Mikro-RNA

MikroRNA-d (lühendatult miRNA; ingl microRNA) on lühikesed, keskmiselt 20–25 nukleotiidi pikkused üksikahelalised RNA-molekulid, mida sünteesitakse eukarüootsete rakkude tuumades.

MikroRNA-203 sekundaarstruktuur

MiRNA-d on posttranskriptsioonilised regulaatorid, mis seonduvad messenger RNA (mRNA) transkriptide komplementaarsetele järjestustele. Tavaliselt on selle tagajärjeks translatsiooniline repressioon või märklaud-mRNA degradatsioon ja geeni vaigistamine. Inimese genoom võib kodeerida üle 1000 miRNA ning nende märklauaks võib olla kuni 60% imetajate geenidest. miRNA-sid leidub inimesel rohkelt väga erinevates koetüüpides.

miRNA-d erinevad oma omadustelt taimedes ja loomades. Taimedes on miRNA-de komplementaarsus oma märklaud-mRNAle täiuslik või mõne üksiku mittesobiva paardumisega. Loomades (Metazoa) hõlmab miRNA komplementaarsus 5` otsa 2–7 aluspaari, mikroRNA alusjärjestust (ingl seed region). Üks mikroRNA võib seostuda ühe ja sama mRNA mitme erineva saidiga või paljude erinevate mRNA-dega.

Veel üks erinevus taimedes ja loomades on märklaud-mRNA seostumissaidi asukohas. Loomades asuvad miRNA-de märklaudsaidid mRNA-de 3` mittetransleeritavates regioonides (3`UTR- untranslated region). Taimedes võivad märklaudsaidid asuda samuti mRNA-de 3`mittetransleerivates regioonides, kuid sagedamini paiknevad nad kodeerivas alas. miRNA-de geenide järjestused on eukarüootsetes organismides küllalt konserveerunud. miRNA-d arvatakse olevat organismidele eluliselt oluline ja evolutsiooniliselt vana geneetilise regulatsiooni komponent.

Esimesi miRNA-sid kirjeldati 1990. aastate algul. Siiski, miRNA-sid ei tunnistatud kui eraldi konserveerunud funktsioonidega bioloogiliste regulaatorite klassi kuni 2000. aastate algusaastateni. Alates sellest ajast on miRNA-de uurimine paljastanud mitmeid rolle negatiivses regulatsioonis (transkripti degradatsioon, translatsiooniline supressioon) ja võimalikku seotust positiivse regulatsiooniga (translatsiooniline ning transkriptsiooniline aktivatsioon). miRNA-d osalevad geeniregulatsiooni mõjutajatena tõenäoliselt peaaegu kõikides bioloogilistes protsessides. Erinevates rakutüüpides ja kudedes esinevad erinevad ekspresseerunud miRNA-de komplektid.

Kõrvalekaldeid miRNA-de ekspressioonis on seostatud mitmete haiguslike seisunditega ning uurimise all on miRNA-del põhinevad teraapiad.

Ajalugu

Victor Ambros, Rosalind Lee ja Rhonda Feinbaum avastasid 1993. aastal mikroRNA-d, kui nad uurisid geen lin-14 rolli varbussi (Caenorhabditis elegans) arengus.^[26] Nad leidsid, et valk LIN-14 rohkust reguleeris lühike RNA produkt, mida kodeeris lin-4 geen. Lin-4 geeni 61-nukleotiidne prekursor matureerus 22 nukleotiidi pikkuseks RNAks, mis sisaldas osaliselt komplementaarseid järjestusi mitmetele 3`UTR järjestustele lin-14 mRNAs. See komplementaarsus oli nii vajalik kui ka piisav inhibeerimaks lin-14 mRNA translatsiooni LIN-14 valguks. lin-14 RNA oli esimene identifitseeritud mikroRNA, kuigi tollel ajal peeti selle olemasolu nematoodi (C.elegansi) omapäraks. Alles 2000. aastal kirjeldati järgmist selletaolist RNA-d: let-7, mis represseeris geenide lin-41, lin-14, lin-28, lin-42 ja daf-12 ekspressiooni C.elegansi arengustaadiumite üleminekute jooksul. Peagi leiti, et let-7 on konserveerunud paljudes liikides, viidates võimalusele, et miRNA-sid leidub seni arvatust rohkemates organismides.^[27][28]

NomenklatuurRedigeeri

Standardse nomenklatuuri süsteemi alusel määratakse eksperimentaalselt kinnitatud miRNA-dele nimed enne nende avastamisest teavitavate publikatsioonide avaldamist.^[29][30] Eesliitele 'mir ' järgneb sidekriips ja number, kusjuures viimane näitab sageli nimetamise järjekorda. Näiteks mir-123 nimetati ning tõenäoliselt ka avastati enne kui mir-456. Eesliide ' mir-' (ilma suurtäheta) viitab pre-miRNAle, suure tähega 'miR-' aga miRNA küpsele vormile. Peaaegu identsete järjestustega miRNA-d, mis erinevad vaid nukleotiidi või paari poolest, märgitakse lisaks alaindeksitega. Näiteks, miR-123a oleks lähedases suguluses miR-123b-ga. Pre-miRNA-d, mille tulemuseks on 100% identsed küpsed miRNA-d, kuid mis asuvad genoomis erinevates kohtades, märgitakse täiendavate numberliidetega, mis on sidekriipsuga eraldatud. Näiteks pre-miRNA-d hsa-mir-194-1 ja hsa-mir-194-2 viivad identse küpse miRNA (hsa-miR-194) avaldumiseni, kuid paiknevad genoomis erinevates kohtades. Päritolu liik on tähistatud kolmetähelise eesliitega, näiteks hsa-miR-123 on inimese (Homo sapiens) ning oar-miR-123 lamba (Ovis aries) miRNA. Teised sageli kasutatavad eesliited: V-viiruslik (miRNA, mis on kodeeritud viiruse genoomi poolt), d-Drosophila miRNA (puuviljakärbes, klassikaline geneetikas kasutatav mudelorganism). Kui kaks küpset miRNAd pärinevad sama pre-miRNA vastasõlgadest (eri otstest), märgitakse need −3p või −5p järelliidetega (varem on kasutatud erinevuse väljatoomiseks 's' (sense) ja 'as' (antisense)). Kui on teada suhtelised üheahelaliste miRNA-de ekspressioonitasemed, tähistab nime taga olev tärn (*) vastava miRNA avaldumist madalamatel tasemetel kui juuksenõela struktuuri vastasõlas olev miRNA. Näiteks miR-123 ja miR-123* jagavad ühist pre-miRNA juuksenõela, aga rakus on rohkem miR-123e.

BiogeneesRedigeeri

miRNAde produktsioon omaenese geenist

Enamik kirjeldatud miRNA geenidest on intergeensed või on orienteeritud antisense positsioonis naabergeenide suhtes ning seetõttu on alust arvata, et neid transkribeeritakse iseseisvate üksustena.^{[31][31][32][33][34]} Kuni 40% miRNA geenidest võivad paikneda valke kodeerivate ja valke mittekodeerivate geenide intronites või isegi mittekodeerivate pikkade transkriptide eksonites.^[35] Need on tavaliselt, kuid mitte ainult, sense orientatsioonis^[36][37] ning on seetõttu harilikult reguleeritud koos oma peremeesgeenidega.^[35][38][39] Teised miRNA-de geenid, mille puhul on näidatud üht ühist promootorit, hõlmavad 42–48% kõikidest miRNA-dest, mis pärinevad polütsistroonsetest ühikutest ning sisaldavad mitmeid diskreetseid (eraldiseisvaid) linge, millest küpsed miRNA-d protsessitakse^[32][40]. See ei tähenda tingimata, et ühe perekonna küpsed miRNA-d on struktuurilt ja funktsioonilt homoloogsed. Eelpool mainitud promootori motiivide puhul on leitud mõningaid sarnasusi (valke kodeerivate) geenide promootoritega, mida transkribeerib RNA polümeraas II.^[32][41] 6% inimese miRNA-de puhul esineb RNA toimetamist (RNA editing): järjestuste kohtspetsiifilisi modifikatsioone, mille eesmärk on toota teistsuguseid produkte, kui algselt kodeeritud DNA poolt. See suurendab miRNA-de tegevuse mitmekesisust ja ulatust kaugelt rohkem, kui seda võimaldab genoom üksinda.

TranskriptsioonRedigeeri

Harilikult transkribeerib RNA polümeraas II (Pol II) miRNA-de geene.^[32][41] Polümeraas seondub sageli promootorile, mis asetseb sellise DNA järjestuse lähedal, mis kodeerib tulevast pre-miRNA (prekursor miRNA- tekib Drosha lõikamise tagajärjel, stem-loop struktuuriga) juuksenõela lingu. Transkriptile lisatakse 5’ otsa cap-struktuur, spetsiifiliselt modifitseeritud nukleotiid, ning polüadenüleeritakse mitme adenosiiniga (adeniin + β-D-riboos), selle tagajärjel moodustub polü(A) saba^[32][36]. Viimaks pre-miRNA splaissitakse. Loomade miRNA-d on algselt transkribeeritud osana ~80 nukleotiidse RNA stem-loop struktuuri õlast. See struktuur moodustab omakorda osa mitmesaja nukleotiidi pikkusest primaarsest miRNAst (pri-miRNA- polümeraas II transkriptsiooni tulemus, selle lõikamisel Droshaga saadakse pre-miRNA).^[32][36] Juhul kui stem-loop prekursor asub 3’ UTR järjestuses, võib transkript funktsioneerida nii pri-miRNA kui ka mRNAna.^[36] RNA polümeraas III (Pol III) transkribeerib mõningaid miRNA-sid, eriti neid, millel on upstream (ülesvoolu) Alu järjestused (teatud tüüpi mobiilsed elemendid); transport RNA-sid (tRNA) ja MWIR (mammalian wide interspersed repeat) promooteri üksuseid.^[42]

Tuumasisene protsessimineRedigeeri

Üksainuke pri-miRNA võib sisaldada 1–6 miRNA prekursorit. Iga juuksenõelastruktuur koosneb umbes 70 nukleotiidist. Juuksenõela ümbritsevad külgedelt efektiivseks protsessinguks vajalikud järjestused. Tuumavalk DGCR8 (DiGeorge Syndrome Critical Region 8 või „Pasha“ selgrootutes), mis on nime saanud DiGeorge sündroomi järgi, tunneb ära juuksenõelte kaheahelalise RNA struktuuri pri-miRNAs. DGCR8 seostub ensüüm Droshaga, mis lõikab RNA-d. Koos moodustavad nad kompleksi^[43], milles DGCR8 suunab Drosha katalüütilist RNaas III domeeni juuksenõela struktuure pri-miRNAst lahti lõikama. Drosha katkestab RNA-d umbes 11 nukleotiidi kauguselt juuksenõela basaalsest osast (kaks helikaalset pööret tüvest eemal). Tekkinud produktil on kahenukleotiidne üleulatuv ots 3’ otsas; 3’ hüdroksüül- ja 5’ fosfaatgrupid. Seda nimetatakse pre-miRNAks (prekursor-miRNA).

Pre-miRNA-sid, mis splaissitakse otse intronitest ning hoiduvad Drosha ja DGCR8 omavahelisest kompleksist, tuntakse mirtronitena. Algselt leiti mirtroneid ainult äädikakärbsel ja varbussil, kuid nüüdseks on neid leitud ka imetajatel.^[44]

Võimalik, et kuni 16% pri-miRNA-dest muudetakse RNA toimetamise (ingl RNA editing) kaudu.^[45][46][47]

Kõige tavalisemal juhul katalüüsib kaheahelalise RNA spetsiifiline adenosiini deaminaas (ingl ADAR- double-stranded RNA-specific adenosine deaminase) adenosiini inosiiniks (A > I) muutumise transitsiooni. RNA toimetamine võib peatada tuumasisest protsessingut (näiteks pri-miR-142 protsessimise, mis viib degradatsioonini ribonukleaas Tudor-SN kaudu) ning muuta downstream (allavoolu) protsesse, kaasa arvatud tsütoplasmaatilist miRNA protsessimist ning märklaua spetsiifilisust (näiteks muutes miR-376 nn alusjärjestust (ingl seed region) kesknärvisüsteemis).^[45]

Eksport tuumastRedigeeri

Eksportiin-5 (ingl exportin-5) transpordib pre-miRNA juuksenõelad tuumast tsütoplasmassse. See valk tunneb ära kahenukleotiidse üleulatuva osa pre-miRNA juuksenõela 3' otsas, mille tekitas RNaas III-set aktiivsust omav Drosha. Eksportiin-5 vahendatud transport tsütoplasmasse vajab lisaenergiat, kasutades Ran valgu külge seotud GTPd.^[48]

Tsütoplasmaatiline protsessimineRedigeeri

Tsütoplasmas lõikab pre-miRNA juuksenõela RNaas III ensüüm Dicer.^[49] See endoribonukleaas interakteerub juuksenõela 3' otsaga ning lõikab ära lingu, mis ühendab 3' ja 5' õlgasid; tootes umbes 22 nukleotiidi pikkuse miRNA-miRNA* dupleksi (guide-ahel ja passanger-ahel, viimane on tähistatud tärniga ning läheb lagundamisele, esimene seevastu ühineb RISC kompleksiga). Üleüldine juuksenõela pikkus ja lingu suurus mõjutavad Diceri protsessimise efektiivsust, samuti mõjutab lõikamist miRNA-miRNA* paardumise mittetäielik iseloom.^[49][50] Kuigi potentsiaalselt võivad funktsionaalse miRNAna tegutseda mõlemad dupleksiahelad, kaasatakse harilikult ainult üks neist RNA-indutseeritud vaigistamise kompleksi (RISC- RNA-induced silencing complex), kus toimub miRNA ja tema märklaud-mRNA interakteerumine.

Biogenees taimedesRedigeeri

miRNA-de biogenees taimedes erineb biogeneesist loomades põhiliselt tuumasisese protsessimise ja ekspordi etappides. Küpsemisjärgus miRNAd ei lõika taimedes kaks erinevat ensüümi, vaid mõlemat lõikamist teostab Diceri homoloog, lühendatult DL1 (ingl Dicer-like). DL1 ekspresseerub ainult taimerakkude tuumades, mis viitab sellele, et mõlemad reaktsioonid leiavad aset tuumasiseselt. Enne kui taime miRNA-miRNA* dupleksid tuumast välja transporditakse, metüleerib Hua-Enhancer1 (HEN1) nende 3' üleulatuvad otsad. Seejärel transpordib valk Hasty (HST, Eksportiin-5 homoloog) dupleksi tuumast tsütoplasmasse. Tsütoplasmas dupleks laguneb ja küps miRNA ühendatakse RISC kompleksiga.^[51]

RISC kompleksRedigeeri

Archaeoglobus fulgiduse (arhe) argonatuvalgu PIWI domeen seotuna lühikese kaheahelalise RNA fragmendi külge. Argonauti sisaldava RISC kompleksi seondumine RNA juhtahela 5' otsa on RNA interferentsi jaoks kriitilise tähtsusega. (Konserveerunud türosiini jääk on näidatud helesinisega, kahevalentne magneesiumi katioon halli kerana)

Põhiartikkel: RNA-induced silecing complex

Küps miRNA on osa aktiivsest RISC kompleksist, mis sisaldab veel Dicerit ja mitmeid assotsieerunud lisavalke.^[52] RISCi tuntakse ka mikroRNA nukleoproteiin kompleksina (ingl miRNP – microRNA ribonucleoprotein complex),^[53] miRNAga seostunud RRISC-ile viidatakse mõnikord ka kui 'miRISC-le.

Diceri pre-miRNA protsessing võib toimuda paaris dupleksi lahtikeerdumisega. Üldiselt on RISC kompleksiga seotud ainult üks ahel, mis on valitud tema termodünaamilise ebastabiilsuse ja nõrgema aluspaardumise tõttu võrreldes teise ahelaga.^[54][55][56] Stem-loop struktuuri positsioon võib samuti mõjutada ahela valikut.^[57] Teist ahelat nimetatakse passenger-ahelaks tema madalamate tasemete pärast stabiilses seisundis ning tähistatakse tärniga (*). Reeglina passenger-ahel degradeeritakse. Mõningatel juhtudel on mõlemad dupleksiahelad elujõulised ning saavad funktsionaalseteks miRNA-deks.^[58]

RISC kompleksi funktsiooni täitmisel on tsentraalse tähtsusega argonaut (Ago) valgu perekonna liikmed. Argonaute on vaja miRNA-indutseeritud geenide vaigistamiseks, nad sisaldavad kahte konserveerunud RNA seondamise domeeni: PAZ domeen, millele saab seonduda küpse miRNA üheahelaline 3' ots ning PIWI domeen, mis sarnaneb struktuurilt ribonukleaas H-ga ning funktsioneerib, interakteerudes juhtahela 5' otsaga. Nad seovad küpset miRNA-d ning orienteerivad seda interaktsiooniks märklaud mRNAga. Mõned argonaudid, näiteks inimese Ago2, otseselt lõikavad märklaua transkripti. Argonaudid võivad ka värvata lisavalke saavutamaks translatsioonilist repressiooni.^[59] Inimese genoom kodeerib kaheksat argonaut-valku, mis jagatakse järjestuste sarnasuste alusel kahte perekonda: AGO (selle perekonna neli esindajat leiduvad kõikides imetajate rakkudes, inimese rakkudes nimetatakse neid E1F2C/hAgo-deks) ning PIWI (leitud idutee ning hematopoeetilistest tüvirakkudest).^[59][60]

Täiendavad RISC kompleksi komponendid hõlmavad TRBP-d (ingl human immunodeficiency virus (HIV) transactivating response RNA (TAR) binding protein),^[61] PACT-i (ingl protein activator of the interferon induced protein kinase(PACT)), SMN kompleksi, fragiilse X vaimse puude valku (ingl FMRP-fragile X mental retardation protein) ja Tudori stafülokokset nukleaas-domeeni sisaldav valku (ingl Tudor-SN -Tudor staphylococcal nuclease-domain-containing protein).^[62][63]

Vaigistamise moodusRedigeeri

Geeni saab vaigistada mRNA-d degradeerides või takistades translatsiooni mRNAlt. On demonstreeritud, et täieliku komplementaarsuse korral miRNA ja tema märklaud-mRNA järjestuse vahel saab Ago2 mRNA-d lõigata ning juhtida selle otsesele degradatsioonile. Kuid kui täielikku komplementaarsust ei esine, siis saavutatakse geeni vaigistamine translatsiooni ärahoidmise teel.^[15]

miRNA-de stabiliseerimineRedigeeri

Küpsete miRNA-de ringlus on vajalik järskudeks muutusteks miRNA-de avaldumisprofiilides. miRNA küpsemise jooksul tsütoplasmas tema kasutuselevõtt argonaut-valgu poolt arvatakse olevat stabiliseeriva mõjuga guide-ahelale, samal ajal kui passenger-ahel eelistatult hävitatakse. Seda on nimetatud ka "Use it or lose it" strateegiaks (Kasuta või kaota strateegia). Argonaut võib eelistatult säilitada miRNA-sid, millel on palju märklaudu, miRNA-de suhtes, millel on mõni üksik või ei ole ühtki märklauda. See viib tavaliselt märklaudu mitteomavate molekulide lagundamiseni.^[64]

C.elegans'is vahendab küpsete miRNA-de lagundamist 5´> 3´ suunaline eksoribonukleaas XRN2, tuntud ka kui Rat1p.^[65] Taimedes lagundavad miRNA-sid SDN (ingl small RNA degrading nuclease) perekonna liikmed vastupidises suunas (3 '> 5'). Sarnaseid ensüüme kodeeritakse ka loomade genoomides, aga nende roll pole veel teada.^[64] Mitmed miRNA modifikatsioonid mõjutavad tema stabiilsust. Nagu näidatud töös mudelorganismiga Arabidopsis thaliana (harilik müürlook), küpsed taime miRNA-d paistavad olevat stabiliseeritud lisa metüülrühmadega 3' otsas. 2'-O-konjugeeritud metüülrühmad blokeerivad uratsiili (U) jääkide lisandumise 3' otsa uridüültransferaasi ensüümi abil. Seda viimast modifikatsiooni on seostatud võimaliku miRNA degradatsiooniga. Siiski, uridülatsioon võib osasid miRNA-sid hoopis kaitsta. Selle modifikatsiooni tagajärjed pole lõplikult teada. On täheldatud mõnede loomsete miRNA-de uridülatsiooni. Nii taimseid kui loomseid miRNA-sid saab muuta adeniini (A) jääkide lisamisega miRNA 3' otsa. Lisa A lisamine imetaja miR-122le, liver-enriched miRNA, mis on oluline C-hepatiidi puhul, stabiliseerib selle molekuli. Adeniini jäägiga lõppevad taimsed miRNA-d lagunevad aeglasemalt.^[64]

Rakulised funktsioonidRedigeeri

miRNA-de funktsioon seisneb geeniregulatsioonis. Geenide aktiivsuse mõjutamiseks on miRNA-d komplementaarsed osaga ühest või mitmest informatsiooni-RNAst (mRNA) (ingl mRNA-messenger RNA). Loomade miRNA-d on tavaliselt komplementaarsed saidiga 3' UTRs, samal ajal kui taimede miRNA-d on harilikult komplementaarsed mRNA-de kodeerivate järjestustega.^[66] Perfektne või peaaegu täiuslik aluspaaride seondumine märklaud mRNAga indutseerib RNA lõikamist.^[67] See on taimset päritolu miRNA-de esmane talitlusviis.^[68] Loomades paarduvad miRNA-d sageli vaid osaliselt ning inhibeerivad märklaud-mRNA valgu translatsiooni^[69] selline mehhanism esineb ka taimedes, kuid harvemini.^[68][70] mikroRNA-d, mis on märklaua suhtes osaliselt komplementaarsed, saavad kiirendada deadenülatsiooni, põhjustades mRNA-de varajasema degradatsiooni. Selleks, et osaliselt komplementaarsed miRNA-d oma märklauad ära tunneksid, peavad nukleotiidid 2–7 mRNA seed järjestuses^[6][9] olema perfektselt komplementarsed mRNA teatud järjestusega.^[71] miRNA-d võivad aeg-ajalt põhjustada histoonide modifitseerimist ning DNA promootorsaitide metülatsiooni, mis mõjutab märklaudgeenide avaldumist.^[72][73]

Erinevalt taimede miRNA-dest on loomades miRNA-de märklauaks väga lai valik geene.^[9] Siiski on kõikidele rakkudele omaste funktsioonidega seotud geenides suhteliselt vähem miRNA-de märklaudsaite ning tundub, et sellised geenid on valiku all, vältimaks miRNA-de märkalauaks olemist.^[74]

dsRNA-d (double-strand RNA) võivad aktiveerida geeniekspressiooni, see mehhanism on saanud nimetuse "väikese RNA indutseeritud geeniaktivatsioon" (ingl small RNA-induced gene activation, RNAa).^[75] dsRNA-d võivad indutseerida endaga seotud geenide potentsiaalset transkriptsiooni aktivatsiooni. Seda omadust on demonstreeritud inimese rakkudes, kasutades sünteetilisi dsRNA-sid, mida kutsutakse väikesteks aktiveerivateks RNA-deks (ingl saRNAs – small activating RNA molecules), aga on näidatud ka endogeensete miRNA-de puhul.^[75][76]

miRNA-de ja geenide (või pseudogeenide) komplementaarsetel paardumistel ning homoloogilistel järjestustel põhinevad interaktsioonid arvatakse olevat tugikanal, mis reguleerib paraloogsete geenide (ühise eellasega järjestused, tekivad duplikatsiooni teel) ekspressioonitasemeid. "Võistlevate endogeensete RNA-de" (ingl competing endogenous RNAs (ceRNAs) ) nime all tuntud miRNA-de ülesandeks on seonduda "mikroRNA vastuselementidele", geenidele ja pseudogeenidele, sel moel pakkudes veel ühe seletuse mittekodeeriva DNA ("rämps" DNA) püsivusele.^[77]

EvolutsioonRedigeeri

mikroRNA-d on olulised fülogeneetilised markerid oma märkimisväärselt madala evolutsioneerumisastme tõttu.^[78] Nende tekkimine võib olla üks põhjus, mis on võimaldanud arengut morfoloogiliste uuenduste vallas ning geeniekspressiooni spetsiifilsemaks muutumist ja peentuunimist (ingl fine-tuning), lubades sel viisil komplekssete organite teket^[79] ning lõppkokkuvõttes ehk ka kompleksset elu.^[80] Tõepoolest, järsud morfoloogiliste uuenduste plahvatused on üldjuhul seotud suurte koguste miRNA-de akumulatsiooniga.^[78][79]

mikroRNA-d pärinevad predominantselt juhuslike juuksenõel-struktuuride moodustumise tõttu mittekodeerivas DNA-s (intronid või intergeensed piirkonnad), aga ka juba olemasolevate mikroRNA-de duplikatsioonide ja modifikatsioonide käigus.^[81] Evolutsioneerumise aste (ingl rate of evolution) evolutsioonilises mõttes hiljuti tekkinud miRNA-des on võrreldav mujal mittekodeerivas DNAs esinevate miRNA-dega, vihjates neutraalse triivi kaudu toimunud evolutsioonile. Vanematel miRNA-del on palju madalam järjestuste muutumisaste (sageli vähem kui üks asendus saja miljoni aasta kohta),^[80] viidates, et kui miRNA omandab mingi funktsiooni, satub ta äärmusliku puhastava valiku alla.^[81] Sellesse punkti jõudnuna läheb miRNA üliharva looma genoomist kaotsi,^[80] kuigi hiljutisest ajast (mõeldud on evolutsioonilist aega) pärinevad miRNA-d (värskelt tekkinud), mis on seega ilmselt mittefunktsionaalsed, lähevad pidevalt kaotsi.^[81] See muudab nad väärtuslikeks fülogeneetilisteks markeriteks ning neid vaadatakse kui võimalikke lahendusi väljapaistvatele fülogeneetilistele probleemidele, näiteks antropoodide omavahelised suhted.^[82]

mikroRNA-d esinevad enamiku eukarüootsete organismide genoomides, pruunvetikatest^[83] loomadeni. Kõikides liikides kokku on 2010. aasta märtsi seisuga identifitseeritud üle 5000 miRNA.^[84] Kuigi bakterites esinevad võrreldava funktsiooniga lühikesed (50 – sadu aluspaare) RNA järjestused, puuduvad neis siiski tõelised miRNA-d.^[85]

miRNA-de eksperimentaalne avastamine ja manipulatisoonRedigeeri

miRNA-de ekspressiooni võib loendada kaheetapilises polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR; ingl real-time polymerase chain reaction) protsessis, millest esimene on modifitseeritud RT-PCR, sellele järgneb kvantitatiivne reaalaja PCR. Selle meetodi variatsioonid võimaldavad leida miRNA-de absoluutse või suhtelise hulga.^[86]

miRNA-sid saab hübridiseerida mikrokiipidele (ingl microarray), mis on plaadid või kiibid kaevukestega sadade või tuhandete miRNA märklaudadega, nii et miRNA-de suhtelisi tasemeid erinevates proovides saab kindlaks määrata.^[87] mikroRNA-sid saab avastada ja profileerida suure läbilaskvusega sekveneerimismeetoditega.^[88] miRNA aktiivsust saab eksperimentaalselt inhibeerida lukustatud nukleiinhappe (LNA- ingl locked nucleic acid) oligo, Morpholino oligo^[89][90] või 2`-O-metüül-RNA oligo järjestusega.^[91] Lisaks võib spetsiifilist miRNA-d vaigistada komplementaarse antagomir järjestusega (lühike sünteetiline märklaud-miRNAle komplementaarne järjestus). miRNA küpsemist võivad mitmetes punktides inhibeerida steric-blocking oligojärjestused.^[92] Nende oligojärjestustega saab blokeerida ka mRNA transkripti miRNA märklaudjärjestust.^[93][94] LNA on miRNA-de “in situ” detektsiooniks praegu ainus efektiivne meetod.^[95] LNA lukustatud konformatsioon põhjustab suurenenud hübridisatsiooniomadusi ning vähendab tundlikkust ja selektiivsust, tehes selle ideaalseks lühikeste miRNA-de tuvastamiseks.^[96]

miRNA-d ja haigusedRedigeeri

Just nagu miRNA-d on seotud eukarüootse raku normaalse funktsioneerimisega, on miRNA-de düsregulatsiooni seostatud haigustega. Käsitsi hallatud avalikus andmebaasis miR2Disease dokumenteeritakse teadaolevad suhted miRNA-de düsregulatsiooni ja inimese haiguste vahel.^[97]

miRNA-d ja pärilikud haigusedRedigeeri

Mutatsioon miR-96 alusjärjestuses (ingl seed region) põhjustab pärilikku progressiivset kuulmiskaotust.^[98] Mutatsiooni miR-184 seemnejärjestuses tagajärjeks on pärilik keratokoonus (kreeka kerato 'sarv, sarvkest'; konos 'koonus') koos eesmise polaarse kataraktiga.^[99] miR-17 ~92 klastri deletsioon põhjustab skeleti ja kasvu defekte.^[100]

miRNA-d ja vähkRedigeeri

Mitme miRNA puhul on leitud seoseid mitmesuguste vähitüüpidega.^[101][102] miRNA-21 oli üks esimesi mikroRNA-sid, mis identifitseeriti kui onkomiR. Katse hiirtega, keda oli muudetud tootma ülehulgas c-Myc-d, näitas, et miRNA-del on roll vähi arengus. c-Myc on muteerunud vormidega valk, mis on seotud mitmete kasvajatüüpidega. Hiirtel, kes olid kavandatud produtseerima liiga palju erinevaid lümfis leiduvaid miRNA-sid, arenes haigus 50 päeva jooksul ning nad surid kaks nädalat hiljem. Võrdluseks, hiired ilma miRNA-de liigsete kogustega elasid üle saja päeva.^[101]

Leukeemiat võib põhjustada viiruse genoomi insertsioon miRNA-de rea 17–92 kõrvale, viies selle miRNA suurenenud ekspressioonini.^[103] Ühes teises uurimuses näidati, et kaks miRNA-de tüüpi inhibeerivad E2F1 valku, mis reguleerib raku proliferatsiooni. Antud juhul järeldub, et miRNA seostub mRNA-ga enne, kui sellest jõuavad translatsiooni teel tekkida valgud, mis lülitavad geene sisse ja välja.^[104]

Mõõtes 217-ne miRNA-sid kodeeriva geeni aktiivsust, leiti, et on võimalik tuvastada geenimustreid, mis on erinevat tüüpi vähkide puhul erinevad (mingi kindel muster on iseloomulik mingile vähitüübile). miRNA-de signatuurid annavad võimaluse vähi klassifikatsiooni loomiseks. See võimaldab arstidel kindlaks teha koe, kust vähk on alguse saanud, ning määrata ravi mis põhineb algsel koetüübil. miRNA-de profileerimine on juba praegu võimaldanud kindlaks teha, kas patsientidel kroonilise lümfotsütaarse leukeemiaga (KLL) on vähi aeglane või agressiivne vorm.^[105]

Teatud miRNA-sid ala- või üleekspresseerivate hiirte uurimine on lubanud pilgu heita väikeste RNA-de rollile mitmesugustes pahaloomulistes kasvajates.^[106]

Kliinilistel katsetustel on praegu uudne miRNA-de profileerimisel põhinev sõeluuring varases staadiumis oleva kolorektaalse vähi (käärsooles (ladina colon) või pärasooles (ladina rectum)) tuvastamiseks. Esimesed tulemused on näidanud, et varase eemaldatava (II staadiumi) kolorektaalse vähiga patsientide vereplasma proove on võimalik eristada samasooliste ja -vanuseliste tervete vabatahtlike proovidest. Piisava selektiivsuse ja spetsiifilisuse on võimalik saavutada kasutades väikeseid (alla 1 ml) vereproove. Sellel testil on potentsiaal saada tasuvaks mitteinvasiivseks mooduseks identifitseerida riskirühma kuuluvaid patsiente, kes muidu peaksid läbima kolonoskoopia protseduuri.^[107][108]

Teiseks miRNA-de kasutusalaks vähi puhul on nende ekspressioonitasemete kasutamine prognostikaks, näiteks uurimuses NSCLC (mitteväikerakuline kopsukartsinoom) (ingl non-small-cell lung carcinoma) proovidest leiti, et madalad miR-324a tasemed võivad olla prognostiliseks indikaatoriks kehva elumuse jaoks;^[109] teine uurimus näitas, et kas kõrged miR-185 või madalad miR-133b tasemed korreleeruvad metastaasi ja madala elumusega kolorektaalse vähi puhul.^[110]

miRNA-d ja südamehaigusedRedigeeri

Varem on miRNA-de rolli südames käsitletud kui konditsionaalset miRNA maturatsiooni pärssimist hiire puhul, ning on selgunud, et miRNA-d tõepoolest mängivad südame arengus olulist rolli.^[111][112] miRNA-de ekspressiooni profileerimise uuringud demonstreerivad, et spetsiifiliste miRNA-de avaldumistasemed inimeses muutuvad südame haigestumise korral, viidates nende seotusele kardiomüopaatiale.^{[113][114][115]} Veelgi enam, spetsiifilised uuringud loommudelite peal on tuvastanud miRNA-de selgelt eristuvad rollid südame arengu jooksul ning patoloogiliste tingimuste korral, hõlmates kardiogeneesi võtmekomponentide regulatsiooni, hüpertroofilise kasvu (hüpertroofia – elundi või koe mahu suurenemine) vastust ja südame juhtivust.^{[112][116][117][118][119]}

miRNA-d ja närvisüsteemRedigeeri

miRNA-d paistavad reguleerivat ka närvisüsteemi.^[120] Neuraalsed miRNA-d osalevad mitmesugustes sünaptilise arengu etappides, kaasa arvatud dendriitide geneesis (hõlmab miR-132, miR-134 ja miR-124), sünapsi moodustumises ja küpsemises (miR-134 ja miR-138 arvatakse olevat seotud).^[121] Mõned uurimused on leidnud skisofreenia korral muutunud miRNA-de ekspressiooni.^[122][123]

miRNA-d ja mittekodeerivad RNA-dRedigeeri

Kui inimese genoomi projekti raames kaardistati esimene kromosoom 1999. aastal, ennustati, et inimese genoom sisaldab üle saja tuhande valku kodeeriva geeni. Vaatamata sellele oli 2004. aastaks viimaks identifitseeritud ainult 20 000 geeni ringis (International Human Genome Sequencing Consortium poolt).^[124] Alates sellest ajast on kombineeritud bioinformaatika lähenemisi genoomi mosaiiksuse uuringutega, mis vaatlevad transkriptoomi,^[125] süstemaatilise täispikkuses cDNA raamatukogude cDNA järjestamise^[126] ja eksperimentaalse hindamisega^[127] (hõlmates miRNA-de tuletatud antisense oligonukleotiidide ehk antagomiride loomist). Selline meetod on paljastanud, et paljud transkriptid on valku mittekodeerivad RNA-d, sisaldades ka mitmesuguseid snoRNA-sid ja miRNA-sid.

Telomeer

Telomeer (vanakreeka sõnadest τέλος (telos) 'lõpp' ja μέρος (merοs) 'osa') on DNA ahela piirkond enamiku liikide eukarüootse raku kromosoomi kummaski otsas.

Telomeerid (valged) inimese kromosoomide (hallid) otstel

Telomeer

Telomeeri ülesanne on kaitsta kromosoomi otsi kahjustuse eest. Iga rakujagunemise käigus väheneb DNA ahela pikkus kromosoomi otstest just telomeeride piirkonnast, et kahjustada ei saaks geenid.

Telomeeride teine ülesanne on rakujagunemiste regulatsioon. Rakk on jagunemisvõimeline kuni telomeeride kriitilise pikkuseni; selle pikkuseni jõudes lakkab rakk jagunemast.

Telomeeride pikkus sõltub ka telomeraasi aktiivsusest. Telomeraasi RNA-komponent sisaldab telomeeri DNA-ga komplementaarset järjestust, mis toimib matriitsina telomeeri vastavate järjestuste sünteesimisel; nii saavad telomeerid tänu telomeraasile uueneda. Telomeraasi aktiivsus eri tüüpi rakkudes võib olla väga erinev. Tavalisest suurem telomeraasi aktiivsus on seotud ka vähi tekke ja arenguga. Ligikaudu 90% kasvajates on telomeraas tavalisest aktiivsem.

Uurimislugu

Telomeeri ja telomeraasi ehitus

Telomeerid esinevad peaaegu kõigil eukarüootsetel rakkudel. Prokarüootidel selline struktuur puudub, sest erinevalt eukarüootidest on neil rõngaskromosoom. Telomeerid koosnevad kuni mitmest tuhandest lühikese korduva struktuuriga järjestusest. Inimese puhul on nendeks TTAGGG järjestused, mis on omavahel seotud spetsiifiliste valkudega. Erinevatel organismidel on pisut erinevad järjestused. Näiteks on korduvaks järjestuseks putukatel TTAGG ja kõrgematel taimedel TTTAGGG. Guaniini (vastasahelas tsütosiini) on kordustes rikkalikult ja ühe korduse pikkus jääb enamjaolt vahemikku 6–8 aluspaari. Ka telomeeride pikkus varieerub olulisel määral, alates ligikaudu 300 aluspaarist pärmil kuni mitme tuhande aluspaarini inimesel. Telomeersed otsad ei ole sugugi lineaarsed, vaid moodustavad keerukaid struktuure, mida nimetatakse telomeeri lingudeks ehk T-lingudeks. Esmalt moodustub suur ring, mis on stabiliseeritud telomeeri seostusproteiinidega (TRF1). Telomeeri otsas olev üheahelalise DNA jupp on aga paardunud kaheahelalise telomeeri alaga, segades selle paardumist heeliksiks. Selle tulemusel tekib kolmeahelaline piirkond, mida nimetatakse T-linguks.

T-ling

Telomeraas on nukleoproteiin, mis inimesel sisaldab telomeraasi pöördtranskriptaasi aktiivsust (hTERT) ja telomeraas RNA-d (hTR). Pöördtranskriptaasid on sellised ensüümid, mis sünteesivad RNA-lt DNA-d. See on keskse molekulaarbioloogia dogma erand, sest tavaliselt sünteesitakse DNA-lt RNA ja RNA-lt omakorda valgud. hTR koosneb üheteistkümnest kordusega komplementaarsest aluspaarist ja käitub matriitsina pöördtranskriptaasile. Selle tulemusel lisatakse kromosoomi DNA 3´ otstele uusi kordusi.

Ülesanded

Telomeeride peamiseks ülesandeks on kompenseerida raku jagunemise käigus toimuvat kromosoomide lühenemist. DNA polümeraasi puuduste tõttu telomeeride pikkus väheneb replikatsiooni käigus 50–200 aluspaari. Seega tänu telomeeridele ei lähe kaduma rakule olulisi geenijärjestusi, vaid eemaldub jupp kordusjärjestust, mis valke ei kodeeri. Telomeer on tänu telomeraassele aktiivsusele võimeline pikenema. Telomeerid somaatilistes rakkudes ei pikene aga lõpmatuseni ja see annab telomeeridele veel teise ülesande, milleks on rakujagunemiste kontroll. Rakk teeb läbi teatud hulga jagunemisi, mis on eri rakutüübiti erinev ja on määratud telomeeride pikkusega. Mida pikem on telomeer, seda rohkem jagunemisi rakk saab läbi viia. Teatud punkti jõudes, kui telomeerid on lühenenud, jagunemine peatub ja rakk siseneb püsivasse kasvuaresti ehk vananemisfaasi. Seega on ka vananemine reguleeritud telomeeridega. Kui aga mingi mutatsiooni mõjul ei lõpeta rakk jagunemist ja telomeerid muutuvad kriitiliselt lühikeseks, tekib kromosomaalse ebastabiilsus ning algab apoptoos ehk programmeeritud rakusurm. Rakkudel, mis kogu organismi elu vältel paljunema peavad, on aktiivne telomeraas. Sellised rakud on näiteks idurakud ja vereloome tüvirakud. Enamikus somaatilistes rakkudes on telomeraas represseeritud ja see põhjustab rakkude piiratud jagunemisvõimet.

Telomeerid on vajalikud ka selleks, et rakkude jagunemist ei peatataks liiga vara. Nimelt toimib rakus kontrollsüsteem, mis tuvastades DNA lahtise otsa või katke, peatab rakujagunemise. Selline kontrollsüsteem on üldiselt vajalik vältimaks paljude mutatsioonide edasikandumist. Telomeerid katavad kromosoomi otsi nii, et kontrollsüsteem ei tuvasta neid DNA katketena. Telomeerid kaitsevad kromosoome ka tuumas olevate ensüümide lagundava toime eest. Samas on takistatud ka kromosoomide omavaheline kokkujäämine.

Telomeerid ja vähk

Seda, et telomeerid on seotud vähiga, pakuti välja juba 1990. aastal. 1994. aastal õnnestuski Christopher M. Counteril, Silvia Bacchettil, Calvin B. Harleyl koos kolleegidega McMasteri Ülikoolist näidata, et telomeraas on aktiivne vähkkasvaja rakkudes.

Juhul kui rakutsükli kontrollpunktid ei toimi korrektselt, võib rakk läbida rakujagunemise peatumise faasi ja jätkata jagunemist. Sellised rakud lähevad faasi, mida nimetatakse kriisiks. Kriisis on telomeerid lühenenud, aga rakud püüavad endiselt jaguneda. Selles faasis on rakkude jagunemine ja suremine tasakaalus. Lühenenud telomeeridega rakkude kromosoomid muutuvad ebastabiilseks. Mitmed kromosomaalsed ümberkorraldused hakkavad toimuma. Sellised suured muutused võivad viia kasvaja supressormehhanismide kaoni, apoptoosist hoidumiseni ja ka telomeraasi uuesti aktiivseks muutumiseni. Kui telomeraas on taasaktiveeritud või rohkem aktiivne, siis see võib viia rakkude seas erinevate tulemusteni. Esiteks, kui telomeraasi ei produtseerita piisavalt, siis pole need rakud võimeliselt pikaajaliselt jagunema ja suurt pahaloomuliste vähirakkude hulka ei moodustu. Teiseks, telomeraasi toodetakse liias, sel juhul telomeerid pikenevad kiiresti. Selliseid olukordi tekib reaalses elus aga suhteliselt harva, seda esineb vähem kui 10% vähkidel. Kõige sagedasem on olukord, kus telomeeride pikkus vähirakkudes on sama või väiksem kui vastava normaalse koe rakkudes. Sel juhul areneb pahaloomuline kasvaja.

Telomeraasi on leitud ligikaudu 90% kasvajarakkudes ja see on sageli ka 10–20 korda aktiivsem kui tavalistes rakkudes. Telomeraasi abil saavutavad rakud surematuse. Kui rakud paljunevad kontrollimatult, võivad need tungida lähedastesse kudedesse ja neid kahjustada. Mõned kasvajarakud võivad kehas liikuda uutesse piirkondadesse ja algatada uute kasvajate arengu.

Teraapiad

Kuna telomeraas ei ole aktiivne enamikus tavalistes inimese rakkudes, siis püüavad mitmed teadlased üle kogu maailma välja töötada telomeraasi abil toimivat vähiteraapiat. Proovitakse eri viisidel inhibeerida telomeraasi. Mitu strateegiat, mis on suunatud kas telomeraasi RNA komponendi (hTR) või katalüütilise ühiku (TERT) vastu, on praegu jõudnud kliiniliste katsete faasi. hTR-le suunatud ravi toimub antisense oligonukleotiidide ja ribosüümide abil. Antisense oligonukleotiidid on komplementaarsed osaga hTR-ist ja seetõttu oligonukleotiid paardub hTR-ga. See takistab telomeraasi seondumist telomeerile või hoopis algatab RNA lagundamise. Ka ribosüüm seondub komplementaarsuse alusel ja lagundab RNA-d. hTERT-i inhibeerimiseks kasutatakse erinevaid pöördtranskriptaasi inhibiitoreid, näiteks BIBR1532, mis on sünteetiline molekul, kuid inhibeerivaid komponente on leitud ka puuvõrgus ja rohelises tees.

Tsütopaatiline efekt

Tsütopaatiline efekt, ka tsütopatogeenne efekt (inglise keeles Cytopathic effect, lühendatult CPE), on viiruslikust infektsioonist põhjustatud struktuursed muutused peremeesrakus. Selline efekt ilmneb siis, kui nakatav viirus lüüsib raku või kui rakk ise ei suuda enam jaguneda ja sureb. Kui selliste morfoloogiliste muutuste taga on viirus, on tegemist tsütopatogeense viirusega. Kõige tavalisemad näited tsütopatogeensest efektist on peremeesraku ümardumine, kõrvalolevate rakkude liitumine üheks hulktuumseks rakuks ehk sünsüütsiumiks ning nukleaarsete või tsütoplasmaatiliste inklusioonkehakeste moodustumine.

Herpes simplex viiruse tsütopaatiline efekt, näha mitmetuumsus. Värvitud Pap-värvimise protokolli järgi

Tsütopaatilise efekti ülesanne

Viiruslike komponentide sünteesi ajal toimuvad rakus erinevad morfoloogilised ja biokeemilised muutused. Selliseid iseloomulikke muutusi on kõige parem vaadata koekultuuris, kus saab sünkroonida rakkudega nakatamist viirusega. Samuti saab koekultuuris kasvatatud rakke uurida lihtsasti ja kiiresti ka infektsiooni käigus. Morfoloogilisi muutusi rakkudes viirusega nakatumise ajal nimetatakse tsütopaatiliseks efektiks. Selle eest vastutav viirus on aga tsütopatogeenne. See, kui tugev on tsütopaatiline efekt, sõltub viirusest, peremeesrakkudest, infektsiooniliste partiklite arvukusest (inglise keeles multiplicity of infection, lühendatult MOI) ja veel muudest teguritest. Mõned viirused põhjustavad väga madalat tsütopaatilist efekti oma looduslikes peremeesrakkudes. Selliste viiruste olemasolu rakkudes saab kontrollida ainult hemadsorptsiooniga või interferentsiga, Mõned viirused aga põhjustavad pärast infektsiooni täielikku ja kiiret peremeesraku üksikkihi hävinemist. Kuna viiruste põhjustatud tsütopaatiline efekt on spetsiifiline, siis on võimalik selle kaudu tuvastada tundmatuid viirusi. Idee klassifitseerida viirusi tsütopaatilise efekti järgi pakkus 1954. aastal välja J. F. Enders. Tema rühmitas viirusi järgmiselt:

• need, mis põhjustavad raku degradatsiooni;
• need, mis põhjustavad inklusioonkehakeste moodustumist ja rakkude degradatsiooni;
• need, mis põhjustavad hulktuumsete rakkude moodustamist;
• need, millel ei esine nähtavat tsütopaatilist efekti.

Kuigi selline informatsioon on jätkuvalt oluline, on tänapäeval olemas paremaid mehhanisme viiruste klassifitseerimiseks.

Tsütopaatilise efekti tüübid

Täielik hävitamine

Peremeesraku monokihi täielik hävitamine on tsütopaatilise efekti kõige raskem vorm. Selle uurimiseks külvatakse rakud üksikkihina pinnale, näiteks Petri tassile, nii, et nad kataksid seda täielikult. Saadud rakkude kiht nakatatakse viirusega. Kõik rakud ja nende tuumad tõmbuvad kokku ning vabanevad tassi küljest kolme päeva jooksul. Selline tsütopaatilise efekti tüüp on iseloomulik enteroviirustele.

Osaline hävitamine

Sarnaselt totaalse hävitamisega uuritakse seda nii, et külvatakse rakud üksikkihina Petri tassile ja oodatakse, et tass kasvaks täiesti täis, ning siis nakatatakse viirusega. Siin ilmneb tsütopaatiline efekt rakkude osalises lahtitulekus ja hävinemises. See on omane togaviirustele, mõnedele pikornaviirustele ja paramüksoviirustele.

Fokaalne degeneratsioon

Fokaalne degeneratsioon põhjustab lokaalset rünnakut peremehe rakkude üksikkihile. Selline tsütopaatiline efekt võib küll lõpuks koe hävitada, aga algsed staadiumid ja viiruse levik toimuvad rakkude sees lokaliseerutud viiruslikes keskustes. Selline tsütopaatiline efekt põhjustab peremeesrakkudes iseloomulikke muutusi. Rakud suurenevad, muutuvad ümaraks ja refraktiilseks. Lõpuks tulevad peremeesrakud pinna küljest ka lahti. Viiruse levik toimub nii, et lahtitulevad rakud on ümbritsetud suurenenud ümarate rakkudega, mis on ümbritsetud tervete kudedega. Sellist tsütopaatilist efekti võib näha herpesviirustel ja poksviirustel.

Paisumine ja kokkukleepumine

Paisumine ja kokkukleepumine on selline tsütopaatiline efekt, mille tagajärjel rakud paisuvad märgatavalt. Suurenedes rakud kleepuvad omavahel kokku ja moodustavad klastreid, mis näevad välja nagu viinamarjakobarad. Lõpuks tulevad rakud ka pinna küljest lahti. Selline tsütopaatiline efekt on omane adenoviirustele.

Vahutav degeneratsioon

Vahutav degeneratsioon (teisiti öeldes ka vakuoliseerumine) on degeneratsioon, mille tagajärjel moodustuvad suured ja/või arvukad vakuoolid peremeesraku tsütoplasmasse. Mitmed viiruste perekonnad, kaasa arvatud mõned retroviirused, paramüksoviirused ja flaviviirused võivad põhjustada sellist efekti. Vakuoliseerumist on keeruline näha ilma värvimiseta.

Rakkude integratsioon ehk sünsüütsium

Rakkude integratsioon ehk sünsüütsium hõlmab nelja või enama raku kokkusulamist üheks, moodustades mitmetuumse raku. Väikesed sünsüütsiumid on nähtavad ainult pärast värvimist. Mõnede paromüksoviiruste jaoks on see ainus tsütopaatilise efekti vorme. Seda kasutavad veel ka herpesviirused, kuid neil esineb ka muid vorme. Rakkude integratsiooni tuleb eristada lihtsalt kokkukleepumisest või klastrite moodustumisest.

Inklusioonkehakesed

Inklusioonkehakesed on alad rakus, mis värvuvad valikuliselt. Neid ei saa näha elusrakkude kultuuris. Selline tsütopaatiline efekt on sõltuv nakatava viiruse tüübist. Kehakesed võivad esineda üksikult või mitmekesi koos, olla suured või väikesed, ümarad või ebaregulaarse kujuga, tuumasisesed või tsütoplasmaatilised, eosinofiilsed (värvuvad roosalt) või basofiilsed (värvuvad sinakaslillalt). Võib esineda ka kromatiini marginatsioon, mille puhul põhjustab värvimine peenikese joone ümber tuuma. Enamasti näitavad inklusioonkehakesed alasid rakus, kus sünteesitakse viiruse valke või nukleiinhappeid või kohti, kus pannakse kokku virione. Mõnedel juhtudel pole inklusioonkehakeste tekkimiseks vajalik aktiivse viiruse olemasolu, sest need võivad näidata ka viiruslike armide asukohti.

Diagnostika

Mõnede viiruste tsütopaatilised efektid on ainult neile omased ning seetõttu on olulised vahendid viroloogidele diagnoosimaks nakatunud loomi ja inimesi. Viiruste identifitseerimiseks on oluline ka tsütopaatilise efekti ilmnemise tase. Kui see ilmneb koekultuuris 4–5 päeva pärast nakatumist madalama infektsiooniliste partiklite arvuga (MOI), siis võib öelda, et viirus replitseerub aeglaselt. Kui aga samadel tingimustel ilmneb 1–2 päevaga, siis loetakse sellist viirust kiiresti replitseeruvaks. Siiski tuleb arvestada, et kultuure inokuleeritaks madalama MOI-ga, sest kõrge MOI puhul ilmnevad kõik tsütopaatilised efektid kiiresti.

Esimene märk viiruslikust infektsioonist on rakkude ümardumine. Tihti ilmnevad pärast seda peremeesraku tuumas ja/või tsütoplasmas inklusioonkehakesed. Neid saab tuvastada valgusmikroskoopiaga patsiendi verest või spetsiifiliselt värvitud nakatunud koetüki lõigust. Siiski selleks, et näha tsütopaatilise efekti kõiki omadusi, on vaja kasutada elektronmikroskoopi. Inklusioonkehakesed võivad olla viiruse replikatsiooni kõrvalsaaduste kogumid või peremeesraku moondatud struktuurid. Mõned viirused põhjustavad ka sünsüütsiumite moodustumist. Need on suured tsütoplasmaatilised massid, mis koosnevad hulktuumsetest rakkudest. Need on tavaliselt põhjustatud nakatunud rakkude integratsioonist. Selle mehhanismi kaudu saab viirus liikuda nakatunud rakust nakatumata rakkudesse.

Kuna peremeesrakkudes tekkivad tsütopaatilised efektid on viirusspetsiifilised, saavad uurijad kasutada neid eksperimentides erinevuste väljatoomiseks. Paljud viirused annavad erineva vastuse, kasutades teist peremeesraku liini. Samuti saab tsütopaatilist efekti kasutada ka laboris paljundatavate rakuliinide puhtuse kontrollimiseks.

Telomeraas

Telomeraas on ribonukleoproteiinist ensüüm, mis lisab telomeerse järjestuse TTAGGG eukarüootsete kromosoomide DNA 3'-otstesse.

TERT struktuur

Telomeer (kreeka keeles τέλος telos 'lõpp' + μέρος merοs 'osa') on DNA ahela piirkond, mis asub kromosoomi otstes. Telomeeri ülesandeks on kaitsta kromosoomi otsi kahjustuse eest.

Ajalugu

Telomeraas avastasid Carol W. Greider ja Elizabeth Blackburn aastal 1984 ripsloomas Tetrahymena. Oma avastuse eest said Elizabeth Blackburn, Carol W. Greider ja Jack W. Szostak aastal 2009 Nobeli füsioloogia-meditsiiniauhinna.

Aastal 1981 alustas Blackburn, kes oli selleks ajaks juba iseseisev uurija, koostööd Jack Szostakiga, et demonstreerida, kuidas on võimalik üle kanda telomeeride funktsiooni ühelt organismilt teisele. Uurimuses kasutasid nad Tetrahymena't ja Saccharomyces cerevisiae'd. See uurimus näitas, et osa telomeeride funktsiooni on võimalik üle kanda. Aastal 1985 identifitseerisid Blackburn ja Carol Greider ensümaatilise aktiivsuse, mis võimaldas telomeeride järjestust pikendada. Nimelt kuulus see aktiivsus ribonukleoproteiinile ja nad nimetasid selle telomeraasiks. RNA osa oli komplementaarne telomeeride kordusjärjestusele.

Vaatamata telomeraasi ilmselgele tähtsusele ilmus vaid paar artiklit enne aastat 1995. Põhiliselt tänu inimrakkude telomeraasi väga madalale aktiivsusele. Aastal 1994 töötasid Shay, Wright ja kaastöölised välja lihtsa PCR meetodi (TRAP), mis tugevasti suurendas telomeraasi aktiivsuse leidmist.

Inimese telomeraasi struktuur

Telomeraas koosneb suurest RNA alamühikust (hTR) ja valgulisest katalüütilisest alamühikust hTERT. See, kas telomeraas funktsioneerib monomeeri või dimeerina, pole veel kindlaks tehtud ning pakub palju alust aruteluks. On näidatud, et telomeraas töötab alamühikutega ning seob endale kaks telomeerset DNA substraati. Katalüütiline aktiivsus on võimalik vaid siis kui mõlemad TERT aktiivsaidid on funktsionaalsed. See näitaks teooria järgi, et tegemist on dimeerse funktsionaalsusega.

Alamühik hTR sünteesitakse geenist nimega TERC, seevastu hTERT aga geenist nimega TERT. Komponent hTR võimaldab koostada nukleotiidset järjestust, mida telomeraas lisab kromosoomide otstesse. hTERT komponent lisab seejärel need osad vajalikku kohta.

Funktsioon

Igal rakujagunemisel tuleb igat kromosoomi replikeerida. Iga väike replikatsiooni viga kromosoomi struktuuris jääb püsima ning need vead kantakse edasi järgmistel jagunemistel, mille tõttu on DNA kaotamine üsnagi tõsine probleem. Kui DNA ahela lõpp jääb igal jagunemisel kopeerimata, on tagajärjeks telomeeride lühenemine. Telomeraasi aktiivsus hoiab ära DNA ahela lõpu mittekodeerimise rakutsükli käigus, lisades lõppu vastava järjestuse.

Telomeraas lisamas telomeeride lõppudele vastavat järjestust

Telomeraasi regulatsioon

Enamikus inimkoes on telomeraasi aktiivsus märkamatu. Mõned uuringud on näidanud, et mitogeense stimulatsiooniga inimese T-lümfotsüüdid aktiveerivad telomeraasi lühiajaliselt, et vähendada telomeeri kadu leviku ajal. Normaalses rakus on see siiski mööduv nähtus, kestes konstantse stimulatsiooniga vaid mõned päevad. Hetkel on täpne regulatsioon normaalses rakus,näiteks T-lümfotsüüdis, teadmata. Samuti on selgusetu, kuidas vähirakud regulatsiooni jäljendavad.

Telomeraas ja tüvirakud

Tüvirakkude funktsioon paistab muutuvat vanuse suurenemisel ja sellel võib olla seos telomeeride lühenemisega. Ka tüvirakkudes toimub telomeeride lühenemine vananedes, samas embrüonaalsetes tüvirakkudes seda ei toimu. See tuleneb kõrgest telomeraasi aktiivsusest embrüonaalsetes tüvirakkudes. Kõikides tüvirakkudes on küll telomeraasne aktiivsus, kuid see pole alati piisavalt kõrge, et säilitada telomeeride pikkus. Väga vähe on teada telomeraassest aktiivsusest proliferatiivsetes tüvirakkudes.

Seos meditsiiniga

Telomeraas ja vähk

Pärast telomeraasi avastamist hakati ensüümi uurima rohkem. Ka inimestel on telomeerid ja need koosnevad järjestusest TTAGGG. Aastal 1989 avastas Gregg Morin telomeraasi aktiivsuse inimrakkudes. Tema avastus oli väga oluline. Nimelt on inimestel palju vähem telomeere kui Tetrahymenal ja telomeraasi aktiivsus palju madalam. Morinil oli hüpotees, et surematul rakkude kultuuril on telomeraasi ekspressiivsus ning lõi meetodeid telomeraasi aktiivsuse eraldamiseks. Nagu Tetrahymeni telomeraas, oli ka inimese telomeraas ribonukleoproteiin. Ensüümi aktiivsust nähti palju ka munasarja kasvajarakkudes. Mitte aga isogeensetes healoomulistes rakkudes, rõhutades, et telomeraasi taasaktivatsioon võib olla seotud vähirakkude kasvamisega.

Telomeraasi inhibiitorid

Vähirakkude üheks omaduseks on lõpmatu jagunemine, mis on soetud telomeraasi taasaktiveerimisega. Kuna enamik vähirakke ekspresseerivad telomeraasi, et telomeeride pikkus ei segaks jagunemist, on kindel, et telomeraasi inhibiitorite uurimine on ülimalt vajalik edasiseks vähi uurimiseks ja ravi väljatöötamiseks.

Telomeraasipõhine teraapia

Kaugele arenenud vähiga inimeste ravi on hetkel kas kasvajate kirurgiline eemaldamine, keemiaravi, kiiritusravi või nende kolme kombinatsioon. Ideaalne vähiravi oleks otsene vähirakkude eemaldamine normaalseid rakke häirimata. Kuna praegu tundub, et normaalsetes rakkudes on telomeraasi aktiivsus madal või olematu ja vähirakkudes seevastu väga kõrge on paljude vähiuuringutega tegelevates laborites eesmärk leida ravi just selline, mis ründaks kõrge telomeraasi aktiivsusega rakke. Telomeraasne aktiivsus põhimõtteliselt puudub somaatilistest rakkudest, mistõttu pakuks telomeraasipõhine teraapia ideaalis väga suurt spetsiifilisust, väiksemat toksilisust ja vähem kõrvalnähte.

Immunoteraapia

Telomeraasi aktiivsuse farmakoloogiliste inhibiitorite otsimine on paljulubav lähenemine töötamaks välja telomeraasi baasil teraapiat vähi vastu. Vaatamata sellele on lootust andev ka immunoteraapia vähi vastu, kasutades telomeraasi pöördtranskriptaasi hTERT-i. Info nii inimeste kui ka teiste organismide rakkudest näitab, et tsütotoksilised T-lümfotsüüdid tunnevad ära TERT toodetud peptiide ning tapavad TERT-positiivse kasvajaraku.

Südamehaigused, diabeet ning elukvaliteet

Mitmed uuringud on näidanud, et krooniline stress on seotud telomeeride lühenemisega ja huvitaval kombel ka telomeraasi aktiivsuse nii vähenemise kui ka suurenemisega. Selle toimemehhanism pole seni teada, kuid on selgeks tehtud, et telomeerid muutuvad aja möödudes ning telomeraasi aktiivsus võib kõikuda.

Hiirtes on märgatud, et telomeraasi puudus võib tekitada diabeeti seoses insuliini tootvate rakkude kaoga.

Elizabeth H. Blackburn avastas veel, et emad, kes hoolitsevad väga haigete laste eest, omavad lühemaid telomeere. Emotsionaalse stressi tipus on telomeraas arterite koes aktiivne, põhjustades tõenäoliselt südamerabandust.

Haruldased haigused

On tõestatud, et mutatsioonid geenis TERT annavad võimaluse aplastilise aneemia välja kujunemiseks. Aplastiline aneemia on haigus, kus luuüdi lõpetab vererakkude tootmise.

Kassikisa sündroom (CdCS) on kompleksne haigus, mis tekib viienda kromosoomi lühikese õla kustumisel. Geen TERT asub kustunud alas ja vastava geeni ühe koopia kaotamine on haiguse põhjustamisel üks faktoreid.

Vesiilikul

Vesiikul on suhteliselt väike tavaliselt veega täidetud põieke raku tsütoplasmas. Vesiikulid on rakusisusest eraldatud rakumembraaniga. Vesiikulite ülesanne on ainete transport või säilitamine raku sees.

Fosfolipiidse kaksikkihiga ümbritsetud vesiikul vesilahuses

Vesiikulid osalevad raku elutegevuseks vajalike ainete, näiteks vitamiinide, lipiidide, kolesterooli, raua ja makromolekulide transpordis rakus. Vesiikul on üldjuhul ümbritsetud fosfolipiidse kaksikkihiga nii, et membraani südamikku on koondunud hüdrofoobsed rasvhappeahelad. Hüdrofiilsed pead paiknevad vesiikuli tsentri ja tsütosooli poolel.

Vesiikulid võivad moodustuda rakus loomulikult, näiteks endotsütoosi käigus, kuid neid saab tekitada laboris kunstlikult. Sel viisil loodud vesiikuleid kutsutakse liposoomideks ning neid kasutatakse mudelmembraanidena eksperimentaalseteks uuringuteks. ^[1] Vesiikulite membraani koostis on sama mis raku plasmamembraanil. Seetõttu saavad vesiikulid liituda nii raku plasmamembraani kui ka erinevate organellide membraanidega. Ekso- ja endotsütoosi puhul eraldatakse vastavad makromolekulid vesiikulisse ning nad ei segune teiste tsütoplasmas olevate molekulidega. Vesiikulid võivad kuuluda näiteks Golgi aparaadi koosseisu.

Vesiikuli funktsioon sõltub selle sisaldistest. Iga vesiikul on määratud ühinema ainult kindla membraaniga. Tulemuseks on makromolekulide suunatud liikumine raku sise- ja väliskeskkonna vahel. Sarnane protsess toimub ka transportvesiikulite vahendatud karedal endoplasmaatilisel retiikulumil ehk ER-il sünteesitud valkude liikumisel Golgi kompleksi. Valke sisaldav vesiikul eraldub ühest kompartmendist ja ühineb seejärel teise kompartmendi membraaniga. ^[2] Eukarüootses rakus toimub pidevalt vesiikulite eraldumine ühelt membraanilt ning liitumine mõne teise membraaniga. Vesiikulid kannavad seejuures kaasas membraanide struktuurses koostises olevaid komponente ja vees lahustuvaid molekule. Kogu selline membraansete komponentide vaheldumine kulgeb mööda kõrgelt organiseerunud ning kindla suunaga molekulaarseid radu, mis lubavad rakul modelleerida plasmamembraani.

Kogu selle protsessi juures ei tohi raku pindala ning ruumala muutuda. Seetõttu on ekso- ja endotsütoos tasakaalus: endotsütoosi teel membraani materjal sopistub, eksotsütoosi teel saab ta selle tagasi. Enamikul rakkudel tekivad kaetud vesiikulid juhuslikes kohtades, nii et membraani sopistumine toimub üle terve raku pinna. Raku ekso- ja endotsütoosi rajad on ruumiliselt lahutatud.

Vesiikulite tüübid

Iga vesiikul peab olema selektiivne – see peab haarama endasse õiged molekulid ja peab liituma õige sihtmembraaniga, näiteks ei tohi vesiikul, mis kannab aineid Golgi kompleksist plasmamembraanile, haarata kaasa aineid, mis peavad jääma Golgi kompleksi koostisse. Lisaks peab see vesiikul liituma ainult plasmamembraaniga ja mitte ühegi teise organelliga. Vastavalt ekso- ja endotsütoosile jaotatakse vesiikulid järgmiselt: transportvesiikulid ja sekretoorsed vesiikulid.

Transportvesiikulid

Transportvesiikulid osalevad ainete transportimises erinevate organellide vahel raku sees, näiteks transpordivad vesiikulid valke karedapinnaliselt ER-ilt Golgi kompleksi.

Sekretoorsed vesiikulid

Sekretoorsed vesiikulid osalevad ainete transpordis raku sisekeskkonnast väliskeskkonda. Need ained on valdavalt raku elutegevuse jääkproduktid, mida ei ole rakus enam vaja. Mõned eukarüootsed rakud on spetsialiseerunud eritama keemilisi aineid. Sel juhul kogutakse need aineid sekretoorsetesse vesiikulitessse, mida rakk eritab alles vastusena väliskeskkonna tugevale ärritusele. Näiteks kasutavad sekretoorseid vesiikuleid närvirakud, mis vastusena aksonist saadud signaalile vallandavad vesiikulite abil neurotransmittereid.

Vesiikulite moodustumine ja transport

Kaetud vesiikulite pungumine

Pinotsütoos skemaatiliselt

Enamik transportvesiikuleid moodustub plasmamembraani spetsiaalsest osast, mis on kaetud valkudega. Pinotsütootilised vesiikulid moodustuvad plasmamembraani piirkonnas, mida nimetatakse kaetud lohuks (coated-pit). See piirkond sopistub ja moodustub nn kaetud vesiikul (coated vesicle). Kaetud vesiikuli eluiga on lühike: sekundite jooksul pärast lähtemembraani küljest vabanemist kaob talt kate ja ta on valmis ühinema endosoomiga.

"Kattel" on kaks põhilist funktsiooni:

1. koondab spetsiaalsed valgud, mis aitavad vesiikulil membraanist eralduda;
2. vormib vesiikuli.

Kirjeldatud on kolme eri tüüpi vesiikulite "katteid", mis määravad liikumise raja organellide vahel:

Katte tüüp	Organell
Klatriin	plasmamembraan -> Golgi kompleks
COPI	Golgi kompleks -> ER
COPII	ER -> Golgi kompleks

Klatriin on proteiin, mis koosneb kolmest pikast ja kolmest lühikesest polüpeptiidahelast. Need ahelad moodustavad omakorda triskeletid, mis assambleeruvad heksagonaalsete võredena ümber vesiikuli. Vesiikulite moodustumisel mängivad tähtsat rolli retseptormolekulid, mis paiknevad klatriinkatte ja lipiidse membraani vahel. Retseptorid seovad klatriini membraani külge ja püüavad kinni transmembraansed valgud. Viimaste hulka kuuluvad ka spetsiifilised retseptormolekulid, millega ümbritsevas keskkonnas olev molekul kõigepealt seostub. Näiteks trans-Golgi membraanis paiknev mannoos-6-fosfaadi retseptor tunneb ära lüsosomaalsed ensüümid, mis pakitakse eraldi vesiikulisse ja saadetakse endosoomi. Cis-Golgis tunneb retseptor ära valgud, mis kannavad KDEL järjestust ning need saadetakse tagasi ER-i. Ajal, mil vesiikul kasvab, moodustavad valgud (näiteks dünamiin) ümber vesiikuli kaela (osa, mis on ühenduses lähtemembraaniga) rõnga, mis eemaldab vesiikuli membraani küljest. Dünamiin seostub teiste valkudega, mis moonutavad koos lipiide modifitseerivate ensüümidega plasmamembraani. Hetkel, mil vesiikul eemaldub lähtemembraanist, laguneb ka klatriinkest.

Vesiikuli liitumine sihtmembraaniga

Tsütoplasmas liigub korraga väga palju vesiikuleid. Seega püsib oht, et mõni neist võib liituda vale membraaniga enne, kui ta leiab õige. Kõik vesiikulid peavad olema spetsiifilised, et nad tunneksid ära õige membraani, millega liituda. See on tagatud vesiikuli pinnal olevate markeritega, mis tuvastavad neid vastavalt päritolule ja koostisele. Need markerid seonduvad konkreetsete retseptoritega sihtmembraanis.

Kogu see protsess sõltub kahest valgutüübist:

1. Rab-valkudest – vahendavad vesiikuli sihtmembraaniga ühinemist
2. SNARE-valkudest – vahendavad vesiikuli liitumist sihtmembraaniga ja transporditava aine vabastamist

Rab-valkude perekonda kuulub enam kui 60 liiget. Iga Rab-valk seondub ühe või enama organelli membraaniga ja igal organellil on tsütosoolipoolses alas vähemalt üks Rab-valk. Rab-valgud on GTP-st sõltuvad. GDPga seondunult on Rab-valgud inaktiivsed ja seostunud mõne teise valguga, mis hoiab Rab-valku tsütosoolis lahustatult. GTPga seondunult on Rab aga aktiivne ning tihedalt seondunud organelli või vesiikuli membraaniga. Aktiivses olekus Rab-valk seostub Rab-efektoriga, mis vahendab vesiikuli transporti, membraanide ühendumist ja liitumist. Üks Rab-valk võib seonduda mitme erineva efektoriga.

Iga Rab-valk seondub konkreetse organelliga

Rab-valk	Organell
Rab1	ER ja Golgi kompleks
Rab2	cis-Golgi kompleks
Rab3A	sünaptilised vesiikulid
Rab4/Rab11	endosoomid
Rab5A	plasmamembraan, klatriiniga kaetud vesiikulid
Rab5C	varajased endosoomid
Rab6	trans-Golgi tsiternid
Rab7	hilised endosoomid
Rab8	varajased endosoomid
Rab9	hilised endosoomid, trans-Golgi võrgustik

SNARE-valgud katalüüsivad vesiikuli liitumist membraaniga vesikulaarsel transpordil. Nad aitavad kaasa vesiikuli spetsiifilisusele, sest hoolitsevad selle eest, et konkreetne vesiikul liituks õige membraaniga. SNARE perekonda kuulub loomadel teadaolevalt vähemalt 35 liiki valke, millest igaüks seondub spetsiifilise organelliga. Transmembraansed SNARE-valgud on komplementaarsed – vSNAREd vesiikuli ja t-SNAREd organelli membraanis. vSNARE on üheahelaline polüpeptiid ja t-SNARE koosneb kahest või kolmest valgust. Nende kahe SNARE ühinemisel toimub peptiidahelate omavaheline keerdumine nii, et moodustub stabiilne neljaheeliksiline põimik. Membraanide liitumine ei toimu alati kohe pärast seda, kui vSNARE ja t-SNARE ühinevad, näiteks reguleeritud eksotsütoosi puhul käivitab liitumise spetsiifiline rakuväline signaal.

Fosfolipiidse kaksikkihi liitumine toimub mitmes etapis.

1. Tekib tugev paardumine vSNARE ja t-SNARE vahel, mis tõmbab membraanid lähestikku ning surub nende vahelt välja vee molekulid.
2. Vesiikuli ja organelli membraanide esimene lipiidide kiht valgub omavahel kokku. Moodustub membraane ühendav sild.
3. Lipiidse membraani teised kihid ühinevad omavahel. Vesiikuli ja organelli membraanid ühinevad.

Rab-valk reguleerib t-SNARE kättesaadavust. t-SNARE-valgud on sihtmembraanis tihtipeale seondunud inhibiitoritega, mis peavad t-SNARE funktsioneerimiseks vabanema. Rab-valgud ja efektorid vahendavad selliste SNARE inhibiitorite vabanemist. Selleks, et vesiikul saaks ühineda mõne teise membraaniga, on vaja õigeid SNARE ja Rab-valke.

Vesikulaarne transport

Vesiikulite vahendatud ainete transport on kõrgelt organiseerunud ja kindla suunaga. Primaarne sekretoorne rada kulgeb ER-ist Golgi kompleksini ning seejärel raku pinnale, samas kui sekundaarne rada viib aga lüsosoomideni. Endotsüütiline rada kulgeb aga plasmamembraani pinnalt raku sisse. Mõlemal juhul on vesikulaarne transport tasakaalustatud vastassuunalise transpordiga, mis aitab tuua vesiikuli membraani ja selle koostises olevaid valke tagasi lähteorganelli membraani.

Vesikulaartranspordil võib eristada kolme põhilist suunda:

1. Konstitutiivne sekretoorne suund – valk, mis satub ER-i (membraani või valendikku), liigub läbi Golgi kompleksi ning jõuab raku välispinnale. Arvatakse, et see toimub ilma spetsiaalse signaalita. Kõik valgud, mis ER-i satuvad ja millel pole küljes signaaljärjestusi, mis neid mingis kompartmendis kinni hoiaksid, saadetakse automaatselt raku välismembraanile või rakust välja.
2. Lüsosomaalne suund – lüsosoomi sattumiseks peavad vastavad valgud saama spetsiaalselt märgistatud. Mannoos-6-fosfaat on lüsosomaalsete ensüümide marker. Seda markerit kandvad valgud kallutatakse kõrvale sekretoorselt suunalt ja saadetakse läbi endosoomi lüsosoomi.
3. Reguleeritud sekretoorne suund – on olemas spetsialiseeritud rakkudes, kus esineb nn kontrollitud eksotsütoos. Vastavatel valkudel peavad olema analoogsed signaaljärjestused mannoos-6-fosfaadiga, mis määrab ära nende saatmise trans-Golgi kompleksi sekretoorsetesse vesiikulitesse.

Kõik ER-i membraani või selle valendikku sattunud valgud lõpetavad oma teekonna vastavalt kas raku välismembraanis või rakku ümbritsevas keskkonnas, juhul kui puuduvad signaaljärjestused, mis sunniksid valku kuskil peatuma või sellelt teelt kõrvale kalduma. Valkude sisenemist ER-i ja liikumist läbi Golgi kompleksi raku välispinnale transportvesiikulite abil nimetatakse klassikaliseks sekretoorseks rajaks.

ER-i ja Golgi kompleksi valendikud on topoloogiliselt ekvivalentsed raku väliskeskkonnaga. Nad on omavahel pidevas ühenduses transportvesiikulite abil, mis punguvad ühest kompartmendist ja ühinevad järgmisega. Vesiikulite liikumine on täpselt organiseeritud, see toimub ER-ilt Golgi kompleksi suunas ja sealt raku välispinnale.

Vaatamata sellele, et sekretoorse raja organellidest käib läbi pidev membraanikomponentide vool, peavad nad säilitama oma identsuse.

Parenhüümne rakk

Parenhüümne rakk ehk isodiameetriline rakk on taimerakk, mis on igas mõõtmes enam-vähem võrdse läbimõõduga.

Prosenhüümne rakk

Prosenhüümne rakk on taimerakk, millel on väga piklik kuju.

Prosenhüümse raku pikkus võib küündida 25 sentimeetrini (lumivalge bömeeria).

Epiteelkude

Epiteelkude ehk epiteel (inglise keeles epithelial tissue, kreeka keeles thēlē 'nisa') on loomorganismi välispinda kattev ja sisepinda vooderdav või näärmeid moodustav kude.  Epiteelkoed ehk epiteelid katavad nahka, limaskesti, teiste kudede vabu pindasid ja koosnevad ainult rakkudest, (rakuvaheaine praktiliselt puudub ning pole veresooni). Epiteelkoed on üks neljast loomakudede põhitüübist.

Epiteelid: ripseepiteel, näärmepiteel, transitoorne ehk üleminekuepiteel (kuseteedes esinev epiteel, mille kuju muutub) jpt. 

Epiteelkude jagatakse funktsiooni alusel:

• katteepiteeliks- epiteelirakud katavad keha välispinda, moodustades naha pindmise kihi e epidermise, lisaks hingamiselundite epiteel, sooleepiteel jpt.
• näärmeepiteeliks- ehk sekretoorsed epiteelirakud on loomorganismi kõikides näärmetes.

Katteepiteeli rakud

Katteepiteeli rakkude kuju järgi eristatakse: 

• lameepiteele
• kuupepiteele
• silinderepiteele jpt.

Epiteelkoe uuenemine

Epiteelkoe uuenemine naha epidermises toimub üsna kiiresti, seda saab jälgida näiteks haavade paranemise kaudu (keskmiselt 4 -10 päeva).

Endotsütoos

Endotsütoos on väliskeskkonnast transportvesiikulite abil makromolekulaarsete komponentide omastamine. Makromolekulid seonduvad membraani või retseptoriga ja see põhjustab plasmamembraanist koosneva vesiikuli moodustumise ehk endosoomi, mis tagab transporditavate ainete jõudmise rakku. Makromolekulaarsed ained ei läbi passiivselt hüdrofoobset plasmamembraani ning peavad seetõttu kasutama endotsütoosi. Mõiste võttis kasutusele 1963. aastal Christian de Duve. Endotsütoosile vastupidine protsess on eksotsütoos.

Endotsütoosi tüübid

Fagotsütoos

Fagotsütoos esineb rakkudes, mis on spetsialiseerunud suuremate partiklite ja mikroorganismide fagotsüteerimisele ehk kahjutuks tegemisele. Imetajates on nendeks ühisest eellasest arenenud makrofaagid ehk suur-õgirakud ning neutrofiilid ehk vere valgelibled, mis suuri võõrkehi "alla neelates" moodustavad fagosoomi. Fagosoomiga interakteerudes moodustab lüsosoom fagolüsosoomi. Paljudele ainuraksetele loomadele on fagotsütoos ainus toitumisviis.

Pinotsütoos

Pinotsütoos on lahustunud makromolekulide sissevõtmine väikeste vesiikulite abil. Pinotsütoos jaguneb kolmeks alatüübiks:

1. Retseptorseoseline selektiivne endotsütoos. Kõigepealt seondub makromolekul rakumembraanis paikneva retseptoriga ning seejärel retseptor-ligandi kompleks assimileeritakse endotsütoosi teel ning moodustub transportvesiikul. Sellel on kaks mehhanismi:
   1. Klatriinisõltuv endotsütoos. Selle mehhanismi puhul on retseptorid kogunenud plasmamembraani teatud piirkonda, mida nimetatakse kaetud lohuks (coated-pit). Kaetud vesiikuli (coated vesicle) moodustumisel osaleb valk dünamiin. Vesiikul kaetakse klatriiniga, et toimuks suunatud liikumine Golgi kompleksi ja endosoomide vahel. Kui vesiikul on ühinenud endosoomiga, siis saadetakse klatriin raku välismembraani tagasi. Seda tüüpi endotsütoosi kasutavad kõik eukarüootsed rakud, et omastada vajalikke toitaineid ja signaalmolekule. Samuti eemaldatakse selle mehhanismi abil väliskeskkonnast potentsiaalselt kahjulikke ühendeid. Näiteks sisenevad rakkudesse madala tihedusega lipoproteiinid (LDL), mis sisaldavad kolesterooli, transferriini jt. ühendeid. LDL retseptori puudumine põhjustab hüperlipideemiat, mis põhjustab kolesterooli kuhjumist organismis ning ateroskleroosi.
   2. Kaveoliinisõltuv endotsütoos. Kaveoliinid on valgud, mis vastutavad, et kaveoolide pealt toimuks seostumine kolesterooliga. Kaveoolid on suhteliselt stabiilsed 50–80 nm laiused raku membraani sissesopistused, mis on retseptoriteks spetsiifilistele molekulidele, näiteks kõrge tihedusega lipoproteiinidele (HDL). Imetajates ekspresseeritakse 3 erinevat kaveoliinivalku.
2. Kaveoliinist ja klatriinist sõltumatute vesiikulite teke. Järgmised endotsütoosi mehhanismid on kõige vähem kirjeldatud ning nende toimumise mehhanismid on veel paljuski ebaselged:
   1. CLIC/GEEC tüüpi endotsütoos. Kasutatakse CLIC (clathrin-independent carrier) ehk klatriinisõltumatu kandjate ja GEEC (GPI-anchored protein-enriched early endocytic compartment) ehk GPI-ankurdatud valgurikaste varajaste endotsütootiliste kompartmentide osa omavahelist koostööd. Seda tüüpi endotsütoosi vahendab GRAF-1 valk, mille abil sisenevad rakku bakteriaalsed eksotoksiinid, GPI-ga ankurdatud valgud ja muud ühendid.
   2. Flotilliinisõltuv endotsütoos. Flotilliinid moodustavad lipiidsete parvede sarnaseid piirkondi, sest nad asuvad kolesteroolirikastes regioonides. Sellist mehhanismi kasutati ka kaveoliinisõltuva endotsütoosi puhul.
3. Makropinotsütoos. Põhjustab struktuurseid muutusi raku membraanis, mille tagajärjel moodustuvad väljasopistused, mis on võimelised haarama lahustunud aineid. Lahustunud makromolekulid sisenevad rakku umbes 0,5–5 μm laiusega vesiikulite ehk makropinosoomide abil. Makropinotsütoos on mittespetsiifiline endotsütoos, mille puhul ligandi seondumine retseptorile pole vajalik.

Pildil on põhilised endotsütoosi komponendid ja mehhanismid

Endotsütoosi ja lüsosoomi ühendus

Lüsosoom on membraaniga ümbritsetud hüdrolüütilisi reaktsioone teostav organell ning katalüüsimisele kuuluv aine saadakse endotsütoosi teel moodustunud vesiikulitest. Kõigepealt toimub väliskeskkonnast endotsütoosi teel vesiikuli moodustumine, mis ühineb varajase endosoomiga. Seal eemaldatakse spetsiifilised retseptorid, mis transporditakse tagasi plasmamembraani koostisse. Varajased endosoomid muutuvad aja möödudes hilisteks endosoomideks, kuhu transporditakse trans-Golgi kompleksist ka happelisi hüdrolüüse. Viimati nimetatud transpordiks on vajalik mannoos-6-fosfaat retseptor, mis eemaldub hilises endosoomis ning liigub hiljem tagasi Golgi kompleksi. Hilised endosoomid muutuvad lüsosoomideks, kus algab ainete degradeerimine ehk lahustumine. Endosoomide küpsemisel mängib rolli pH langus ehk hapestumine, mida reguleerivad ATP-sõltuvad prootonpumbad ja ioonkanalid. Varajastes endosoomides on pH umbes 6,2 ning hilistes endosoomides on pH umbes 5,5.

Eksotsütoos

Eksotsütoos on transportvesiikulite abil sisekeskkonnast makromolekulaarsete komponentide omastamine ning nende ühinemine raku välismembraaniga.

Eksotsütoosi rajad

1. Pidev ehk konstitutiivne tee. Transpordivesiikulid kannavad pidevalt membraanikomponente Golgi kompleksist välismembraani, kus toimub mittevajalike valkude eksotsüteerimine rakust välja. Eksotsütoosi teel toimub pidev plasmamembraani uuenemine.
2. Reguleeritud tee. Vajalikud on signaaljärjestused, mis määravad valkude jõudmise trans-Golgist sekretoorsetesse vesiikulitesse. Sekreteeritavad ained kogutakse sekretoorsetesse vesiikulitesse ning need ühinevad välismembraaniga pärast keskkonnast tulevat signaali, milleks võib olla hormoon või neurotransmitter. Signaali äratundmise tagajärjel tõuseb kaltsiumioonide kontsentratsioon ning seejärel aktiveerub reguleeritud eksotsütoos. Selline rada esineb neis rakkudes, mis on spetsialiseerunud oma toodangu kiirele eritamisele.

Mõned näited reguleeritud endotsütoosist:

• Rakkudevahelise suhtluse tagab eksotsütoos, mis on oluline immuunsüsteemis olevatele T-rakkudele. T-rakud ehk tappurrakud on võimelised identifitseerima organismile võõraid objekte, näiteks viirusi. T-rakud eritavad tsütokiine, mis aktiveerivad omakorda teisi tappurrakke ning takistavad rakus viiruste paljunemist raku apoptoosiga ehk raku programmeeritud surmaga. T-rakud liiguvad nakatunud rakule väga lähedale ning signaali toimel vabaneb T-rakkudest perforiinproteiin, mis kaltsiumioonide toimel kinnitub sihtraku plasmamembraanile. Selle tulemusena läheb rakk apoptoosi.
• Neuron ehk närvirakk on kohastunud närviimpulsside edasikandmiseks. Teiste rakkudega on ta ühenduses signaalainete kaudu. Neuroni aksoni terminaalis olevatest sünaptilistest vesiikulitest sekreteeritakse neurotransmittereid, mis kannavad närviimpulsi edasi postsünaptilisele rakule.

Endotsütoosi ja eksotsütoosi tasakaal

Raku ruumala ja pindala on konstantsed ehk püsivad, seega endotsütoosi ja eksotsütoosi omavaheline tasakaal peab olema stabiilne, et tagada võimalikult püsiv rakusisene keskkond. Iga vesiikul on määratud ühinema ainult kindla membraaniga. Tulemuseks on makromolekulide suunatud liikumine raku sise- ja väliskeskkonna vahel. Transportvesiikulite teket katalüüsivad spetsiifilised kattevalgud. Katetena kasutatakse sihtkoha-spetsiifilisi valke:

• Klatriin. Klatriiniga kaetud vesiikulid liiguvad plasmamembraani ja endosoomide vahel, samuti trans-Golgi retiikulumi ja endosoomide vahel. See mehhanism ei vaja ATP-d.
• COP valgud. Nende moodustatud katte tekkeks on vaja lisaenergiat, mis saadakse ATP hüdrolüüsi käigus. Sõltuvalt sihtmembraanist jaotatakse COP valgud järgnevalt kaheks:
  • COP I – transpordib vesiikuleid cis-Golgi kompleksist endoplasmaatilisse retiikulumi.
  • COP II – transpordib vesiikuleid endoplasmaatilisest retiikulumist cis-Golgi kompleksi.

Et transportvesiikulid tunneksid ära õige sihtmembraani, osalevad protsessis SNARE-valgud. SNARE-valgud on transmembraansed valgud, mis jagunevad vastavalt kaheks, kas valk asub vesiikulil (vSNARE) või sihtmembraanil (tSNARE). Vesiikuli ühinemine sihtmembraaniga ei toimu iseeneslikult, vajalikud on Rab perekonna GTP siduvad valgud.