järgmises põlvkonnas olid kõik emased endiselt punaste silmadega, isastest aga ainult pooled. Morgan järeldas, et punast silmavärvust andev geen paikneb X kromosoomis. Kui on tegemist X kromosoomis paikneva geeniga ning isased on saanud mutantne alleeliga X kromosoomi, on kõik sellised isased valgete silmadega. Kuna tegemist on aga retsessiivse mutatsiooniga, siis on heterosügootsed emased punasesilmsed, sest kannavad lisaks mutantsele ka metsiktüüpi alleeli. Organismi, mis sisaldab ainult ühte geenikoopiat, nimetatakse hemisügootseks. Heterosügootsete emaste ristamisel valgesilmsete isastega saadi ka valgesilmseid homosügootseid emaseid, kes sisaldasid mõlemas X kromosoomis mutantset alleeli.   5.2.2. Geenid paiknevad kromosoomides lineaarselt Morgani grupp uuris geenide paiknemist äädikakärbse kromosoomides. Olles lokaliseerinud hulgaliselt erinevaid mutatsioone, leiti, et erinevad geenid asetsevad kromosoomis teatavates kohtades – lookustes. Edasi oli võimalik juba koostada geneetilisi kaarte ning arvutada geenidevahelisi suhtelisi kaugusi. Nii tuldi välja pärilikkuse kromosoomiteooriaga, mille kohaselt kõik geenid paiknevad kromosoomides ning Mendeli seadused tulenevad sellest, milliste seaduspärasuste alusel toimub kromosoomide lahknemine sugurakkudes ning sattumine järglaskonda.   5.2.3. Kromosoomide mitteeraldumine raku jagunemisel Morgani tudeng Bridges näitas, et ebanormaalne arv sugukromosoome XXX, XXY, XO või YO põhjustab äädikakärbsel muutusi fenotüübis. Ta ristas mutantseid homosügootseid valgesilmseid emaseid (ww) punasesilmsete isastega (w+) ning leidis, et ebaootuspäraselt oli järglaskonnas ka üksikuid valgesilmseid emaseid ning punasesilmseid isaseid. Teoreetiliselt oleksid pidanud kõik emased järglaskonnas olema punasesilmsed ning isased valgesilmsed. Neil vähestel eranditel oli kahe sugukromosoomi asemel kas kolm või üks. Sugukromosoomide ebanormaalset arvu järglaskonnas põhjustas X kromosoomide mittelahknemine meioosiprotsessis. Selle tagajärje tekkisid kahte X kromosoomi sisaldavad ja X kromosoomita munarakud. Selliste munarakkude viljastamisel moodustusidki XXY sügoodid, millest arenesid valgesilmsed emased ning XO sügoodid, millest arenesid punasesilmsed isased, kes olid sigimisvõimetud. Viljastamisel tekkis ka XXX ja YO sügoote, millest ei tulnud eluvõimelist järglaskonda. Seega olid ka Bridges’e katsetulemused heaks tõendusmaterjaliks pärilikkuse kromosoomiteooriale. Lisaks näitasid Bridges’e katsed X kromosoomi tähtsust Drosophila soo määramisel (XXY järglased on emased!). Selleks, et organism oleks vitaalne, on vajalik vähemalt ühe X kromosoomi olemasolu, sest YO sügootidest ei arenenud eluvõimelisi järglasi.     5.2.4. Mendeli seadused lähtudes kromosoomiteooriast   5.2.4.1. Lahknemisseadus Raku esimese meiootilise jagunemise käigus homoloogilised kromosoomid paarduvad. Üks homoloog on pärit emalt, teine isalt. Kui ema on homosügootne alleeli A suhtes ja isa sama geeni alleeli a suhtes, on järglaskond Aa. Anafaasis, pärast esimest meiootilist jaotumist liiguvad Aa heterosügootide kromosoomid, mis sisaldavad alleele A ja a, raku erinevatele poolustele ning satuvad tütarrakkudesse   5.2.4.2. Sõltumatuse seadus e. sõltumatu lahknemisseadus Ka see seadus baseerub anafaasis toimuval lahknemisel. Kui AA BB emaseid ristata näiteks aa bb isastega, on järglased Aa Bb. Esimese meioosi profaasis paarduvad kromosoomid alleelidega A ja a ning B ja b. Metafaasis reastuvad nad homoloogiliste paaridena kahel võimalikul viisil, kas A/a B/b või A/a b/B. Sõltuvalt sellele, kuidas on toimunud reastumine, liiguvad anafaasis erinevatele poolustele koos A ja B alleeliga ning a ja b alleeliga kromosoomid või hoopis alleele A ja b ning a ja B kandvad kromosoomid. Mõlemad võimalused realiseeruvad võrdse tõenäosusega. Pärast meiootilisi jagunemisi sisaldavad pooled gameetidest vanematega identset alleelikombinatsiooni, pooled aga uut (A b või a B). Nii moodustubki heterosügootsetel järglastel (F1 põlvkond) neli tüüpi gameete. Seega tagab kromosoomide lahknemine meioosis geenide sõltumatu lahknemise.   5.3. Suguliitelised geenid inimesel X-liitelised retsessiivsed alleelid on märksa kergemini tuvastatavad kui retessiivsed autosoomsed alleelid.   5.3.1. Hemofiilia Hemofiiliat põhjustab X-liiteline mutatsioon, mille kandjatel ei sünteesita vere hüübimiseks vajalikku faktorit. Ilma terapeutilise vahelesegamise võib hemofiilikutel ka tühisem haav põhjustada verest tühjaks jooksmist. Peaaegu kõik selle puudega indiviidid on mehed. Hemofiilia juhtumeid esines ka Venemaa tsaari Nikolai II perekonnas. Tal oli 4 tütart ja üks poeg. Poeg Aleksei kannatas hemofiilia all, olles vastava alleeli saanud oma emalt, kes oli heterosügoot. Tsaarinna Aleksandra oli Inglismaa kuninganna Victoria tütretütar ning ka Victoria ise oli hemofiilia alleeli kandja.   5.3.2. Värvipimedus Inimesel on värvuse tajumine vahendatud kolme valgust neelava valgu poolt – üks neist neelab sinist valgust, teine rohelist ja kolmas punast. Ükskõik, milline neist valkudest on defektne, tagajärjeks on värvipimedus. Kõige klassikalisem värvipimeduse näide on võimetus eristada rohelist ja punast värvust. Neid värve ei suuda eristada ligikaudu 10-15% meestest ning alla 1% naistest. X kromosoomis on leitud 2 geeni, millest üks kodeerib rohelise valguse retseptorit, teine punase valguse retseptorit. Sinise valguse retseptorit kodeeriv geen on autosoomis.   5.3.3. Fragiilne X Paljud vaimse alaarenguga nähud on seotud muutustega X-liitelistes geenides. Fragiilse X-i sündroom avaldub lastel sagedusega 1:2000. Fragiilne X on X-liiteline dominantne kahjustus mittetäieliku penetrantsusega. Puuetega (vaimse alaarenguga) on heterosügootsed naised ja hemisügootsed mehed. On ka üksikuid erandeid, kus sümptomid ei avaldu. Haigust põhjustab geeniga FMR1 külgneva DNA järjestuse CGG kordistumine X kromosoomi otsa lähedal. Kui normaalses kromosoomis on 5-60 CGG kordust, siis mutantses kromosoomis on seda kordust DNA replikatsiooni tagajärjel kuni 1000 koopiat, mis mõjutab kordusega külgnevate geenide avaldumist. Fragiilse X-i sündroomi põhjustav mutatsioon on metafaasi kromosoomidel tsütoloogiliselt jälgitav. Tundub, nagu oleksid kromosoomi otsad murdumas.   5.3.4. Y kromosoomi-spetsiifilised geenid Teatakse ainult väheseid. Üks neist kodeerib H-Y antigeeni. On teada ka geen, mis kodeerib testiste arenguks ning mehe seksuaalsete tunnuste väljakujunemiseks vajalikku faktorit TDF.   5.3.5. Geenid, mis paiknevad mõlemas sugukromosoomis Mõned geenid on olemas nii X kui ka Y kromosoomis, paiknedes enamasti lühikese õla otsa lähedal. Nende geenide poolt kodeeritud tunnused päranduvad järglastele samal viisil nagu autosoomsete geenide poolt kodeeritud tunnused. Sellepärast nimetatakse neid geene ka pseudoautosoomseteks geenideks.     5.4. Soo määramine sugukromosoomide poolt   5.4.1. Soo määramine inimesel Erinevalt äädikakärbsest määrab inimesel ja teistel imetajatel soo Y kromosoomi olemasolu. XO indiviidid on naissoost ja XXY indiviidid meessoost. Y kromosoomis paiknev geen SRY kodeerib faktorit TDF (testis-determining factor). Selle geeni homoloog on leitud ka hiirel. TDF on regulaatorvalk, mis seondub DNA-ga, kontrollides nii teiste geenide avaldumist, mis on vajalikud testiste arenemiseks. Pärast testiste formeerumist kutsub testosterooni sekretsioon esile meessoole iseloomulike tunnuste väljakujunemise. Testosteroon on hormoon, mis seondub paljude rakutüüpide retseptoritele. Juhul, kui testosterooni signaalsüsteem on häiritud, need tunnused ei ilmne ning arenevad välja hoopis naissoole iseloomulikud tunnused.   5.4.2.Soo määramine äädikakärbsel Normaalsel diploidsel kärbsel on 2 sugukromosoomi (XX või XY) ning 3 paari erinevaid autosoome (AA – A näitab ühte haploidset autosoomide kogumit, 2A diploidset). Soo määrab X kromosoomide suhe autosoomide kordsusesse: normaalsetel isastel on see suhe 0,5 (1X:2A) ning normaalsetel emastel 1,0 (2X:2A). 2X:3A ning 3X:4A puhul jääb suhe 0,5 ja 1,0 vahele ning arenevad mõlemad sootunnused (intersex), 2X:4A puhul on suhe 0,5 ning kärbsed isased. Põhiline geen, mille avaldumine mõjutab sugu, on X-liiteline geen Sxl. Kui X:A suhe on suurem või võrdne ühega, on Sxl geen aktiivne ja sügoodist areneb emane kärbes; kui see suhe on väiksem või võrdne 0,5-ga, on geeni avaldumine alla surutud ja järglased tulevad isased.   5.4.3. Soomääramine teistel loomadel Kui isasloomal on kaks erinevat sugukromosoomi, X ja Y, nimetatakse tema sugu ka heterogameetseks. Emased, kes kannavad kahte X kromosoomi, on homogameetsed. Lindudel, liblikatel ja ka mõnedel roomajatel on olukord vastupidine: isased on homogameetsed (ZZ) ja emased heterogameetsed (ZW). Mesilastel on sugu määratud ploidsusega e. kordsusega. Diploidsed embrüod, mis arenevad viljastatud munarakust, arenevad emasteks, haploidsed embrüod, mis pärinevad viljastamata munarakkudest, aga isasteks. Vastse toitmisest sõltub, kas emane valmik saab olema viljakas (emamesilane) või steriilne (töömesilane). Et haploidsuse-diploidsuse süsteem jääks kehtima ka järglaskonnas, toimub munarakkude valmimine läbi meioosiprotsessi, seemnerakkude valmimine aga mitootilise jagunemise teel.   5.5. X-liiteliste geenide doosi kompensatsioon Kui emastel indiviididel on kaks X kromosoomi ning isastel ainult üks, siis kuidas saavutatakse see, et X-liiteliste geenide avaldumise tase on mõlemal juhul võrdne?   5.5.1. Drosophila X-liiteliste geenide hüperaktivatsioon isastel Juhul, kui geeni Sxl produkti rakus pole (isased), seondub teatav valkkompleks paljudesse kohtadesse X-kromosoomil ja võimendab X-liiteliste geenide avaldumise taset kaks korda. Kui rakus on ka Sxl geeni produkti piisavalt, takistab see valkkompleksi seondumist ja seega ka geenide aktiivsuse tõusu.   5.5.2. X-liiteliste geenide inaktivatsioon imetajatel Emastel on üks X kromosoomidest rakkudes inaktiivses olekus. Valik on juhuslik – seega on osadel juhtudel inaktiivne isalt päritud X, osadel aga emalt saadud X kromosoom. Seega sisaldavad nad võrdsel hulgal mõlemat tüüpi rakke, olles seetõttu X kromosoomi suhtes geneetilised mosaiigid. Emasloom, kes on heterosügootne X-liitelise geeni suhtes, võid omada samaaegselt kahte erinevat fenotüüpi. Näiteks kassidel ja hiirtel avaldub fenotüübiline mosaiiksus karva pigmentatsioonis. Kassidel kodeerib üks alleel tumedat pigmenti ning teine alleel oranzhi pigmenti. Heterosügootsed emakassid on laigulised, kilpkonna värvi. X kromosoomi pikas õlas on piirkond, millest geenide inaktivatsioon levib mõlemas suunas. Vastavat initsiaatorkohta nimetatakse X-inaktivatsiooni keskuseks XIC (X-inactivation center). See keskus on väga lähedal geenile XIST, millel arvatakse olevat oluline roll inaktivatsiooni protsesis. Inaktiveeritud X kromosoom erineb teistest kromosoomidest, kuna inaktiivse X kromosoomi DNA on tugevalt keemiliselt modifitseeritud, metüleeritud. Lisaks on ta tugevamalt kondenseerunud, moodustades intensiivselt värvuvaid Barri kehakesi (nimetatud tsütoloogi Murray Barr järgi, kes need kehakesed esmakordselt tsütoloogiliselt tuvastas). Barri kehake kinnitub tuumamembraani sisepinnale ning tema replikatsioon ei ole teiste kromosoomidega sünkroonne. Sugurakke tootvates kudedes on ta reaktiveeritud, sest oogeneesis on vajalik, et mõnede X-liiteliste geenide mõlemad geenikoopiad oleksid aktiivsed.     6. Eerinevused kromosoomide arvus ja struktuuris 6.1. Kromosoomide uurimise tsütoloogilised meetodid Kromosoomide arvu ja struktuuri on võimalik uurida, värvides jagunevaid rakke teatavate värvidega ning vaadeldes värvunud kromosoome mikroskoobis. Vastavat teadusala, mis sellega tegeleb, nimetatakse tsütogeneetikaks. Kaasajal on tsütogeneetikal oluline rakenduslik väärtus meditsiinis. Tänu tsütogeneetikas kasutatavatele meetoditele on võimalik diagnoosida haigusi, mis on seotud kromosoomianomaaliatega.   6.1.1. Mitoosikromosoomide analüüs Enamus tsütoloogilisi uuringuid teostatakse mitoosi metafaasi kromosoomidega, sest siis on need kõige paremini jälgitavad. Näiteks eraldatakse inimese verest valged vererakud ning kasvatatakse neid kultuuris, lisades kemikaale, mis stimuleerivad rakkude jagunemist. Metafaasi jõudnud rakke töödeldakse kemikaaliga, mis kahjustab mitoosikäävi ning peatab mitoosiprotsessi. Seejärel töödeldakse rakke hüpotoonilise lahusega, mille tulemusena rakud imevad end vett täis. Rakud lõhkevad vees ning laialipaiskunud kromosoome uuritakse mikroskoobiga. Pikka aega arvati, et inimesel on 48, mitte aga 46 kromosoomi. Alles tänu selle meetodi kasutusele võtmisele suudeti inimesel määrata tegelik kromosoomide arv. Kromosoomide nähtavale toomiseks kasutatakse erinevaid värve. Kuni 70-ndate aastate alguseni oli kasutusel Feulgen’i reagent, mis on purpurse värvusega ning reageerib DNA-s olevate suhkrujääkidega. Kuigi rutiinseks analüüsiks on see reagent veel praegugi kasutusel, kasutatakse detailsemateks uuringuteks DNA-ga interkaleeruvaid värve. Näiteks quinacrine’ga värvides tulevad kromosoomides esile vöödid. Kuna tegemist on fluorestseeruva värviga, vaadeldakse preparaate UV-kiirguses. Igale kromosoomile on iseloomulik kindel vöödilisuse muster. UV-kiirguses helendavaid vööte on hakatud nimetama Q-vöötideks. Kasutatakse ka mittefluorestseeruvaid värve, näiteks Giemsa värvi. Sel juhul ilmuvad sõltuvalt sellest, kuidas kromosoomipreparaati eelnevalt on töödeldud, kas G- või R-vöödid. R-vöötide puhul värvuvad alad, mis G-vöötide puhul olid heledad ja vastupidi.   6.1.2. Inimese karüotüüp Inimesel on 46 kromosoomi: 44 autosoomi ja 2 sugukromosoomi. Autosoome tähistatakse suuruse alanevas järjekorras numbritega 1 – 22. Kõige suurem on 1. kromosoom ja kõige väiksem 21. kromosoom (ajaloolistel põhjustel on teine peaaegu sama väike autosoom tähistatud number 22-ga). X kromosoom on vahepealse suurusega ning Y kromosoom umbes sama suur kui 22. kromosoom. Indiviidi kromosoomistiku tunnustekogumit, mida iseloomustab kromosoomide arv, suurus, tsentromeeri asukohast olenev kuju ja värvimuster (vöödilisus) nimetatakse karüotüübiks. Indiviidi karüotüübi uurimiseks kasutatavat kromosoomistiku süstematiseeritud fotokujutist ühe raku metafaasikromosoomidest, kus kromosoomipaarid on reastatud ja rühmitatud suuruse, kuju ja vöödimustri järgi, nimetatakse karüogrammiks. Suuruse ja kuju alusel jaotatakse inimese autosoomid 7-sse rühma A – G (A - suured metatsentrikud (tsentromeer on kromosoomi keskel); B - suured submetatsentrikud; C - keskmised submetatsentrikud; D - suured akrotsentrikud (tsentromeer ühes kromosoomi otsas); E - väikesed submetatsentrikud; F - väikesed metatsentrikud; G - väikesed akrotsentrikud. Kromosoomi lühemat õlga tähistatakse tähega p (prantsusekeelsest sõnast petite tähendusega “väike”) ning pikemat õlga tähega q (järgneb tähestikus p-le). Nii on 5-nda kromosoomi väike õlg tsütogeneetikute kirjapildis 5p.   6.1.3. Meioosikromosoomide analüüs Võrreldes mitoosikromosoomidega on meioosikromosoome tunduvalt raskem tsütoloogiliselt analüüsida. Ja seda mitmel põhjusel. Esiteks, meiootiline jagunemine toimub ainult spetsiifilistes kudedes sugurakkude moodustumisel. Teiseks, meiootiliselt jagunevaid rakke on laboritingimustes raske kultiveerida. Klassikalised meioosikromosoomide uuringud on teostatud taimse materjaliga, mis pärineb maisilt või erinevatelt liilialistelt. Taime õitelt eraldatakse paljunemisorganid ja kraabitakse materjali sugurakke tootvast koest. Meioosikromosoome on uuritud ka kõrgematel loomadel, kaasa arvatud inimene, kuid sel juhul tuleb vajaliku materjali hankimiseks kasutada kirurgiat.   6.1.4. Tsütogeneetiline varieeruvus Samatüübiliste e. homoloogiliste kromosoomide kordsust indiviidi või raku kromosoomistikus nimetatakse ploidsuseks. Ploidsust kirjeldatakse kromosoomide basaalarvu n (kromosoomide arv ühes kromosoomikomplektis) kaudu. Diploidsetes rakkudes on 2 kromosoomikomplekti, seega 2n kromosoomi, triploidsetes 3, seega 3n jne. Organisme, mis sisaldavad täielikku, normaalset kromosoomikomplekti, nimetatakse euploidseteks, vastandina aneuploidsetele organismidele, kus mõni kromosoom komplektist on üle- või alaesindatud. Polüploidsed on organismid, mille rakud sisaldavad lisaks normaalsele kromosoomide arvule ühte või mitut lisakromosoomikomplekti.   6.2. . Polüploidsus Võrreldes loomadega on polüploidsus enam levinud taimede puhul, kuna paljud taimed on võimelised paljunema mitteseksuaalsel teel, vegetatiivselt. Loomadel, kes üldjuhul paljunevad seksuaalsel teel, on polüploidsus harv, sest see takistaks soomääramise mehhanismi toimimist. Polüploidide rakud on suuremad, sageli kajastub see ka organismi enda suuremas kasvus. Sellised taimed produtseerivad suuremaid seemneid ja vilju ning on suuremate õitega, mis on eriti soodne toiduks kasutatavate taimede ja ilutaimede puhul.   6.2.1. . Steriilne polüploidsus Paljud polüploidsed liigid on steriilsed, kuna meioosi käigus lahknevad kromosoomid ebaregulaarselt, mille tulemusena moodustuvad aneuploidsed gameedid. Kui sellised gameedid ühinevad viljastumisel, ei arene sügootidest elujõulisi järglasi. Näiteks triploidse taime gameetide moodustumisel paarduvad meioosi alguses kaks homoloogilist kromosoomi, kolmas jääb aga üksinda. On ka võimalus, et kõik 3 homoloogi ühinevad. Homoloogiliste kromosoomide lahknemisel anafaasis on variante palju: mõned homoloogilistest kromosoomidest liiguvad kõik ühele poolusele, mõned kahekaupa, mõned üksikult. Kuna triploidsed taimed on steriilsed, paljundatakse neid vegetatiivselt (banaanid, teatud õunapuu sordid, tulbid). Polüploidsed taimed võivad looduslikult paljuneda apomiksise teel (näit. võilill). Sel juhul arenevad seemned modifitseeritud meioosi läbinud munarakkudest, kus kromosoomide arv ei ole vähenenud. 6.2..2. Viljakad polüploidid Enamis tetraploide on samuti steriilsed, kuid on ka erandeid. Täpsemad uuringud näitasid, et sellised tetraploidid sisaldasid kahte erinevat kromosoomikomplekti, mis pärinesid liigiliselt lähedastelt eellastelt. Hübriidis kromosoomid duplitseerusid, moodustades tetraploidi. Meioosis paardusid ühelt eellaselt pärinevad homoloogilised kromosoomid omavahel ning teiselt eellaselt pärinevad jällegi omavahel ning jaotusid seejärel regulaarselt. Nii sattus kõigisse sugurakkudesse võrdne arv kromosoome. Sel viisil paljuneb näiteks ka laialdaselt kasutusel olev teravili nisu, mis on heksaploidne (sisaldab kolme erinevat kromosoomikomplekti 7-st kromosoomist, mis duplitseerusid, nii et somaatilistes rakkudes on 42 ja sugurakkudes 21 kromosoomi). Lähis-Idast on praegugi veel leitud 7 kromosoomiga nisu metsikuid eellasi. Seega on polüploidid, mis saadakse erinevate liikide hübridiseerimisel (allopolüploidid), märksa suurema tõenäosusega viljakad kui need, mida saadakse sama liigi siseselt (autopolüploidid), sest esimesel juhul tekib kromosoomide lahknemisel vähem kõrvalekaldeid. 6.2.3. Polüploidsuse teke Lisaks kromosoomide duplitseerumisele liikidevahelistes hübriidides võivad polüploidsed taimed areneda ka meristeemirakkude mitoosihäirete tagajärjel. Näiteks ei lahkne tütarkromatiidid mitoosi käigus ning selle tulemusena moodustuvad tetraploidsed rakud. Kui selliseid rakke sisaldavast koest kasvatada uus taim, ongi see tetraploidne. Kromosoomide kahekordistumine võib aset leida ka meioosis, kui ükskõik kummas meiootilises jagunemises kromosoomid ei lahkne ning moodustuvad diploidsed gameedid.   6.2..4. Katsed luua uusi polüploide laboritingimustes 1920-ndatel aastatel üritas vene teadlane Karpechenko luua redise ja kapsa hübriidi. Tal õnnestuski saada viljakad hübriidid, kuid kahjuks realiseerus erinevalt oodatule (taimedel on redise juur ja kapsa lehed) hoopis vastupidine variant, mis oli täiesti söödamatu. Katseliselt indutseeritakse polüploidide teket sageli mitoosikäävi mürkidega, näiteks kolhitsiiniga.   6.2..5. Koe-spetsiifiline polüploidsus ja polüteenia Mõnede organismide puhul muutuvad mõned koed arengu käigus polüploidseteks, kusjuures ülejäänud jäävad diploidseteks. Polüploidsus kujuneb vastuseks vajadusele suurendada geenikoopia arvu raku kohta. Vastavat protsessi nimetatakse endomitoosiks, sest see sisaldab rakusisest kromosoomide duplitseerumist ja tütarkromatiidide lahknemist, kuid mitte raku pooldumist. Inimesel leidub endomitoosi teel moodustunud tetraploidseid rakke maksas ja neerus. Polüploidiseerumine võib toimuda ka sel viisil, et tütarkromatiidid ei eraldu. Nii moodustuvad polüteenkromosoomid, mis võivad koosneda paljudest paralleelselt kulgevatest kromosoomi replikatsiooniproduktidest. Kõige silmatorkavamad polüteenkromosoomid on kirjeldatud Drosophila vastsete süljenäärmetes. Iga kromosoom replitseerub 9 tsüklit, mille tagajärjel tekib 500 koopiat. Kõik koopiad paarduvad omavahel ning mikroskoopiliselt on polüteenkromosoomid jälgitavad jämedate kimpudena juba väikese suurendusega. Kromatiini kondenseerumisaste on polüteenkromosoomide erinevates piirkondades erinev. Seetõttu tulevad värvimisel nähtavale heledad ja tumedad vöödid, võimaldades analüüsida kromosoomi struktuuri. Polüteenkromosoomidel on kaks iseloomulikku omadust: Homoloogilised polüteenkromosoomid paarduvad ka somaatilistes rakkudes. Paardumine on täpne, mistõttu igale kromosoomile iseloomulikud vöödid on veelgi paremini jälgitavad. Polüteenkromosoomide tsentromeerid moodustavad tugevalt värvuva struktuuri, mida nimetatakse kromotsentriks. Kromotsentriga külgnev ala värvub samuti tugevalt. Kromosoomi õlad, mis on vöödilised, koosnevad eukromatiinist, kus paikneb enamus geenidest. Tugevalt värvunud ala kosneb heterokromatiinist, milles on väga vähe geene. Polüteenkromosoomid on jälgitavad interfaasi rakkudes. Just see teebki nad oluliseks, sest muidu on kromosoomide ehitust võimalik uurida üksnes jagunevates rakkudes. Polüteenkromosoome on leitud ka paljudel teistel kärbestel ning moskiitodel.    6.3. Aneuploidsus Aneuploidsus kirjeldab olukorda, kus üksik kromosoom on võrreldes ülejäänutega erineva kordsusega. Isendid, kes sisaldavad lisakromosoomi või kellel teatav kromosoom puudub, on aneuploidid. Aneuploidsusest räägitakse ka siis, kui puudub või on kordsuses osa kromosoomist, näiteks kromosoomi õlg. Need organismid, kellel teatav kromosoom või osa kromosoomist on alaesindatud, on hüpoploidid, kui aga üleesindatud, siis hüperploidid. Teatava kromosoomi kolmekordistumisel on tegemist trisoomiaga. Aneuploidsus annab tugeva fenotüübilise efekti.   6.3..1. Trisoomia inimesel Enamtuntud anomaalia inimesel on 21. kromosoomi trisoomia, mis põhjustab Downi sündroomi. Teadmata midagi veel kromosoomidest, kirjeldas seda sündroomi esmalt möödunud sajandi keskpaigas Inglismaal töötav arst Langdon Down. Downi sündroomiga inimesed on tüüpiliselt lühikest kasvu, kühmus, suure koljuga, laiade ninasõõrmetega, pika keelega, mis on silmatorkavalt kurruline ja rohmakate kätega. Samuti on nad vaimselt alaarenenud, mistõttu vajavad spetsiaalset väljaõpet ja hooldust. Downi sündroomiga indiviidide karüotüüpi tähistatakse 47, XX (või XY), +21. Trisoomiat põhjustab homoloogiliste kromosoomide mittelahknemine meioosiprotsessi käigus. See võib toimuda nii isa kui ka ema sugurakkude moodustumisel, kuid ema puhul kasvab selle tõenäosus vanuse suurenedes märgatavalt. Riski tõus on seotud sugurakkude küpsemise omapäraga naise organismis. Meioos, mis viib sugurakkude moodustumisele, algab küll juba looteeas, kuid peatub ja kulgeb lõpuni alles viljastumise momendiks. Selle ajani on meioos peatunud esimese jagunemise profaasi staadiumis, kus homoloogilised kromosoomid peavad hakkama paarduma. Mida pikemat aega jäävad rakud profaasi, seda suurem on tõenäosus, et paardumist ei toimu ning kromosoomide jaotumine on häiritud. Kirjeldatud on ka kromosoomide 13 ja 18 trisoomiat, kuid märksa harvemini. Sel juhul on fenotüübilised muutused markantsemad ning vastsündinud surevad mõne nädala jooksul. X kromosoomi trisoomia puhul on indiviidid eluvõimelised naised, fenotüübiliselt normaalsed, mõnikord siiski kergelt vaimsete puuetega ja vähenenud viljakusega. 47, XXX anomaalia ei kutsu esile silmatorkavaid fenotüübilisi muutusi seetõttu, kuna 2 X kromosoomi 3-st on inaktiveeritud, jättes aktiivseks ainult ühe nii nagu ka normaalsetel XX naistel. 47, XXY indiviidid on fenotüübilt mehed, kuid omavad ka mõningaid naissoole iseloomulikke sekundaarseid sootunnuseid ja on enamasti steriilsed. X kromosoome võib ka rohkem olla. Vastavat sündroomi nimetatakse Klinefelteri sündroomiks, mida iseloomustavad väikesed testised, suurenenud rinnad, pikad jäsemed, teravad põlved ning vähenenud karvakasv kehal. Kui X kromosoome on enam kui kaks, lisanduvad ka vaimsed puuded. 47, XYY karüotüübiga mehed on lühemad kui XY mehed, kuid seni pole veel suudetud näidata otsest seost kriminogeensusega.   6.3.2. Monosoomia Turneri sündroomi (45, X) puhul on indiviidid fenotüübilt naised, kuid kuna nende munasarjad pole arenenud, siis steriilsed. Nad on kasvult lühemad, südamehäiretega ja kuulevad halvasti. Teisi monosoomia juhtumeid inimeste puhul ei teata. 45, X naistel ei ole rakkudes Barri kehakesi. Tekib küsimus, miks nad siiski erinevad normaalsetest naistest, kellel üks X kromosoom on inaktiveeritud. Vastus peitub selle, et XX naiste puhul jäävad mõned geenid aktiivseks ka teises X kromosoomis, mis on vajalik, et organismi kasv ja areng toimuksid normaalselt. Lisaks, selleks et areneks munasari ja toimuks normaalne oogenees, on vaja, et mõlemad X kromosoomid oleksid aktiivsed.   6.3..3. Kromosoomide segmentide deletsioonid ja duplikatsioonid Kromosoomi segmendi puudumist nimetatakse deletsiooniks. Suuri deletsioone on võimalik tsütoloogiliselt tuvastada. Inimesel on kirjeldatud 5-nda kromosoomi lühikese õla deletsiooni 46(5p-) ja sellele vastavat cri-du-chat sündroomi (tuleneb prantsusekeelsest väljendist tähendusega “kassi kräunumine”). Selle sündroomiga kaasnevad tõsised nii vaimsed kui ka füüsilised puuded ning haigete häälitsemine meenutab kassi kräunumist. Kromosoomi segmendi kahekordistumist nimetatakse duplikatsiooniks. Näiteks kromosoomi 21 pikem õlg võib seonduda 14-nda kromosoomi külge. Juhul, kui selline liitkromosoom kombineerub normaalsete kromosoomidega number 14 ja 21, on indiviid fenotüübiliselt normaalne, kui aga normaalse 14-nda kromosoomi ja kahe normaalse kromosoomiga number 21, on indiviid 21. kromosoomi suhtes suures osas trisoomne ning Downi sündroomiga. Äädikakärbsel on duplitseerunud regioone lihtne ära tunda polüteenkromosoomide vaatlemisel. Näiteks X kromosoomi keskmise segmendi tandeemne duplikatsiooni kandvatel kärbestel on väiksemad silmad. Vastavat mutatsiooni Bar sisaldava polüteenkromosoomi duplitseerunud segmendid paarduvad omavahel, tekitades sõlmekujulise moodustise. Võimalik on tuvastada ka deletsioone, sest siis tuleb nähtavale lingukujuline homoloogiliste kromosoomide mittepaardunud ala. Kaasajal on võimalik deletsioone ja duplikatsioone kergesti tuvastada molekulaarsete meetoditega. Kuid sellest tuleb juttu hiljem.   6.4. Ümberkorraldused kromosoomide struktuuris   Ümberkorraldused kromosoomides võivad muuta segmendi positsiooni kromosoomis või viia ta teise kromosoomi.   6.4.1. Inversioonid Inversiooniga on tegemist sel juhul, kui segment kromosoomist on ülejäänud osa suhtes 180° suhtes ümber pööratud. Laboritingimustes saab selliseid ümberkorraldusi kunstlikult esile kutsuda röntgenkiirtega kiiritades, mis põhjustab kromosoomide fragmenteerumist. Mõnikord võivad segmendid uuesti ühineda, kuid nende orientatsioon võib olla muutunud. Inverteerumist võivad põhjustada ka transponeeruvad elemendid – DNA järjestused, mis on võimelised liikuma genoomi ühest osast teise. Tsütogeneetikas eristatakse kahte tüüpi inversioone: peritsentrilised inversioonid kaasavad tsentromeeri, paratsentrilised aga mitte. Peritsentrilise inversiooni tagajärjel võivad muutuda kromosoomi õlgade pikkused, nii võib akrotsentrilisest kromosoomist tekkida peritsentriline kromosoom. Seetõttu on peritsentrilisi inversioone lihtsam tuvastada kui paratsentrilisi. Juhul, kui üks homoloogilistest kromosoomidest sisaldab inversiooni, teine aga mitte, toimub nende paardumine sel viisil, et inversiooni sisaldav regioon on teisel kromosoomil sama orientatsiooni saavutamiseks linguna ümber pööratud. Inversiooni sisaldava ala otstes on kromatiidid pinge all ja see võib viia neis kohtades sünapsi katkestamisele. Enamasti on meioosi käigus inversioonidest põhjustatud linge tsütoloogiliselt praktiliselt võimatu jälgida. Siin tulevad jällegi appi polüteenkromosoomid, mis paarduvad ka somaatilistes rakkudes. Tänu spetsiifilisele vöödilisuse mustrile on linguna paiknevaid inverteerunud alasid kerge identifitseerida.   6.4.2. Translokatsioonid Kui segment kromosoomist satub temaga mittehomoloogilisse kromosoomi, on tegemist translokatsiooniga. Ka translokatsioone saab stimuleerida röntgenkiirtega ning protsessis võivad osaleda ka transponeeruvad elemendid. Kui kaks mittehomoloogilist kromosoomid vahetavad võrdsel hulgal geneetilist materjali, on tegemist retsiprookse translokatsiooniga. Meioosis võivad retsiprookset translokatsiooni sisaldavad muus osas mittehomoloogilised kromosoomid lisaks homoloogiliste kromosoomidega paardumisele ka omavahel paarduda, moodustades ristikujulisi struktuure. Kuna ristikujuliselt paardunud struktuuril on 4 tsentromeeri, võib homoloogiliste kromosoomide lahknemine olla häiritud ja moodustuvad aneuploidsed gameedid.   6.4.3. Liitkromosoomid (Compound Chromosomes). Robertsoni translokatsioonid Mõnikord ühineb kromosoom oma homoloogiga või liituvad tütarkromatiidid, moodustades ühe geneetilise üksuse. Liitkromosoomid püsivad stabiilselt seni, kuni neil on üks tsentromeer. Liitkromosoomid võivad moodustuda ka homoloogiliste kromosoomide segmentide ühinemisel. Näiteks äädikakärbsel on kirjeldatud liitkromosoomi, mis moodustus kromosoomi number 2 homoloogide paremate õlgade liitumise tulemusena. Sellist kromosoomi nimetatakse isokromosoomiks, kuna tema mõlemad õlad on samad. Liitkromosoomide moodustumine erineb translokatsioonidest selle poolest, et liitkromosoomid moodustuvad üksnes homoloogiliste kromosoomide baasil, translokatsioonide puhul liitub aga geneetiline materjal, mis pärineb mittehomoloogilistelt kromosoomidelt. Mittehomoloogiliste kromosoomide puhul võib kromosoomiosade liitumine toimuda ka tsentromeeride vahendusel, nii et moodustub struktuur, mida nimetatakse Robertsoni translokatsiooniks. Sel juhul moodustuvad pikkade õlgadega metatsentriline kromosoom ning väike lühikeste õlgadega, mis läheb kergesti kaotsi. Evolutsiooni käigus on selliseid kromosoomide liitumisi toimunud üsna sageli. Kromosoomid võivad liituda ka otste vahendusel, mille tulemusena moodustub kahe tsentromeeriga struktuur. Juhul, kui üks tsentromeeridest inaktiveerub, jääb liitunud kromosoom stabiilseks. Selline liitumine on ilmselt toimunud ka meie endi liigi evolutsiooni käigus. Inimese 2. kromosoom on metatsentriline, tema õlad vastavad kahele erinevale akrotsentrilisele kromosoomile ahvidel. Teatavasti on inimesel 46 kromosoomi, shimpansil aga 48.   6.4.4. Kromosoomides toimunud geneetilise materjali ümberkorraldustest tulenevad fenotüübilised muutused Homosügootses olekus on mitmeid geene haaravad deletsioonid peaaegu et alati letaalsed, sest ei toodeta mõnda organismi ellujäämiseks vajalikku geeniprodukti. Homosügootsete duplikatsioonide fenotüübiline efekt ei ole nii drastiline. Heterosügootses olekus mõjutavad nii deletsioonid kui ka duplikatsioonid fenotüüpi sel viisil, et muutunud on teatavate geenide ekspressioonitase. Fenotüübiline efekt on seda tugevam, mida suuremat kromosoomisegmenti ümberkorraldus hõlmab. Samuti sõltub muudatuse toime organismi vitaalsusele sellest, millist piirkonda muudatus hõlmab. Mõnikord võivad isegi kitsast regiooni hõlmavad deletsioonid ja duplikatsioonid olla letaalsed ning seda ka heterosügootses olekus. Sel juhul jäävad sinna regiooni geenid, mille puhul on väga oluline doos – juba üks geeni lisakoopia või teise geenikoopia puudumine on organismile letaalne. Selliseid geene, mille inaktivatsioon heterosügootses olekus on letaalse toimega, nimetatakse haplo-letaalseteks. Geenid, mille duplikatsioonid on organismile letaalsed, on triplo-letaalsed. Ka inversioonid ja translokatsioonid mõjutavad fenotüüpi. Kromosoomid võivad katkeda keset geene, inaktiveerides need. Isegi siis, kui terve geen satub uude konteksti, võib tema avaldumistase muutuda ja mõjutada selle läbi organismi fenotüüpi. Näiteks äädikakärbse silmavärvust kontrolliv geen white satub X kromosoomis toimunud inversiooni tagajärjel heterokromatiini sisaldava tsentromeeri lähedale, mistõttu selle geeni avaldumine on häiritud. Selle tulemusena on kärbse silma pigment ebaühtlaselt jaotunud. Põhjus on selles, et heterokromatiini sisaldavad alad jäävad tugevalt kondenseerunud olekusse kogu rakutsükli vältel.        7. Aheldumine, ristsiire (crossing over) ja eukarüootsete kromosoomide kaardistamine   7.1. Aheldumine, rekombinatsioon ja ristsiire Alfred Sturtevant, kes oli samuti Thomas Morgani õpilane, tegeles Drosophila kromosoomide kaardistamisega ning oli üldse esimene, kes tuli välja kromosoomikaardiga. Kaartide koostamise aluseks olid mutantide ristamistulemused. Sturtevant lähtus kaardistamisel sellest, et samas kromosoomis paiknevad geenid peaksid päranduma koos. Kuna nad kuuluvad füüsiliselt samasse üksusesse, jäävad nad kokku ka pärast meioosi. Sellist nähtust nimetatakse geenide aheldumiseks. Teatud juhtudel ei jää geenid aheldatuiks. Meioosiprotsessi käigus võivad geenid rekombineeruda. Meioosi algfaasis on homoloogiliste kromosoomide paardumisel e. konjugeerumisel jälgitavad nendevahelised ühendused – kiasmid. Neist kohtadest toimub homoloogiliste kromosoomide kromatiidiosade vahetus e. ristsiire (ingl. k. crossing over).   7.1.1. Kõrvalekalded Mendeli sõltumatu lahknemise seadusest Bateson ja Punnett ristasid suhkruherneid, mis erinesid teineteisest kahe tunnuse suhtes – õite värvus ning tolmuterade kuju. Punaste õitega ja pikkade tolmuteradega taimede ristamisel valgete õite ja ümarate tolmuteradega taimedega saadi punaste õitega ja piklike tolmuteradega järglased. Sellest võis järeldada, et punane õievärv ning tolmuterade piklik kuju on domonantsed tunnused. Hübriidide iseviljastumisel saadi nelja fenotüübiga järglasi, kuid nende fenotüüpide suhe erines oluliselt oodatavast suhtest 9:3:3:1. 1000 järglase hulgas oli võrreldes rekombinantidega (26 ja 24) ebaproportsionaalselt palju punaste ja piklike tolmuteradega taimi (583) ning valgete õitega ja ümarate tolmuteradega taimi (170). Tegelik suhe oli seega 23,3:1:1:6,8. Kõrvalekalle tulenes sellest, et õite värvust ning tolmuterade kuju määravad geenid olid aheldunud. Kuna F2 järglaskonnas oli ka punaste õitega ja ümarate tolmuteradega ning valgete õitega ja piklike tolmuteradega taimi, sisaldasid F1 põlvkonnas moodustunud gameedid osadel juhtudel rekombinantset DNA-d, kus ühe geeni alleelid olid teise geeni alleelide suhtes vahetunud.   7.1.2. Rekombinatsiooni sagedus võimaldab mõõta geenide aheldatuse määra Geenid, mis paiknevad üksteise suhtes lähestikku, on tugevamalt aheldunud ning rekombineeruvad harvemini. Seega võimaldab geenidevahelise rekombinatsiooni sagedus hinnata nendevahelist aheldatust. Rekombinatsioonisageduse arvutamiseks ristatakse uuritavate tunnuste suhtes aheldunud geenidega isendeid, näiteks eelpoolkirjeldatud heterosügootseid F1 põlvkonna suhkruherneid mõlema retsessiivse alleeli suhtes homosügootsete suhkruhernestega ja jagatakse rekombinantide arv kogu järglaskonna arvuga. Kui rekombinatsiooni pole toimunud, peaksid 50% järglastest olema fenotüübilt sarnased ühele vanemale ja 50% teisele vanemale. Oletame, et 1000-st järglasest 450 sarnanesid fenotüübilt heterosügootsele F1 põlvkonnast vanemale (punaseõielised, pikkade tolmuteradega) ja 470 homosügootsele retsessiivsele vanemale (valgete õitega, ümarate tolmuteradega). Oli ka rekombinante: 42 punaste õitega ja ümarate tolmuteradega ning 38 valgete õitega ja piklike tolmuteradega hernetaime – kokku 80 rekombinanti. Seega jagatakse rekombinantide arv 80 kõigi järglaste arvuga (80 + 450 + 470). Konkreetsel juhul on jagatis 0,08, mis näitab, et rekombinatsioon toimus 8%-lise sagedusega. Rekombinatsiooni sagedus kahe geeni vahel ei ületa kunagi 50%. Kui arvutused seda näitavad, pole geenid aheldunud, vaid paiknevad erinevates kromosoomides. Selleks, et eristada heterosügoote erinevate alleelide omavahelise aheldatuse suhtes, on võetud kasutusele kindel kirjutamisviis. Oletame, et heterosügootsel taimel on kaks dominantset alleeli R ja L ning kaks heterosügootset alleeli r ja l. Kui me kirjutame nende taimede genotüübi R L / r l, tähendab see seda, et ühelt vanemalt pärandusid omavahel aheldunud on alleelid R L ning teiselt vanemalt alleelid r l. Kui taimede genotüüp on kirjutatud R l / r L, on omavahel aheldunud dominantsed ja retsessiivsed alleelid.   7.1.3. Rekombinatsioon toimub ristsiirde tulemusena Rekombinantsed gameedid moodustuvad homoloogiliste kromosoomide ristsiirde tagajärjel. Ristsiire toimub esimese meiootilise jagunemise profaasi staadiumis, kui homoloogilised kromosoomid omavahel paarduvad. Kuna selleks ajaks on geneetiline materjal kahekordistunud, osalevad protsessis neli homoloogilist kromatiidi, moodustades tetraadi. Samas toimub konkreetne ristsiire kahe homoloogilise kromatiidi vahel. Sellest kohast ülejäänud kaks kromatiidi ei rekombineeru. Seega on iga ristsiirde toimumise tagajärjel neljast kromatiidist rekombinantsed kaks. Tõendusmaterjal sellele pärineb katsetest pagaripärmiga Saccharomysec cerevisiae. See üherakuline haploidne organism paljuneb tavaliselt mitteseksuaalsel teel, pungumisega. Sugulisel paljunemisel liituvad kaks haploidset erineva ristumistüübiga rakku a ja a , mille tulemusena moodustunud diploidne rakk läbib meioosi. Meioosi tulemusena tekib 4 haploidset rakku, askospoori, mis jäävad kokku kotikesse, mida nimetatakse askuseks. Seega sisaldab iga askus ühe konkreetse meioosi produkte. Askospooridest arenevad jälle haploidsed pärmirakud. Pärmirakke saab laboritingimustes kultiveerida tardsöötmetel, mis on valatud Petri tassidele. Iga rakk paljuneb söötmel, moodustades rakkude koloonia. Pagaripärmil on kirjeldatud palju erinevaid mutante, mida iseloomustavad kindel koloonia kuju ja võime/võimetus kasvada erinevatel söötmetel. Mikroskoobi all on võimalik meioosiprotsessi käigus moodustunud askused üksteisest eraldada, isoleerida üksikud askospoorid, viia need sobivale söötmele Petri tassil ning kirjeldada söötmel moodustunud kolooniate kuju ja kasvuomaduste põhjal mutantsete geenide vahel meioosi käigus toimunud rekombinatsioone. Just katsetest pagaripärmiga ilmnes, et ristsiire toimub pärast seda, kui homoloogilised kromosoomid on duplitseerunud. Juhul, kui on aset leidnud üks rekombinatsioonisündmus, sisaldub askuses kaks rekombinantset (A b ja a B) ning kaks mitterekombinantset askospoori (A B ja a b), millel kõigil on erinevad fenotüübid. Kui rekombinatsioon oleks toimunud enne kromosoomide duplitseerumist, oleks askuses ainult kahetüübilisi askospoore ning kõik need oleksid rekombinantsed. Nagu juba eelpool mainitud, ilmnes katsetest pagaripärmiga S. cerevisiae ka see, et igas kindlas ristsiirde kohas osalevad korraga kaks kromatiidi. Samas võivad ülejäänud kaks kromatiidi rekombineeruda mõnes teises kohas. Nii võib sõltumatult toimuda mitmeid erinevaid geneetilise informatsiooni vahetusi. Ristsiire toimub ka tütarkromatiidide vahel, kuid sel juhul me seda ei tuvasta, kuna tütarkromatiidid on geneetiliselt identsed.   7.1.4. Tõendid selle kohta, et ristsiire põhjustab geneetilise materjali rekombineerumist Curt Stern tegi katseid äädikakärbestega. Selleks, et jälgida visuaalselt, et geneetiline rekombinatsioon on seotud geneetilise materjali vahetusega kromosoomide vahel, uuris ta erineva pikkusega X kromosoomides asuvate mutantsete tunnuste pärandumist ning järglaste X kromosoomide kuju. Üks X kromosoomidest oli normaalsest pikem (Xl), sest tema lühikesse õlga oli translokeerunud tükike Y kromosoomist. Teine X kromosoom oli normaalsest lühem (Xs), sest ta oli kaotanud translokatsiooni tulemusena 4-nda väikese kromosoomi vahel osa oma pikast õlast. See kromosoom sisaldas kahte mutatsiooni – dominantset mutatsiooni Bar (muudab silmakuju pikaks ja kitsaks) ning retsessiivset mutatsiooni car (silmade roosa värvus). Pikk kromosoom sisaldas metsiktüüpi alleele. Stern ristas emaseid heterosügootsei kärbseid, kes kandsid pikka ja lühikest X kromosoomi, normaalsete isastega. Järglaste hulgas oli ka selliseid, kus kaks ebanormaalset X kromosoomi olid rekombineerunud. Rekombinatsiooni tulemusena oli üks kromosoomidest normaalse pikkusega (B+ car) ning teisel olid mõlemad õlad ebanormaalsed (B car+). Ka katsed maisiga (Barbara McClintock ning Harriet Creighton said samad tulemused sõltumatult) tõendasid, et rekombinatsioon on seotud homoloogilistes kromosoomides paikneva geneetilise materjali vahetusega.   7.1.5. Homoloogiliste kromosoomide vahelised kiasmid ilmuvad nähtavale pärast ristsiirde toimumist Kiasmid on selgelt näha meioosi profaasi lõpuosas. Sel hetkel on homoloogilised kromosoomid omavahel kontaktis ainult kiasmide ja tsentromeeri kaudu, mis võimaldab kiasme täpselt loendada. Kiasmide arv on proportsionaalne kromosoomide pikkusega. Ristsiire on toimunud enne, kui kiasmid nähtavale ilmuvad. Katseliselt on seda tõestatud sel viisil, et rakke on mõjutatud temperatuurishokiga (kuumashokk) profaasi erinevatel etappidel. Kui mõjutada rakke alles profaasi lõpus, kiasmide ilmumise ajal, on mõju rekombinatsioonisagedusele väike. Kromatiidide katkemise ja ühinemisega kaasneb ka limiteeritud DNA süntees. Seda DNA sünteesi on võimalik tuvastada profaasi esimeses osas, ammu enne seda, kui ilmuvad nähtavale kiasmid. Seega kujutavad kiasmid varem toimunud vahetuse jälgi, kromatiidid on nendest kohtadest üksteisesse takerdunud. Alles homoloogiliste kromosoomide jaotumisel raku ekvatoriaaltasapinnale nad vabanevad.     7.2. Kromosoomide kaardistamine   7.2.1. Ristsiirete arv võimaldab mõõta geneetilist distantsi Homoloogiliste kromosoomide vahelisi ristsiirdeid toimub lühikese distantsi ulatuses harvemini kui pikemate distantside puhul. Iga üksiku raku kohta on ristsiirde toimumise võimalus harv, kuid paljudest rakkudest koosnevas populatsioonis on selleks palju võimalusi. Seega saame me anda keskmise arvulise väärtuse igas konkreetses kromosoomi regioonis toimuvate ristsiirete kohta. Seega kujutab kahe punkti vaheline kaugus kromosoomi geneetilisel kaardil nende punktide vahel toimuvate ristsiirete keskmist arvu. Selleks, et seda definitsiooni lahti mõtestada, kujutame ette näiteks saja munaraku valmimist meioosis. Kõik need gameedid sisaldavad kromosoome, milles on toimunud kas null (15 gameeti), üks (60 gameeti), kaks (15 gameeti) või kolm ristsiiret (10 gameeti) punktide (geenide) A ja B vahel. Meid huvitab geneetiline distants nende punktide vahel. Selleks arvutame keskmise ristsiirete hulga kromosoomide kohta: 0 x (15/100) + 1 x (60/100) + 2 x (15/100) + 3 x (10/100) = 1,2   7.2.2. Kahe aheldunud geeni kaardistamine Metsiktüüpi emaseid äädikakärbseid ristati homosügootsete isastega, kes kandsid kahte autosoomset mutatsiooni – vestigal (vg), mis põhjustas tiibade rudimenteerumist ning black (b), mis põhjustas musta kehavärvust. Meid huvitab geenide vg ja b vaheline distants. F1 põlvkond oli fenotüübilt metsiktüüpi, pikkade tiibade ja halli kehaga, mis kinnitas, et metsiktüüpi alleelid olid dominantsed. F1 põlvkonna emaseid ristati uuesti musta kehaga ja rudimenteerunud tiibadega homosügootsete isastega. 1000-st analüüsitud F2 põlvkonna isendist sarnanesid 820 fenotüübilt vanematega ning 180 olid rekombinantsed (92 halli keha ja rudimenteerunud tiibadega ning 88 musta keha ja pikkade tiibadega). Seda, et geenid vestigal ja black olid aheldunud, tõendab see, et rekombinante oli tunduvalt vähem kui 50% kogu järglaskonnast. Selleks, et määrata nende geenide vahelist distantsi, peame me leidma keskmise ristsiirete arvu F1 põlvkonna emaste gameetides. Selleks arvutame F2 põlvkonna rekombinantide sageduse: 180 : 1000 = 0,18. Iga rekombinantne järglane sai kromosoomi, kus oli toimunud üks ristsiire uuritavate geenide vahel. Seega oli keskmine ristsiirete arv: Mitterekombinandid rekombinandid (0) x 0,82 + (1) x 0,18 = 0,18. Seega oli ristsiire uuritavate geenide suhtes toimunud keskmiselt 18-l meioosi läbinud kromosoomil 100-st (18%-l). Need geenid on geneetilisel kaardil teineteisest 18 ühiku – sentiMorgani (cM) kaugusel. 1 Morgan (M) = 100 cM. Arvutades rekombinantide tekkesagedusi ning keskmist ristsiirete arvu uuritavate geenide suhtes on võimalik leida ka kolme ja enama geeni vahelist geneetilist distantsi ning koostada selle põhjal kaart.   7.2.3. Rekombinatsiooni sagedus ja distantsid geneetilisel kaardil Eelpool kirjeldatud geneetiliste distantside meetod töötab hästi siis, kui geenid on suhteliselt lähestikku üksteisele. Juhul, kui nad paiknevad üksteisest väga kaugel, ei kajasta rekombinatsiooni sagedus nende tegelikku distantsi. Näiteks geenid cs ja f on äädikakärbse X kromosoomis teineteisest 66,8 cM kaugusel. Samas ei saa kahe geeni rekombinatsiooni sagedus teoreetiliselt ületada 50%. Nii tuleks nad kaardil paigutada teineteisest 50 cM kaugusele. Tänu nende kahe vahele jäävate geenide vaheliste distantside summeerimisele saame distantsiks 66,8 cM. Seega võib tõeline geneetiline distants kahe geeni vahel olla teoreetilisest suurem. Suuremate vahemaade puhul võib toimuda kahe kromatiidi vahel topeltristsiire, nii et lõpptulemusena taastub algne olukord. Sama efekti annab ka neljakordne ristsiire. Kuna sel juhul ei ole kromosoomid rekombinantsed, jäävad need sündmused arvutustest välja. Kokkuvõtvalt võib öelda, et geenidevaheline rekombinatsiooni sagedus, mis jääb allapoole 20 – 25%, kajastab nendevahelist distantsi täpselt, üle selle ilmnevad kõrvalekalded tegelikust olukorrast – tegelik vahemaa on teoreetilisest pikem, kuna osa mitmekordseid ristsiirdeid ei vii lõpptulemusena rekombinantsete kromosoomide moodustumisele ja jäävad arvutustest välja.   7.2.4. Kiasmide sagedus ja geneetiline distants Iga homoloogiliste kromosoomide vahel jälgitav kiasm meioosi profaasis peaks kajastama üht profaasi algusosas toimunud ristsiiret. Seega peaks kiasmide loendamine võimaldama meil samuti määrata keskmist ristsiirete arvu kromosoomi kohta. Liidame kiasmid kokku ja jagame uuritud rakkude arvuga. Kui näiteks 100 raku kohta loendati 215 kiasmi, siis keskmine kiasmide arv raku kohta on 2,15 ning kromatiidi kohta poole väiksem – 1,07. Sellest leiame, et kromosoomi pikkus on 107 cM, sest kiasmide arv kromatiidi kohta väljendab kromosoomi geneetilist pikkus. Võime arvutada ka geneetilise pikkuse ja keskmise kiasmidevahelise arvu suhte, see on: 107 cM : 2,15 kiasmi = 50. See tähendab, et geneetilise kaardi 50 cM-le vastab üks kiasm.   7.2.5. Geneetiline ja füüsiline distants Me eeldame, et pikemate kromosoomide vahel toimub rohkem ristsiirdeid kui lühemate vahel. Enamasti see nii ongi, kuid mõnede regioonide vahel toimub ümberkombineerumine sagedamini kui teiste vahel. Seega ei vasta kaugused geneetilisel kaardil täpselt kaugustele kromosoomi füüsilisel kaardil. Ümberkombineerumine toimub väiksema tõenäosusega kromosoomi otste lähedal ning tsentromeeri piirkonnas. Need piirkonnad on geneetilisel kaardil kokku surutud. Ülejäänud regioonid, kus ristsiirete toimumise tõenäosus on kõrgem, on geneetilisel kaardil välja venitatud. Hoolimata neist erinevustest on nii geneetilised kui ka füüsilised kromosoomikaardid kolineaarsed, mis tähendab seda, et konkreetsed geenid on mõlemal kaardil samas järjekorras. Seega võimaldab rekombinantide analüüs määrata geenide järjekorda kromosoomis, kuid mitte nendevahelisi füüsilisi kaugusi.     7.3. Rekombinatsiooni osa evolutsiooniprotsessis   Meioosis, kus homoloogilised kromosoomid satuvad kõrvuti, rekombineeruvad aheldunud geenid ristsiirde kaudu – nii tekivad uued alleelide kombinatsioonid. Mõned neist kombinatsioonidest võivad organismile kasulikud olla, tõstes tema eluvõimet ja viljakust. Nii levivad kasulikud kombinatsioonid populatsioonis, kuni muutuvad konkreetse liigi seisukohalt standardseteks. Geneetilise materjali ümberkombineerumine meioosiprotsessis on seega üks viis suurendada geneetilist variantsust, mis on alusmaterjaliks evolutsioonile. Võrdleme kahte liiki, millest üks paljuneb sugulisel teel ning teine mitte. Oletame, et mõlemal liigil tekib kasulik mutatsioon ning aja jooksul veel teinegi. Liigi puhul, mis paljuneb seksuaalsel teel, võivad need mutatsioonid sattuda samasse organismi ja sugurakkude moodustumisel meioosi käigus rekombineeruda. Rekombinantsed järglased on võrreldes üksikmutantidega edukamad ning saavutavad mõne aja pärast populatsioonis ülekaalu. Nii levivad mõlemad kasulikud mutatsioonid populatsioonis koos. Mittesugulisel teel paljuneva organismi puhul puudub võimalus kasulike mutatsioonide rekombineerumiseks ning edasiseks kooslevimiseks populatsioonis.     7.3.1. Rekombinatsiooni allasurumine inversioonide teel Kui üks homoloogilistest kromosoomidest sisaldab inversiooni, on rekombineerumine häiritud. Kui siiski ümberkombineerumine inverteerunud osade vahel on toimunud, lähevad rekombinantsed kromatiidid kergemini kaotsi. Näiteks üks rekombinantidest sisaldab kahte tsentromeeri ja teisel tsentromeere pole. Sel juhul rebitakse meioosi anafaasis esimene neist puruks, kuna erinevad tsentromeerid tõmbavad teda erinevatele poolustele, teine ei liigu aga kuhugi. Isegi, kui rekombinantsetel kromosoomidel õnnestub püsima jääda, on nad aneuploidsed – mõned geenid neis on topelt, mõned puudu. Tavaliselt on see organismile letaalne. Rekombinatsioonide supresseerimist inversioonide kaudu kasutavad geneetikud erinevate geenide alleelide koos hoidmiseks samas kromosoomis. Inversiooniga kromosoome on sageli kasutatud katsetes äädikakärbestega. Tavaliselt sisaldab inversiooniga kromosoom dominantset mutantset alleeli, et see kromosoom oleks jälgitav läbi erinevate ristamiskatsete. Selliseid markeeritud inversiooniga kromosoome nimetatakse paigalhoidjateks (ingl. keeles balancers).   7.3.2. Rekombinatsiooni geneetiline kontroll Rekombinatsiooniprotsessi erinevatel etappidel osalevad paljude erinevate geenide poolt kodeeritud valgud. Huvitaval kombel ei toimu geneetilist ümberkombineerumist ristsiirde teel isastel äädikakärbestel, mis muudab nad võrreldes teiste organismidega unikaalseks. Ka liigiti on rekombinatsioonisagedus erinev.           8. Aheldumise geneetiline analüüs, kasutades täiustatud meetodeid   8.1. Aheldumise uurimine katseorganismides Kõige intensiivsemalt on uuritud geenide aheldumist seentel (eriti pärmidel) ning äädikakärbsel.   8.1.1. Tetraadanalüüs seentel Askomütseetidele, kuhu kuulub ka pagaripärm Saccharomyces cerevisiae, on iseloomulik, et meioosis moodustunud 4 askospoori jäävad kokku moodustisse, mida nimetatakse askuseks. Kuna need seened on suurema osa oma elutsüklist haploidsed, areneb igast askospoorist uus organism. See lihtsustab erinevate genotüüpidega askospooride fenotüübilist analüüsi. Askospooride moodustumine pagaripärmil kajastab toimunud meioosiprotsessi. Meioosi lõpptulemusena tekib 4 askospoori, millest igaüks sisaldab ühte neljast meioosi algfaasis kõrvuti paiknenud tetraadi moodustanud kromatiidist. Tänu sellele saame me geenide aheldumist tetraadis uurida askospooride fenotüüpide kaudu. Kui ristata kahte pärmi tüve, millest üks kannab mitteaheldunud mutantseid geene a ja b ning teine nende geenide metsiktüüpi alleele A ja B, siis moodustuvad kolme tüüpi askused. Üks põhitüüpidest sisaldab askospoore, millest kaks on iseloomulikud ühele (AB) ja kaks teisele vanemale (ab) – parental ditype askus. Teine põhitüüp sisaldab kahte tüüpi askospoore, mis on rekombinantsed (Ab) või (aB). Mõlemal juhul on üks alleel pärit ühelt vanemalt ning teine alleel teiselt vanemalt – nonparental ditype askus. Kuna erinevad kromosoomid lahknevad üksteisest sõltumatult, moodustub mõlemat tüüpi askuseid võrdselt. Vähesel hulgal moodustub ka kolmandat tüüpi askuseid, mis sisaldavad nelja erinevat tüüpi askospoori (Ab), (ab), (AB) ja (aB) – tetratüüpi askus. Sel juhul on ühe geeni kaks alleeli ristsiirde teel vahetanud oma asukoha. Kui ristata kahte pärmi tüve, kus mutatsioonid paiknevad samas kromosoomis, siis ootame, et enamus askuseid sisaldavad askospoore, mis sarnanevad nende vanematele. Rekombinantsed spoorid tekivad ainult ristsiirde tagajärjel. Kui on toimunud üks ristsiire, moodustub tetratüüpi askus. Kui on toimunud kahekordne ristsiire, sõltub tulemus sellest, mitu kromatiidi selles osalesid – kui vahetus toimus kahe kromatiidi vahel, moodustub askus, kus spoorid sarnanevad vanematega (parental ditype), kui vahetus toimub kolme kromatiidi vahel, on tulemuseks tetratüüpi askus, kui aga vahetus toimub nelja kromatiidi vahel, on askuses kahte tüüpi rekombinante (nonparental ditype). Viimast tüüpi askuseid moodustub võrreldes teistega oluliselt vähem, mis kinnitab omakorda, et vaatlusalused geenid on aheldunud. Pärast seda, kui me oleme määranud aheldumise, on võimalik arvutada geenidevaheline geneetiline distants. Teeme seda konkreetse näite alusel. Ristame kahte pärmitüve, millest üks on mutantne (py – vajab kasvuks püridoksiini; th – vajab kasvuks tiamiini) ning teine metsiktüüpi (PY TH). Diploidsed rakud jagunevad meioosi teel ning moodustuvad askused. 100 erineva askuse analüüsil selgus, et uuritavad geenid on aheldunud, sest võrreldes tetratüüpsete (kokku 44) ja vanemtüüpi ditüüpi askustega (52) oli mittevanemtüüpi (nonparental) ditüüpi askuseid oluliselt vähem (4). Selleks, et arvutada geenidevahelist distantsi, tuleb leida keskmine ristsiirete arv kromosoomi kohta.   Rekombinatsiooni sagedus = [(1/2) T + NPD]/ askuste arv,   kus T = tetratüüpi askuste arvuga ning NPD = mittevanemtüüpi ditüüpi askuste arvuga. T on korrutatud ½-ga sellepärast, et ainult pooled askospoorid tetratüüpi askustes on geneetiliselt rekombinantsed. Konkreetne rekombinatsiooni sagedus on seega: [(1/2)(44) + 4]/100 = 0,26. Geneetiline distants on 0,26 Morganit = 26 cM. Kuna rekombinatsiooni sagedus ületas 25%, on tegelik distants pikem, arvestamata jäid mõned kahekordsed ristsiirded. Sellepärast eelistavad osa teadlasi kasutada valemit   Geneetiline distants = [(1/2) T + 3 NPD]/ askuste arv   Seda valemit kasutades leiame, et geneetiline distants geenide py ja th vahel on 34 cM. Tetraadanalüüs seenega Neurospora crassa on veelgi informatiivsem, sest askospoorid askuses jäävad kindlasse ritta, kajastades olukorda, kuidas külgnesid meioosis üksteisega neli kromatiidi.   8.1.2. “Paigalhoidvate” kromosoomide (balancer chromosomes) kasutamine Drosophila geneetilises analüüsis Uute mutatsioonide lokaliseerimiseks kromosoomis kasutatakse dominantse alleeliga markeeritud inversiooniga kromosoome, nn. paigalhoidvaid (balancer) kromosoome, mis takistavad nende kromosoomide rekombineerumist normaalsete (inversioonita) homoloogidega. Analüüsime ristamise tulemusi, kus on kasutatud kahte paigalhoidvat kromosoomi – kromosoom number 2 on markeeritud dominantse mutatsiooniga Cy (krussis tiivad – ingl. k. curly wings) ning kolmas kromosoom on markeeritud mutatsiooniga Tb (jässakas keha – ingl. k. tubby body). Homoloogilised kromosoomid kannavad samuti dominantseid markereid – Pm (ploomivärvi silmad – ingl. k. plum eyes) teises kromosoomis ning Sb (tüükakujulised harjased – ingl. k. stubble bristles) kolmandas kromosoomis. Kõigil neljal markeril on ka retsessiivne letaalne efekt, mistõttu homosügoodid surevad. Tundmatu retsessiivse mutatsiooni suhtes homosügootseid emaseid ristatakse isastega, kes kannavad eelpoolkirjeldatud tasakaalustavaid kromosoome ja nende homolooge. Sõltuvalt sellest, millises kromosoomis uuritav mutatsioon paikneb, on järglaskond erinev. Kui mutatsioon on X-liiteline, on kõik isased järglased mutantsed, emased aga mitte. Tasakaalustavaid kromosoome poleks analüüsiks vaja olnudki. Juhul, kui mutatsioon paikneb ühes autosoomidest, ristatakse F1 heterosügoote omavahel ja analüüsitakse siis tulemusi. Hindame erinevaid võimalusi: Mutatsioon paikneb teises kromosoomis. Kuna teine paigalhoidev kromosoom sisaldas markerit cy, ei saa tekkida rekombinante, mis oleksid fenotüübilt mutantsed ja krussistiivalised, kuna retsessiivset mutantset alleeli sisaldav kromosoom ei saa inversiooni tõttu selle kromosoomiga rekombineeruda Mutatsioon paikneb kolmandas kromosoomis. Kuna kolmas paigalhoidev kromosoom sisaldas markerit Tb, ei saa tekkida rekombinante, mis oleksid fenotüübilt mutantsed ja jässaka kehaga. Mutatsioon paikneb neljandas kromosoomis. Mõned järglased on samaaegselt nii mutantsed, krussistiivalised kui ka kehalt jässakad.   8.2. Spetsiaalsed kaardistamise meetodid 8.2.1. Neurospora crassa reastatud tetraadide analüüs tsentromeeride kaardistamiseks Neurospora crassa on haploidne seen, kes moodustab pikki rakkude filamente, mida nimetatakse mütseeliumiks. Seda seent teatakse ka leivahallitusena. Erinevatesse ristamistüüpi kuuluvad haploidsed rakud võivad ühineda ning diploidne rakk läbib meioosi. Iga askospoor saab ühe neljast kromatiidist. Erinevalt pärmist on Neurospora’l askospooride kott piklik ja väga kitsas, nii et spooride reastumine askuses kajastab seda, kuidas reastusid kromatiidis meioosis. Meioosi käigus rakud ei pooldu, tuumad jäävad kõrvuti ning pärast meioosi toimub veel üks mitootiline jagunemine, nii et iga haploidne tuum jaguneb veel omakorda. Lõpptulemuseks on kaheksa reas paiknevat tuuma, mis eraldatakse üksteisest rakuseintega, nii et moodustuvad askospoorid. Ettevaatliku manipuleerimise tulemusena on võimalik reas paiknevad spoorid ükshaaval askusest eraldada ja uurida nende fenotüüpi. Oletame, et alleelid A ja a, mis paiknevad tsentromeeri lähedal, produtseerivad askospoorides erinevaid pigmente. Kui ristata A ja a alleelidega rakke, moodustuvad kaheksa spooriga askused. Alleelid võivad segregeeruda erinevalt ja seetõttu näeme kahetüübilisi askuseid. Esimesel jagunemisel segregeerumise muster avaldub siis, kui neli esimest spoori askuses on alleeliga A ja ülejäänud neli alleeliga a. Alleelid A ja a lahknevad esimesel jagunemisel puhtalt – AA ühele poole ja aa teisele poole. Pärast teist jagunemist lahknevad kromatiidid eraldi tuumadesse järjekorras A, A, a, a ning seejärel poolduvad tuumad veel mitootiliselt. Teisel jagunemise segregeerumise mustrit näeme siis, kui on toimunud ristsiire lookuse A ja tsentromeeri vahelt, ning A ja a satuvad teisel meiootilisel jagunemisel erinevatesse tuumadesse. Sel juhul on reas kahekaupa kõrvuti kord ühte, kord teist alleeli sisaldavad askused. Materjali ümberkombineerumine kahe kromatiidi vahel toimub esimesel meiootilisel jagunemisel, kumbagi tuuma satub üks algne ja üks rekombinantne kromatiid. Pärast teist jagunemist satuvad kõik kromatiidid erinevatesse tuumadesse järjekorras A, a, A, a. Kuna ümberkombineerumine toimus geeni ja tsentromeeri vahelt, on võimalik arvutada geeni ja tsentromeeri vahelist geneetilist distantsi. Kuna ümberkombineerumine toimus ainult kahe kromatiidi baasil, korrutatakse teisel jagunemisel segregeerumise tüüpi askuste arv 0,5-ga ja jagatakse kogu analüüsitud askuste arvuga. Näiteks mutantse, kasvuks vitamiini tiamiin vajava mutandi (thi-) ristamisel metsiktüüpi tüvega olid 132-st analüüsitud askusest 104 esimesel jagunemisel segregeerumise mustriga ning 28 teisel jagunemisel segregeerumise mustriga. Geeni thi geneetiline distants tsentromeerist on seega (1/2)(28/132) = 10,6 cM.   8.2.2.Drosophila deletsioonide ja duplikatsioonide tsütogeneetiline kaardistamine Erinevalt rekombinantide analüüsil põhinevast geenide kaardistamisest on tsütogeneetilise kaardistamise puhul oluline, et uuritav fenotüübilist efekti omav retsessiivne mutatsioon oleks kombineeritud tsütoloogiliselt jälgitava deletsiooni või duplikatsiooniga. Äädikakärbse polüteenkromosoomide puhul on deletsioonid ja duplikatsioonid kergesti jälgitavad. Näiteks mutatsioon white on X kromosoomi ühest otsast 1,5 cM kaugusel, kuid kumma otsa suhtes see distants on leitud ning kui kaugele jääb ta otsast füüsiliselt, seda aitab selgitada ainult tsütoloogiline analüüs. Ristamise teel püütakse saada heterosügootseid järglasi, mis kannaksid mutatsiooniga white X kromosoomi ning defineeritud kohast deletsiooniga X kromosoomi. Juhul, kui teises X kromosoomis olev deletsioon hõlmab white geeni sisaldavat piirkonda, on järglased valgete silmadega, kõigil teistel juhtudel aga punaste silmadega. Põhjus on selles, et kui deletsioon ja white geen asuvad samas kohas (lookuses), ei ole heterosügootides funktsionaalset metsiktüüpi alleeli ning pigmenti ei produtseerita. Vastava deletsiooni asukoht on jälgitav polüteenkromosoomil. Ka duplikatsioone saab kasutada mutatsioonide kaardistamisel. Sel juhul jälgime duplikatsiooni, mis maskeerib retsesiivse mutatsiooni fenotüübi, s.t. ta peab sisaldama duplikatsioonis mutantse geeni metsiktüüpi alleeli.   8.3. Geenide aheldumise uurimine inimesel Kuni lähiajani oli inimese geenide kaardistamine üsna komplitseeritud, kuna pole väimalik läbi viia kontrollristamisi. Samuti on analüüsitav järglaskond väga väike. Kõige vanem ja otsesem viis inimese geenide aheldumise analüüsiks on sugupuude analüüs.   8.3.1. Geenide aheldatuse tuvastamine sugupuude analüüsil Kõige lihtsam on aheldatust jälgida X kromosoomi korral. Nii on leitud, et nii hemofiiliat kui ka värvipimedust (võimetus eristada punast ja rohelist värvi) põhjustav alleel on aheldunud X kromosoomi. Hemofiiliat võib põhjustada mutatsioon kahes lookuses. Hemofiilia B puhul puudub indiviididel koagulatsiooni faktor IX, hemofiilia A korral aga koagulatsiooni faktor VIII. Faktor VIII-t kodeeriv geen paikneb kromosoomi otsale lähemal, mõlemad geenid paiknevad kromosoomi pikas õlas. Mõned sugupuud on võimaldanud jälgida ka autosoomsete mutatsioonide aheldatust. Näiteks võib tuua küünte-kederluu (nail-patella) sündroomi, mis on aheldunud ABO vererühma lookusega. Küünte-kederluu sündroom on harv autosoomne dominantne tunnus, mille puhul küüned ja põlved on vähe arenenud.   8.3.2. Somaatiliste rakkude geneetika – alternatiivne moodus geenide kaardistamisel   Rakkude hübridiseerimine. Meetod töötati välja 60-ndatel aastatel Barski ja Ephrussi poolt. Võimalik on liita somaatilisi rakke nii samast liigist kui ka erinevatest liikidest. Liitunud rakke nimetatakse hübriidideks. Meetod on rakendatav ka inimese geenide kaardistamisel. Tavaliselt hübridiseeritakse inimese rakkudega näriliste, näiteks hiirte rakke. Kokkusegatud rakkude liitumist stimuleeritakse kas inaktiveeritud Sendai viirusega või polüetüleenglükooliga. Esmalt liituvad rakumembraanid, seejärel tuumamembraanid. Kui hübriidne rakk jaguneb, lähevad inimese kromosoomid järk-järgult juhuslikkuse alusel kaotsi. Pärast mitmeid rakujagunemisi on hübriidses rakus alles veel ainult üks või väga vähesed inimese kromosoomid. Miks see nii toimub, on seni selgusetu.   Isegi, kui katsetingimused on ideaalsed, moodustub väga vähe hübriidseid rakke. Osa rakke ei liitu, palju on ka hiir - hiir ning inimene – inimene liitrakke. Selleks, et töötada edasi tõeliste hübriididega, kasutatakse rakkude kasvatamiseks selektiivset söödet – tavaliselt HAT söödet (hüpoksantiin-aminopteriin-tümidiin). Juhul, kui üks rakutüüpidest on defektne tümidiini kinaasi suhtes (TK-) ja teine näiteks hüpoksantiini fosforibosüül transferaasi suhtes (HPRT-), need rakud söötmel ei kasva. Kasvada saavad üksnes hübriidid. HAT söötmes olev aminopteriin blokeerib tavalise puriinide ja tümidülaadi sünteesiraja, mistõttu rakud saavad kasvada ainult siis, kui neis on funktsionaalsed TK ja HPRT alleelid ning söötmes tümidiin ja hüpoksantiin. Kui hübriidsed rakud on selekteeritud, isoleeritakse kloonid e. rakuliinid (tegemist on ühe raku järglaskonnaga). Iga rakuliini puhul jälgitakse, milliseid geeniprodukte sünteesitakse ning milliste geeniproduktide puudumine/olemasolu on seotud konkreetse inimese kromosoomi puudumise/olemasoluga. Üks hübriidne liin sisaldas ainult ühte inimese kromosoomi – 17-ndat kromosoomi ning oli sellegipoolest võimeline sünteesima tümidiini kinaasi. Seega paigutus TK geen 17-ndasse kromosoomi. Vastupidisel rakkude hübridiseerimisel (HPRT- hiire rakud + TK- inimese rakud) saadi HAT- söötmel kasvav hübriid, mis sisaldas inimese kromosoomidest ainult X kromosoomi. See näitas, et geen HPRT paikneb X kromosoomis. Somaatiliste rakkude hübridiseerimist saab kasutada peaaegu kõigi inimese geenide kaardistamisel. Oluline on vaid see, et hübriidses rakus konkreetne geen avalduks ning et ta oleks eristatav hiire vastavast geeniproduktist. Näiteks UMP kinaasi geen lokaliseeriti esimesse kromosoomi. Inimese ja hiire UMP kinaase on võimalik eristada geelelektroforeesiga. Valkude aminohappelises järjestuses on mõned erinevused ja see kajastub nende ensüümide erinevas liikuvuses geelelektroforeesil. Kui analüüsiti erinevaid hübriidseid rakuliine, siis oli inimese UMP kinaas alati esindatud ainult nende hübriidide korral, mis sisaldasid esimest inimese kromosoomi. Tänapäeval kasutatakse inimese geenide tuvastamiseks hübriidsetest rakkudest enamasti spetsiifilise DNA detekteerimise meetodeid (nukleiinhapete hübridisatsioon, PCR).   Geenide kaardistamine kasutades kromosomaalseid ümberkorraldusi. Hübriidsete rakkude analüüs võimaldab tuvastada, millises kromosoomis uuritav geen paikneb, kuid sel juhul jääb selgusetuks, millises kromosoomi piirkonnas. Seetõttu võetakse appi kombineeritud meetodid, kasutades geneetiliste ümberkorraldustega kromosoome, mis sisaldavad translokatsioone. Näiteks on toimunud translokatsioon X kromosoomi ja 14-nda kromosoomi vahel – enamus X kromosoomi pikast õlast on translokeerunud 14-nda kromosoomi otsa ning väike segment 14-nda kromosoomi otsast on translokeerunud X kromosoomi otsa. Inimese rakke, mis seda translokatsiooni sisaldasid, hübridiseeriti hiire rakkudega ja kasvatati HAT-söötmel. Mõned ellujäänud hübriidsed rakud sisaldasid lisaks hiire kromosoomidele ainult üht inimese kromosoomi – 14-ndat kromosoomi, kuhu oli liitunud enamus X kromosoomi pikemast õlast. Kuna eelnevalt oli teada, et geen HPRT paikneb X kromosoomis, oli nüüd selge, et see geen paikneb X kromosoomi pikemas õlas. Need hübriidsed rakud ekspresseerisid ka fosfoglütseraadi kinaasi (PGK) ning glükoos-6-fosfaadi dehüdrogenaasi (G6PD), mille geenid olid samuti eelnevalt X kromosoomi lokaliseeritud. Järelikult sai nüüd ka nende kahe geeni täpsem asukoht selgeks. Sama rakuliin ekspresseeris ka nukleosiidi fosforülaasi (NP), mille geeni kohta oli eelnevalt teada, et see paikneb 14-ndas kromosoomis. Seega sai nüüd välistada võimaluse, et NP-d kodeeriv geen paikneb 14-nda kromosoomi selles osas, mis oli translokeerunud X kromosoomi. Edasise analüüsi käigus töötati juba selliste translokatsiooni sisaldavate kromosoomidega, kus X kromosoomist olid üle kandunud lühemad segmendid. Nii oli võimalik uuritavad geenid X kromosoomis reastada.   X kromosoomis paikneb ka geen DMD, mille defektsus avaldub Duchenne lihaselise düstroofia näol. DMD on neuromuskulaarne haigus, mille sümptomid ilmnevad tavaliselt alates 6-ndast eluaastast. 12-ndaks eluaastaks jõuavad patsiendid ratastooli ning ei ela üle 20-nda eluaasta. Enamasti esineb DMD meestel, kuna see on X-liiteline retsessiivne haigus ning patsiendid ei ela nii kaua, et defektseid geene järgmisesse põlvkonda edasi anda. Siiski on ka üksikuid naissoost haigeid. Haiged naised kandsid kõik X kromosoomi, millest oli toimunud translokatsioon autosoomi. Kuigi autosoomid varieerusid, oli X kromosoomi katkemiskoht kõigil juhtudel regioonis, mis sisaldas DMD geeni. Naistel on üks X kromosoomidest rakkudes inaktiveeritud. Pooltes rakkudes on inaktiveeritud üks homoloogidest, pooltes teine. Translokatsiooniga X kromosoomi puhul aga inaktiveerus eelistatult normaalne X kromosoom.   Deletsioonide analüüs. Mõnikord läheb fragment kromosoomist lihtsalt kaotsi, deleteerub. Kui sel juhul ilmnevad indiviidil muutused fenotüübis, näiteks põeb ta mingit haigust, võimaldab deletsioon lokaliseerida geene, mille defektsus seda haigust põhjustab. Näiteks harvaesineva X kromosoomist toimunud deletsiooniga kaasnevad nähud kinnitasid, et DMD geen paikneb X kromosoomi lühemas õlas. Suhteliselt väikese deletsiooniga X kromosoomi väikesest õlast (Xp21) kaasnesid Duchenne lihaselise düstroofiaga veel sellised haigused nagu krooniline granulomatoos (CGD) - immunoloogiline haigus, millega kaasneb tsütokroom b defitsiit; retinis pigmentosa (RP) – puudulik nägemine ja McLeodi haigus, mille puhul on kahjustatud punased vererakud. Seega lokaliseerusid kõik neli eelpool kirjeldatud haigustega seotud geeni sinna küllaltki kitsasse regiooni. Edasi muutus võimalikuks konkreetsed geenid juba isoleerida. DMD geeni isoleerimise detailidest tuleb juttu hiljem.   Duplikatsioonide analüüs. Duplikatsiooni puhul on geeni poolt kodeeritud valgu hulk rakus kõrgem, see võib väljenduda kõrgenenud ensüümiaktiivsuses. Duplikatsioonide analüüsiks kasutatakse sageli translokatsioonidega kromosoome. Sel põhimõttel lokaliseeriti ka GOTs (glutamic oxaloacetic transaminase) geen. Eelnevate analüüside põhjal oli teada, et geen GOTs peaks paiknema 10-nda kromosoomi pikema õla distaalses segmendis. Geeni lokaliseerimiseks kasutati kolme erinevat hübriidsete rakkude liini. Esimeses rakuliinis sisaldus kaks koopiat 10-ndast, 17-ndast ja 21-st kromosoomist, kusjuures ühte 17-ndasse kromosoomi oli translokatsiooni tulemusena sattunud segment 10-nda kromosoomi otsast. Ka teine rakuliin sisaldas kahte 10-ndat, 17-ndat ja 21-st kromosoomi, kuid sel juhul oli translokatsioon 10-nda kromosoomi pikast õlast toimunud 21-sse kromosoomi. Mõlemas rakuliinis oli seega lisakoopia 10-nda kromosoomi segmendist. Kolmas rakuliin oli kontrolliks ning sisaldas kahte 10-ndat, 17-ndat ja 21-st kromosoomi. Erinevatest rakuliinidest määrati GOT ensüümi aktiivsust. Selgus, et teises rakuliinis, mis sisaldas 10-nda kromosoomi segmendi translokatsiooni 17-ndasse kromosoomi, oli ensüümiaktiivsus kõrgem. Kuna ensüümiaktiivsuse tasemed kontrollrakuliinis ja translokatsiooni 21-sse kromosoomi sisaldavas rakuliinis olid omavahel võrreldavad, õnnestus geen lokaliseerida kitsasse piirkonda, mis oli translokeerunud 17-ndasse kromosoomi, kuid mitte 21-sse kromosoomi.   8.2.3. Inimese geneetiline kaart 80-ndate aastate lõpul käivitati inimese genoomi projekt HUGO (Human Genome Project) mille peamiseks eesmärgiks on konstrueerida iga kromosoomi detailne kaart. Esmalt kaardistatakse konkreetsed segmendid, seejärel leitakse nende asukohad kromosoomides ning lõpuks määratakse nende segmentide nukleotiidne järjestus. Inimesel on ligikaudu 100000 geeni, mida identifitseerida. Kokku tähendab see ligi 3 miljardi nukleotiidi sekveneerimist. Praeguseks on identifitseeritud üle 5000 inimese geeni ja umbes pooltel neist on teada täpne asukoht kromosoomis. Enamus seniseks iseloomustatud geenidest on seotud kas mingi haigusega või geneetilise defektiga. Märksa raskem on aga konkreetseid geene seostada selliste normaalse muutlikkusega tunnustega nagu kasv, kaal, naha pigmentatsioon, juuste värvus, vastupanu haigustele.